H7亞型禽流感RT-PCR檢測方法的建立

序號：編碼：第九屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學生課外學術科技作品競賽作品申報書作品名稱：H7亞型禽流感RTPCR檢測方法的建立學校全稱：華南農(nóng)業(yè)大學申報者姓名（集體名稱）：徐珊、張停婷、陳梓棟類別：□自然科學類學術論文 □哲學社會科學類社會調(diào)查報告和學術論文□科技發(fā)明制作A類□科技發(fā)明制作B類報送方式：□省級報送作品□高校直送作品

說明1.申報者應在認真閱讀此說明各項內(nèi)容后按要求詳細填寫。2．申報者在填寫申報作品情況時只需根據(jù)個人項目或集體項目填寫A1或A2表，根據(jù)作品類別（自然科學類學術論文、哲學社會科學類社會調(diào)查報告和學術論文、科技發(fā)明制作）分別填寫B(tài)1、B2或B3表。所有申報者可根據(jù)情況填寫C表。3.表內(nèi)項目填寫時一律用鋼筆或打印，字跡要端正、清楚，此申報書可復制。4.序號、編碼由第九屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學生課外學術科技作品競賽組委會填寫。5．學術論文、社會調(diào)查報告及所附的有關材料必須是中文（若是外文，請附中文本），請以4號楷體打印在A4紙上，附于申報書后，字數(shù)在8000字左右（文章版面尺寸14.5×22cm）。6．作品申報書須按要求由各校競賽組織協(xié)調(diào)機構統(tǒng)一寄送。7.其他參賽事宜請向本校競賽組織協(xié)調(diào)機構咨詢。A1．申報者情況（個人項目）說明：1．必須由申報者本人按要求填寫，申報者情況欄內(nèi)必須填寫個人作品的第一作者（承擔申報作品60%以上的工作者）；2．本表中的學籍管理部門簽章視為對申報者情況的確認。姓名徐珊性別女出生年月1983年4月申報者情況學校全稱華南農(nóng)業(yè)大學專業(yè)動物醫(yī)學現(xiàn)學歷大學本科年級5年級學制5年入學時間2002年9月作品全稱H7亞型禽流感RTPCR檢測方法的建立畢業(yè)論文題目H7亞型禽流感RTPCR檢測方法的條件優(yōu)化通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院黨委辦公室郵政編碼510642單位電話82580233常住地通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學華山8棟203郵政編碼510642住宅電話31526275合作者情況姓名性別年齡學歷所在單位張停婷女24大學本科華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院陳梓棟男24大學本科華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院資格認定學校學籍管理部門意見是否為2006年7月1日前正式注冊在校的全日制非成人教育、非在職的各類高等院校中國學生（含?？粕⒈究粕脱芯可?。□是□否若是，其學號為：（部門蓋章）年月日院系負責人或?qū)熞庖姳咀髌肥欠駷檎n外學術科技或社會實踐活動成果□是□否負責人簽名：年月日

B1．申報作品情況（自然科學類學術論文）說明：1．必須由申報者本人填寫；2．本部分中的科研管理部門簽章視為對申報者所填內(nèi)容的確認；3．作品分類請按作品的學術方向或所涉及的主要學科領域填寫；4．碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱作品分類（D）A．機械與控制（包括機械、儀器儀表、自動化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技術（包括計算機、電信、通訊、電子等）C．數(shù)理（包括數(shù)學、物理、地球與空間科學等）D．生命科學（包括生物、農(nóng)學、藥學、醫(yī)學、健康、衛(wèi)生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化學、化工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫的目的和基本思路禽流感是嚴重危害畜牧業(yè)和人類健康的傳染性疾病。