DB23T-黑土耕地微生物肥力指標(biāo)體系及評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范

ICS65.020.20CCSB05FORMTEXTDBFORMTEXT23DB23/TXXXX—XXXXFORMTEXT（征求意見稿）FORMTEXT主要起草單位：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與環(huán)境資源研究所哈爾濱芮煊科技有限公司聯(lián)系人：王爽聯(lián)系電話系信箱：wangshuang0726@163.comXXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施黑龍江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB23/TXXXX—XXXXI前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由黑龍江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件起草單位：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與環(huán)境資源研究所和哈爾濱芮煊科技有限公司。本文件主要起草人：王爽、趙文博、孫磊、金品嬌、劉凱、李偉群、陳雪麗、萬書明、郝小雨。黑土耕地微生物肥力指標(biāo)體系及評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范1范圍本文件規(guī)定了土壤生物肥力、土壤微生物肥力及其指標(biāo)的術(shù)語和定義，黑土耕地微生物肥力評(píng)價(jià)的土壤樣品采集與預(yù)處理、評(píng)價(jià)指標(biāo)及測定方法、評(píng)價(jià)規(guī)范。本文件適用于黑土耕地土壤微生物肥力的評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB20287-2006農(nóng)用微生物菌劑NY/T52-1987土壤水分測定方法NY/T1121.1-2006土壤檢測第1部分:土壤樣品的采集、處理和貯存NY/T1121.6-2006土壤檢測第6部分:土壤有機(jī)質(zhì)的測定3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1土壤生物肥力土壤生物肥力是指生活在土壤中的微生物、動(dòng)物、植物根系等有機(jī)體為植物生長發(fā)育所需營養(yǎng)的貢獻(xiàn)。同時(shí)，生物過程對(duì)土壤的物理、化學(xué)特性起到良好的促進(jìn)和維持作用。3.2土壤微生物肥力是指生活在土壤中的微生物提供了植物根系獲得足夠營養(yǎng)的能力，同時(shí)，微生物的活動(dòng)與代謝能夠?qū)ν寥赖奈锢砗突瘜W(xué)狀態(tài)產(chǎn)生積極作用。3.3土壤微生物肥力指標(biāo)表征土壤生物肥力水平的土壤微生物群體及微生物生理生態(tài)特征的定量指標(biāo)，包括土壤微生物數(shù)量、微生物生物量、土壤酶活性、微生物活性等指標(biāo)。3.4微生物商微生物商是土壤微生物量碳占土壤有機(jī)碳含量的百分比。4黑土耕地土壤樣品的采集與預(yù)處理4.1采樣單元確定根據(jù)所評(píng)價(jià)耕地受自然因素及人為因素對(duì)土壤微生態(tài)系統(tǒng)影響的需要，按地形特點(diǎn)、成土母質(zhì)、土地利用方式、覆被變化、氣候條件、耕作以及施肥方式等分為若干個(gè)采樣單元。4.2采樣時(shí)間土壤樣品采集時(shí)間為當(dāng)季作物收獲后、下茬作物種植前。4.2主要用具鐵鍬、小鏟、GPS定位儀，數(shù)碼相機(jī)（配電池及充電器）、自封袋、塑料袋、布袋、標(biāo)簽紙、鉛筆、記號(hào)筆、采樣記錄本、75%酒精、濾紙或吸水紙、乳膠手套。4.3采樣方法同一采樣單元內(nèi)按照“隨機(jī)”、“等量”和“多點(diǎn)混合”原則。用GPS定位儀確定采樣地點(diǎn)的地理位置（經(jīng)緯度），每個(gè)樣地按照“五點(diǎn)梅花式”采集。采集深度為0-20cm土層，挖掘時(shí)去掉地表大塊沙石和其他雜物，用酒精消毒過的干凈鐵鍬或小鏟沿土壤剖面向下挖，取土樣300g～500g。五點(diǎn)混合后為一個(gè)樣地的代表樣品，放入標(biāo)簽，寫清采樣編號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室處理。