禽流感病毒有不同的亞型，其中由H5和H7亞型的毒株引起的疾病稱為高致病性禽流感。發(fā)病率和致死率都很高，危害巨大。本研究是參照GenBank中已發(fā)表的H7亞型禽流感病毒血凝素（HA）基因設計合成一對特異性引物。利用這對引物，通過對RTPCR反應體系和反應條件的優(yōu)化，建立針對H7亞型禽流感的RTPCR檢測方法作品的科學性、先進性及獨特之處傳統(tǒng)的禽流感檢測方法操作繁瑣，診斷時間長，重復性不好且存在散毒的危險。本研究利用PCR技術的特異性強，靈敏度高，快速簡便及重復性好的優(yōu)點，根據(jù)Genbank中注冊的禽流感HA基因序列，設計合成一對針對AIVH7亞型的特異性引物，并優(yōu)化RTPCR的反應條件和反應程序，建立敏感、特異、快速的AIVH7亞型RTPCR檢測方法。作品的實際應用價值和現(xiàn)實意義本研究所建立的AIVH7RTPCR檢測方法可對活禽、禽產(chǎn)品等進行直接檢測，比起雞胚病毒分離培養(yǎng)，大大縮短了診斷的時間，也可避免散毒的危險，對我國建立快速的進出口檢驗檢疫，禽流感的臨床早期診斷、流行病學調(diào)查及發(fā)病機制等具有十分重要的意義學術論文文摘參照GenBank中已發(fā)表的H7亞型禽流感病毒血凝素（HA）基因設計合成了一對預計擴增片段大小約為310bp的引物。利用這對引物，通過對RTPCR反應體系和反應條件的優(yōu)化，建立了針對H7亞型禽流感的RTPCR檢測方法。敏感性試驗和特異性試驗結(jié)果表明，該方法敏感性高，最低可檢出100pg的AIVH7的mRNA，且應用該引物對新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）及其它亞型的流感病毒（H1、H3、H5、H9）在相同反應條件下未擴增出任何片段具有較好的特異性。用所建立RTPCR方法檢測發(fā)病雞組織病料及咽、肛拭子，檢測結(jié)果與雞胚病毒分離結(jié)果相比陽性符合率高達90.6％作品在何時、何地、何種機構舉行的會議上或報刊上發(fā)表及所獲獎勵1．該成果已于2007年第1期的《養(yǎng)禽與禽病防治雜志》中發(fā)表。2．所建立的“H7亞型禽流感RTPCR診斷方法”正擬申報發(fā)明專利。鑒定結(jié)果該RTPCR的特異性試驗和敏感性試驗結(jié)果顯示：AIVH7亞型在大約300bp的位置上出現(xiàn)特異的擴增帶，而NDV、IBV、其他亞型流感和陰性尿囊液則無擴增帶出現(xiàn)，目的片段經(jīng)測序表明其序列為特異的為H7亞型AIVHA基因部分序列，說明本試驗所建立的RTPCR方法具有特異性高的優(yōu)點；并且該AIVH7特異性引物能檢測出的最低mRNA量約為100pg，靈敏度較高。請?zhí)峁τ诶斫?、審查、評價所申報作品具有參考價值的現(xiàn)有技術及技術文獻的檢索目錄目前，傳統(tǒng)的AIV檢測方法主要有病毒分離和血清學診斷，但其不足之處在于操作繁瑣、診斷時間長，結(jié)果重復性不好等。用雞胚分離培養(yǎng)的方法分離鑒定流感病毒存在著散毒的生物安全危險。[1]李知新，張志強等.禽流感診斷技術研究進展.動物醫(yī)學進展，2006，27：3135[2]鄧振旭.禽流感病毒的檢測方法.動物保健，2006，8：9[3]費東亮，杜紹范.禽流感檢測方法研究進展.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2005,8.申報材料清單（申報論文一篇，相關資料名稱及數(shù)量）《H7亞型禽流感RTPCR檢測方法的建立》[1]李知新，張志強等.禽流感診斷技術研究進展.動物醫(yī)學進展，2006，27：3135[2]鄧振旭.禽流感病毒的檢測方法.動物保健，2006，8：9[3]費東亮，杜紹范.禽流感檢測方法研究進展.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2005,8.[4]辛朝安.禽病學（第三版）.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社.2003,4751.[5]許峰.全球高致病性禽流感的發(fā)病歷史及流行特點.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2004,6:38.[6]陳化蘭，于康震.禽流感病毒A/Afri.Star/EngQ/983/79/(H7N1)血凝素基因的全序列分析.中國畜禽傳染病,1998，20（5）：258259.[7]M.Tollis,L.D.Trani,etal.RecentDevelopmentsinAvianInfluenzaResearch:EpidemiologyandImmunoprophylaxis.TheVeterinaryJournal,2002,164（30）：202215.[8]殷震,劉景華.動物病毒學.北京科學出版社.1985,622－630.[9]J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾.分子克隆實驗指南（第三版）.科學出版社.2002.[10]鄭曉飛.RNA實驗技術手冊.2004,2123.[11]費東亮，杜紹范.禽流感檢測方法研究進展.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2005,8.科研管理部門簽章年月日

C.當前國內(nèi)外同類課題研究水平概述說明：1.申報者可根據(jù)作品類別和情況填寫；2.填寫此欄有助于評審。禽流感是嚴重危害畜牧業(yè)和人類健康的傳染性疾病。禽流感病毒有不同的亞型，其中由H5和H7亞型的毒株引起的疾病稱為高致病性禽流感。發(fā)病率和致死率都很高，危害巨大。我國雖然還沒有H7亞型AI的疫情爆發(fā)，但臺灣、韓國等周邊地區(qū)及國家已有發(fā)生，我國因此也高度重視H7亞型AI的疫情及相應防控措施的儲備研究，該診斷方法的研究也是我國國家十五科技攻關立項支持項目的成果，目前，傳統(tǒng)的AIV檢測方法主要有病毒組織培養(yǎng)或雞胚接種分離病毒，然后用雞陽性血清做血凝抑制實驗來確定病毒的HA亞型，再進行生物學試驗測定毒力的大小，上述診斷程序至少需要十余天時間，且結(jié)果重復性不好等。對于高致病性禽流感或潛在的高致病性禽流感這樣的烈性傳染病（通常在短時間內(nèi)造成雞群全群覆沒）來說，若檢測時間太長，等檢測結(jié)果出來時，可能已經(jīng)造成了雞群的大量死亡或疫情的大范圍擴散。用雞胚分離培養(yǎng)的方法分離鑒定流感病毒還存在著散毒的生物安全危險。本作品所建立得AIVH7RTPCR檢測方法特異性強、敏感性高，用時短，本實驗從樣品處理到完成整個檢測過程大約需4－5h，比常規(guī)的病毒分離方法的時間短。因此，該檢測方法的建立對我國進出口禽肉及活禽的快速檢測、快速通關、防止禽流感病毒傳播將起到重要作用；對養(yǎng)禽場禽病的快速診斷，以便迅速采取相應的措施將起到積極的作用，對禽流感的流行病學調(diào)查及發(fā)病機制也有重要的作用，所以應用價值和前景相當可觀，有巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。D.推薦者情況及對作品的說明說明：1．由推薦者本人填寫；2．推薦者必須具有高級專業(yè)技術職稱，并是與申報作品相同或相關領域的專家學者或?qū)I(yè)技術人員（教研組集體推薦亦可）；3．推薦者填寫此部分，即視為同意推薦；4．推薦者所在單位簽章僅被視為對推薦者身份的確認。推薦者情況姓名廖明性別男年齡39職稱教授工作單位華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院通訊地址廣州天河五山華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院郵政編碼510642單位電話85280240住宅電薦者所在單位簽章（簽章）年月日請對申報者申報情況的真實性作出闡述屬實請對作品的意義、技術水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價禽流感是嚴重危害畜牧業(yè)和人類健康的傳染性疾病，可感染人并致死，危害巨大，具有重要公共衛(wèi)生學意義。目前檢測AIV的方法眾多但存在費時、費力、操作煩瑣等缺點。本作品建立的H7亞型禽流感病毒RTPCR檢測方法，具有靈敏。快速、準確。特異等優(yōu)點，應用價值和前景相當可觀，有巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。