每個(gè)采樣單元不少于10個(gè)樣地，采樣方法應(yīng)按照NY/Y1121.1中規(guī)定進(jìn)行。4.4土壤樣品制備與保存將土樣及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室后除去土壤中可見的動(dòng)植物殘?bào)w后過2mm篩后混勻，一部分混勻保藏于4℃用于可培養(yǎng)微生物數(shù)量、酶活性、微生物量碳和氮的測定；一部分凍存于-20℃或者-80℃用于微生物多樣性和絕對(duì)數(shù)量的測定；其余部分風(fēng)干后過1mm篩，于干燥處保存，用于測定土壤理化性質(zhì)。4.5土壤含水量測定按照NY/T52-1987規(guī)定的方法測定土壤含水量。4.6土壤有機(jī)碳測定按照NY/T1121.6-2006土壤檢測第6部分進(jìn)行。5土壤微生物肥力指標(biāo)選擇與測定5.1土壤微生物肥力指標(biāo)土壤微生物肥力評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇按表1執(zhí)行。表1黑土耕地土壤微生物肥力評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇、分類與測定方法土壤微生物肥力評(píng)價(jià)指標(biāo)類別指標(biāo)名稱評(píng)價(jià)指標(biāo)土壤微生物指標(biāo)微生物數(shù)量指標(biāo)可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量、放線菌、真菌數(shù)量微生物生物量指標(biāo)微生物生物量碳、氮微生物活性指標(biāo)微生物商土壤酶活性指標(biāo)纖維素酶、蔗糖酶、脲酶、堿性磷酸酶、過氧化氫酶5.2可培養(yǎng)微生物數(shù)量測定土壤可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量采用平板計(jì)數(shù)法，按照GB20287-2006中6.3.2的規(guī)定進(jìn)行，所用培養(yǎng)基及其配制方法分別按照GB20287-2006中附錄A.1A.6和A.7的規(guī)定。5.2微生物生物量測定微生物生物量碳（Cmic）、微生物生物量氮（Nmic）采用氯仿熏蒸-K2SO4提取-自動(dòng)分析法測定。取保存的新鮮土壤，分別在氯仿熏蒸前后用K2SO4溶液浸提土壤，提取液中的有機(jī)碳采用總有機(jī)碳分析儀測定；提取液中的氮采用半微量開氏定氮法測定。微生物量碳、氮的換算系數(shù)均為0.45。具體方法見附錄A。5.3土壤酶活性測定5.3.1纖維素酶活性纖維素酶活性測定以羧甲基纖維素鈉為底物，采用3,5-二硝基水楊酸比色法，具體方法按照GB20287-2006中附錄D的規(guī)定。5.3.2蔗糖酶活性蔗糖酶酶活性測定以蔗糖為底物，采用3,5-二硝基水楊酸比色法，具體方法見附錄B1。5.3.3堿性磷酸酶活性堿性磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法，具體方法見附錄B2。5.3.4脲酶活性脲酶活性以尿素為底物，采取苯酚?次氯酸鈉比色法測定，具體方法見附錄B3。5.3.5過氧化氫酶活性過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法測定，具體方法見附錄B4。5.4微生物商微生物商計(jì)算公式如下：微生物商（%）=微生物量碳/有機(jī)碳×100%6黑土耕地微生物肥力評(píng)價(jià)方法6.1土壤微生物肥力指數(shù)模型n采用主成分分析法確定單向評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重值Ki。根據(jù)作用效應(yīng)曲線，建立隸屬度函數(shù)，計(jì)算各肥力指標(biāo)的隸屬度值Ci。利用模糊數(shù)學(xué)中加權(quán)和法建立土壤微生物肥力指數(shù)模型，將所選的單個(gè)指標(biāo)（單因素）的評(píng)價(jià)結(jié)果轉(zhuǎn)換為由各評(píng)價(jià)因子構(gòu)成的土壤微生物肥力綜合評(píng)價(jià)。壤微生物肥力指數(shù)模型如公式（1）：n((ki)ⅹci...…………（1）∑i=1BIFi=1式中：BIF——土壤微生物肥力指數(shù)；Ci——各個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的隸屬度值；Ki——第i個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重；n——評(píng)價(jià)指標(biāo)的個(gè)數(shù)。