其它說明推薦者情況姓名張桂紅性別女年齡38職稱教授工作單位華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院通訊地址廣州天河五山483號郵編510640單位電話020－85280240住宅電薦者所在單位簽章簽章日期年月日請對申報者申報情況的真實性作出闡述屬實請對作品的意義、技術水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價H7亞型禽流感是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病，可感染人并致死，具有重要公共衛(wèi)生學意義。目前檢測AIV的方法眾多但存在費時、費力、操作煩瑣等缺點。本作品建立的H7亞型禽流感病毒RTPCR檢測方法，具有靈敏。快速、準確。特異等優(yōu)點，可在4－5小時確診，同時對鑒定禽流感病毒的亞型，所以具有很高的臨床應用價值和前景。其它說明學校組織協(xié)調(diào)機構確認并蓋章（團委代章）年月日校主管領導或校主管部門確認蓋章年月日

E．大賽組織委員會秘書處資格和形式審查意見組委會秘書處資格審查意見審查人（簽名）年月日組委會秘書處形式審查意見審查人（簽名）年月日組委會秘書處審查結(jié)果□合格□不合格負責人（簽名）年月日

F．參賽作品打印處H7亞型禽流感RTPCR診斷方法的建立徐珊，張停婷，陳梓棟摘要：參照GenBank中已發(fā)表的H7亞型禽流感病毒血凝素（HA）基因設計合成了一對預計擴增片段大小約為310bp的引物。利用這對引物，通過對RTPCR反應體系和反應條件的優(yōu)化，建立了針對H7亞型禽流感的RTPCR檢測方法。敏感性試驗和特異性試驗結(jié)果表明，該方法敏感性高，最低可檢出100pg的AIVH7的mRNA，且應用該引物對新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）及其它亞型的流感病毒（H1、H3、H5、H9）在相同反應條件下未擴增出任何片段具有較好的特異性。用所建立RTPCR方法檢測發(fā)病雞組織病料及咽、肛拭子，檢測結(jié)果與雞胚病毒分離結(jié)果相比陽性符合率高達90.6％。關鍵詞：H7亞型禽流感病毒；RTPCR；檢測DevelopmentandoptimizationofaRTPCRmethodfordetectingH7subtypeofavianinfluenzavirusXuShan，ZhangTingting，ChenZidong,AoYanhua,QiuXiaoyan,RenTao,XinChaoan(VeterinaryCollegeofSouthChinaAgriculturalUniversity,GuangZhou,510640)Abstract:AspecificRTPCRdetectionsystemwasdevelopedandoptimizedtodetecttheH7subtypeavianinfluenzavirus(AIV).ApairofspecificprimersweredesignedforH7subtypeAIV,whichwerepredictedtoamplifyaproductof310bpinlength.Thesensitiveandthespecificassaysindicatedthataslittleas100pgofmRNAisolatedfromH7subtypeAIVwasdetected,andonlyH7subtypeAIVcouldbedetectde.Thecoincidenceofpositiveratewasupto90.6%betweenthisRTPCRassayandtheviralisolationofembryosfordetectingtissuesandswabsofnonimmunefowl..Themethodprovidedarapid,simple,safe,sensitive,subtypespecificdignosisforH7subtypeofAIVinclinicalsamples.Keywords：H7subtypeofavianinfluenzavirus;RTPCR;Detection禽流感（AvianInfuenza,AI）是由正黏病毒科、流感病毒屬的A型流感病毒引起的禽類的一種從呼吸系統(tǒng)感染到嚴重的全身性敗血癥等多種癥狀的綜合癥。被國際獸疫局定為A類傳染病，我國把高致病性禽流感列為一類傳染病[1,2]。A型禽流感病毒基因組由8個基因片段PA、PB1、PB2、NS、NP、M、HA、NA組成，共編碼10種蛋白。在病毒的表面結(jié)構蛋白中，HA的變異幅度最大，也是誘導體液免疫的最主要保護性抗原。根據(jù)血凝素HA和神經(jīng)氨酸酶NA不同的抗原性，目前已發(fā)現(xiàn)AIV有15種特異的HA和9種特異的NA。迄今為止，造成AI大爆發(fā)的AIV均為H5和H7亞型[3,4,5]。從1959年開始，H7亞型的禽流感相繼在歐洲和大洋洲爆發(fā)。進入本世紀，H7亞型AIV疫情也不斷有報道。雖然我國暫無H7亞型AIV的爆發(fā)，但臺灣、韓國等周邊地區(qū)及國家已有發(fā)生，所以建立一套敏感、特異、快速的H7亞型AIV監(jiān)測預防措施是非常必要的。鑒于目前檢測AIV常用的雞胚病毒分離法耗費的時間長，且存在散毒的危險，本文利用聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction,PCR）的敏感、特異、快速的優(yōu)點[6]，針對H7亞型AIV的HA基因設計并合成特異性高的引物建立了H7亞型AIV的RTPCR檢測方法，并通過條件優(yōu)化，提高診斷的敏感性和特異性，為H7亞型禽流感RTPCR快速診斷試劑盒的研制打下堅實基礎，對我國H7亞型禽流感的診斷和預防控制具有十分重要的意義。1材料和方法1.1材料1.1.1病毒AIVH7亞型毒株A/Duck/Guangdong/01/2003（H7N3）及其他亞型（H1、H3、H5、H9）的毒株、NDLaSota株、IBVIBVSC93株、ILTV毒株，IBDV毒株，均由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院禽病學教研室提供并保存。1.1.2非免疫雞和雞胚1日齡非免疫雞：購自廣東省農(nóng)科院畜牧研究所，在本研究室動物舍養(yǎng)至21日齡；9－11日齡非免疫雞胚：均購自佛山墟崗黃種雞場。1.1.3主要試劑TRIzolReagent為Invitrogen公司產(chǎn)品，dNTPs(each2.5mmol)、ReverseTranscriptaseXL（AMV）、核糖核酸酶抑制劑（PRI）、隨機引物randomprimerp(N)6、ExTaqDNA聚合酶、DNAMarkerDL2000均為寶生物工程（大連）產(chǎn)品，其余試劑均為分析純。1.2方法1.2.1引物設計與合成參照GenBank中注冊的基因組序列，借助DNASTAR5.07和PrimerPremier5.0軟件，設計針對AIVH7的HA基因部分片段的引物SN1和SN2，SN1：5＇TCTTCDTTCTATGCRGAGATGAA3＇，SN2：5＇TRAARGTVACYGTGTCATTRG3＇。各引物設計完后送上海英駿生物合成，用DEPC處理過的去離子水稀釋為20pmol/μL備用。1.2.2病毒的復壯將A/Duck/Guangdong/01/2003（H7N3）作10倍連續(xù)稀釋至103，接種5枚雞胚，0.2ml/枚，37℃培養(yǎng)。棄24h內(nèi)的死胚。之后每隔12h照胚一次，將死亡雞胚4℃凍存，96h后將所有雞胚4℃凍存。4℃凍存過夜后收獲尿囊液，測HA滴度為1：256，測HI為AIVH7陽性，-200C1.2.3按TrizolReagent抽提使用說明書進行。加入11.5μLDEPC水溶解RNA，即得到病毒總RNA，直接進行反轉(zhuǎn)錄或200C保存?zhèn)溆谩?.2.4病毒基因組cDNA第一鏈的合成（RT）參照AMV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書進行。反應體系為20μL反轉(zhuǎn)錄體系：5×AMVBuffer4μL，dNTPs(each2.5mmol)2μL，隨機引物(10pmol/μL)1μL、PRI0.5μL、AMV1μL，病毒RNA抽提液11.5μL。42℃水浴1h后反應產(chǎn)物置于-20℃保存或直接1.2.5PCR擴增在50μL反應體系中加入以下組分：10×ExTaqBuffer5μL，dNTPs2μL，20pmol/μL，SN1和SN2引物各1.5μL，cDNA產(chǎn)物2μL,ExTaq聚合酶0.5μL，用無菌去離子水加至總體積為50μL?