6.2單因素評(píng)價(jià)模型的選擇1x………………（2）x0x≥x0x<x0｛土壤可培養(yǎng)微生物1x………………（2）x0x≥x0x<x0｛f(x)=6.3各指標(biāo)的權(quán)重將各參評(píng)因子進(jìn)行主成分分析，采用因子旋轉(zhuǎn)分析各主成分所代表的肥力因素，第一主成分為微生物生物量氮、脲酶，第二主成分為蔗糖酶、過氧化氫酶，第三主成分為微生物生物量碳、微生物生物量碳氮比，第四主成分為堿性磷酸酶。通過因子載荷矩陣可求出各評(píng)價(jià)因子的公因子方差，由此計(jì)算各評(píng)價(jià)因子的權(quán)重值。6.4隸屬函數(shù)閾值上限的確定閾值根據(jù)康奈爾大學(xué)進(jìn)行健康評(píng)價(jià)時(shí)采用的累積頻率曲線進(jìn)行確定，以長期監(jiān)測所有指標(biāo)數(shù)據(jù)累積頻率為75%的指標(biāo)值作為隸屬函數(shù)的閾值上限。6.5土壤微生物肥力等級(jí)劃分根據(jù)6.4確定的閾值上限，利用公式（2）計(jì)算各個(gè)土壤樣品的隸屬度值。然后應(yīng)用公式（1）中所建立的土壤生物肥力指數(shù)模型，計(jì)算不同輪作施肥處理的BIF值。根據(jù)BIF值的大小，利用ArcGIS軟件中的Kriging插值，將土壤微生物肥力質(zhì)量由高到低劃分等級(jí)，其值在0-1之間，值越高，表征土壤微生物肥力越好。附錄A（規(guī)范性）氯仿熏蒸-K2SO4浸提法A1試劑處理：1.氯仿必須是除去乙醇的，乙醇除去方法是先加入約200l的氯仿至1L的分液漏斗中，然后用5%（v/v）K2SO4溶液20ml洗滌兩次，每次手搖動(dòng)2min～3min左右。之后在用蒸餾水洗滌2次-3次，然后加入5g左右的無水硫酸鎂或者無水氯化鈣干燥，最后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾。2.沸石處理：玻璃珠事先用丙酮洗凈，然后在105℃下烘干。使用清洗烘干后的玻璃珠，否則氯仿有可能不會(huì)沸騰。3.檢查真空干燥器的氣密性，事先使用真空泵抽取真空，待一天后輕微打開干燥器的開關(guān)，聽到是否有呲呲的聲音。若是氣密性不好，使用少些凡士林密封。A2操作步驟：1.鮮土樣過2mm篩子后，在40℃冷藏室貯藏。2.在熏蒸提取之前，測定土壤重量含水量，之后用蒸餾水調(diào)節(jié)土壤水分含量至統(tǒng)一（一般是調(diào)節(jié)到土壤的最大持水量或者調(diào)節(jié)至土壤樣品中含水量最高值），這是為了保證熏蒸效果一致。3.稱取15g新鮮土樣到50ml的小燒杯中（標(biāo)簽要用鉛筆記錄）。4.將氯仿，真空干燥器事先放入通風(fēng)櫥中（氯仿有毒），在真空干燥器底部放入平底100ml或者200ml燒杯，燒杯中加入用丙酮洗凈烘干的玻璃珠至小半杯即可，然后加入處理完畢的氯仿至2/3左右。5.使用瓷板將底部放有氯仿的燒杯與樣品隔開，放入土壤樣品后，蓋上真空干燥器的蓋子然后使用泵抽取真空，氯仿應(yīng)該是持續(xù)出現(xiàn)小氣泡即可。注意：防止氯仿爆沸，最好使用可以調(diào)節(jié)吸力的泵。使用泵抽取至少10min，后面幾分鐘不會(huì)小氣泡，為正常情況。最后在關(guān)上真空干燥器，然后放在室溫下熏蒸至少一天以上。簡單來說，土壤含有越高的土壤粘質(zhì)，熏蒸時(shí)間越長，最好在3-4天左右。6.熏蒸完成后，在通風(fēng)櫥中取出底部的氯仿燒杯，之后再將土壤放入真空干燥器內(nèi)，用泵抽取3次，每次30min，除去土壤中殘留的氯仿。7.熏蒸完全后的前一天，提取未熏蒸的土壤微生物量碳氮，浸提步驟如下面熏蒸浸提步驟。熏蒸的土壤盡可能全部的轉(zhuǎn)移到100ml的速率瓶中；或者50ml的離心管中。附錄B（規(guī)范性）土壤酶活性測定B1蔗糖酶3,5-二硝基水楊酸比色法。以24h后1g土壤中C6H12O6的mg數(shù)表示，mg/g，37℃。B2脲酶靛酚藍(lán)比色法。以24h后1g土壤中NH4-N的mg數(shù)表示，mg/g，37℃。B3堿性磷酸酶磷酸苯二鈉比色法。以24h后1g土壤中P2O5的μg數(shù)表示，μg/g，37℃。B4過氧化氫酶高錳酸鉀滴定法。以20min后1g土壤消耗0.1N高錳酸鉀的毫升數(shù)表示，ml/g，室溫。附錄C（規(guī)范性）C1土壤基礎(chǔ)呼吸和誘導(dǎo)呼吸采用堿液吸收滴定法測定，具體操作步驟如下：取廣口瓶8只，每瓶加入NaOH