；靹蚝笾肞CR儀上執(zhí)行以下程序：94℃預變性1min；然后94℃變性50min，53℃退火40s，72℃延伸40s，運行30個循環(huán)后于72℃1.2.6敏感性試驗將AIVH7尿囊液提取的RNA溶液在分光光度計上進行濃度測定后從101至106作10倍連續(xù)稀釋，再作為模板加入該RTPCR反應體系中進行RTPCR擴增，以檢測其敏感性。1.2.7特異性試驗將A/Duck/Guangdong/01/2003（H7N3）、NDVLaSota毒株、IBVSC93毒株、H1、H3、H5、H9亞型的禽流感病毒尿囊液及陰性尿囊液提取的RNA后反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別加入到該RTPCR反應體系進行擴增，以檢測該方法的特異性。1.2.8重復性試驗用該方法重復3次各檢測8份H7亞型AIV陽性樣品和2份陰性樣品，比較其重復性。1.2.9PCR產(chǎn)物的測序鑒定將1.2.5中得到的PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD18T載體上并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞TOP10，經(jīng)質(zhì)粒PCR篩選可疑重組質(zhì)粒送上海英駿生物進行序列測定。1.2.10人工發(fā)病臨床樣品檢測非免疫雞組織臟器、咽和肛拭子的RTPCR檢測方法與雞胚病毒分離法的比較：用滴度為1：256的AIVH7尿囊液經(jīng)肌肉注射接種21d的非免疫雞，同時設立NDV、IBV等對照組。攻毒后第3d起分別采集咽拭子、肛拭子及組織病料。經(jīng)處理后分別進行RTPCR檢測及雞胚病毒分離，比較兩種方法檢測結(jié)果的符合率。對實驗室分離并鑒定的多個亞型AIV毒株和其他研究生在進行NDV、IBV、ILTV生物學特性研究、疫苗等研究時采集的臨床樣品進行AIVH7亞型特異性RTPCR模擬臨床檢驗，分析結(jié)果并比較與雞胚病毒分離法的符合率。2結(jié)果與分析2.1PCR方法的特異性將從A/Duck/Guangdong/01/2003（H7N3）、NDV毒株LaSota、IBV毒株IBVSC93、H1、H3、H5、H9亞型禽流感病毒尿囊液及陰性尿囊液提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄后用該PCR反應體系并在相同的條件下進行擴增，只有毒株A/Duck/Guangdong/01/2003（H7N3）可擴出特異性條帶。擴增產(chǎn)物大小約為300bp，與預計的理論擴增長度相符合。其它毒株均未為見擴增帶（見圖1）。圖1AIVH7亞型RTPCR特異性試驗結(jié)果M：DL2000DNAMarker；1：陰性尿囊液；2：AIVH1尿囊液；3：AIVH3尿囊液；4：AIVH5尿囊液；5：AIVH7尿囊液；6：AIVH9尿囊液；7：IBV尿囊液8：NDV尿囊液2.2敏感性試驗結(jié)果RTPCR結(jié)果表明，該引物能檢測出的最低AIVH7mRNA量約為100pg(見圖2)。圖2AIVH7亞型RTPCR敏感性性試驗結(jié)果M：DL2000DNAMarker；1：AIVH7陽性尿囊液；2：100ng；3：10ng；4：1ng；5：100pg；6：10pg；7：1pg；2.3PCR產(chǎn)物測序結(jié)果分析將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果提交NCBI進行BLAST分析表明為H7亞型AIV的HA基因部分序列。應用DNASTART5.07軟件將測序結(jié)果與已經(jīng)在Genbank中注冊的部分AIVH7亞型流感病毒代表毒株AchickenBritishColumbiaCN7-3-04(H7N3)等進行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同源性都在93%以上，證明PCR擴增片段確實是H7亞型AIV的特異性片段。（見圖3，圖4）圖3：AIVH7發(fā)育進化樹（A7為本試驗設計的引物所擴增出來的目的片段序列；其余為Genbank上注冊的部分AIVH7亞型流感病毒代表毒株。）圖4H7亞型AIV的HA基因部分序列同源性比較1：ATurkeyOntario182000(H7)。2：(AGSC_chicken_BBritishColumbia04(H7N3)。3：A7為本試驗設計的引物所擴增出來的目的片段序列。4：AchickenBritishColumbia04(H7N3)。5：AchickenBritishColumbiaCN604(H7N3)。6：AchickenBritishColumbiaCN7-3-04(H7N3)。7：AchickenBritishColumbiaCN1204(H7N3)。8：AchickenBritishColumbiaNS1337-1-04(H7N3)。9：AchickenBritishColumbiaNS1390-2-04(H7N3)。10：AchickenBritishColumbiaNS1479-1-04(H7N3)。11：AchickenNewYork1995subtypeH7。12：AChickenNewYork13142594(H7N2)。13：AChickenNewYork13833795(H7N2)。14：AmallardAlberta342001(H7N1)。2.4臨床樣品檢測結(jié)果對采集的咽拭子、肛拭子及組織病料的RTPCR檢測和雞胚病毒分離結(jié)果比較陽性符合率高達90.6％，并且對組織病料的檢出率最高，最佳檢測時間為攻毒后5d8d。電泳結(jié)果見圖5。多個亞型AIV毒株和NDV、IBV、ILTV等毒株臨床樣品進行該RT方法模擬臨床檢測，結(jié)果表明該RTPCR檢測方法的特異性為100％，與雞胚病毒分離法的符合率高達90.5％。見表1，表2，表3。圖5臨床樣品檢測結(jié)果M：DL2000DNAMarker；1：陽性（約310bp）；2：陰性；36：AIVH7咽拭子；710：AIVH7肛拭子；1117：AIVH7組織病料表1拭子樣品的檢測攻毒后天齡（d）RTPCR(+)雞胚病毒分離（+）32/6a3/642/62/654/65/664/64/673/63/684/64/693/63/6102/62/6112/62/6121/61/6132/62/6140/61/6150/60/6a:分母表示采集拭子樣品數(shù)，分子表示RTPCR陽性數(shù)；+：陽性表2泄殖腔拭子樣品的檢測攻毒后天齡（d）RTPCR(+)雞胚病毒分離（+）31/6b2/6b42/62/654/64/664/64/673/63/684/65/693/64/6102/62/6111/62/6122/62/6131/61/6140/60/6150/60/6b:分母表示采集拭子的樣品數(shù)，分子表示病毒分離陽性數(shù)；+：陽性表3模擬臨床試驗H7亞型RTPCR檢測毒株咽拭子肛拭子組織病料雞胚病毒分離AIVH10/20cAIVH30/200/200/20AIVH50/180/180/18AIVH727/10023/10038/100AIVH90/250/250/25NDV0/320/320/32IBV0/400/400/40ILTV0/350/350/355/20c7/205/1842/1004/258/3216/4011/35c:分母表示所采集樣品數(shù)，分子表示檢測樣品的陽性數(shù)；+：陽性3討論禽流感（AI），是一種世界范圍內(nèi)的禽類疫病，在有記載的禽病史上，每一次嚴重的暴發(fā)和流行都給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失和公共衛(wèi)生威脅，因此該病具有重要的公共衛(wèi)生意義。AIVRNA是由8個基因片段組成，在復制過程中很容易發(fā)生基因的重排，這決定了AIV的血清亞型眾多、變異頻繁的特點。在禽流感防治工作中，不論是對高致病性禽流感還是一般毒力得禽流感，早期及時準確的診斷，對禽流感的防制工作具有特別重要的意義。目前，傳統(tǒng)的AIV檢測方法主要有病毒組織培養(yǎng)或雞胚接種分離病毒，然后用雞陽性血清做血凝抑制實驗來確定病毒的HA亞型，再進行生物學試驗測定毒力的大小，上述診斷程序至少需要十余天時間，且結(jié)果重復性不好等。對于高致病性禽流感或潛在的高致病性禽流感這樣的烈性傳染病（通常在短時間內(nèi)造成雞群全群覆沒）來說