2024-2025學(xué)年高中生物同步備課系列【備作業(yè)】第3章 基因工程（專(zhuān)題強(qiáng)化練 PCR技術(shù)） -人教2019版選擇性必修3

第第頁(yè)第3章基因工程專(zhuān)題強(qiáng)化練PCR技術(shù)1.(2024河北滄州月考)引物在極大程度上決定了PCR的成敗，下列關(guān)于引物的說(shuō)法不正確的是()A.PCR和生物體內(nèi)的DNA合成都需要引物，PCR引物一般是單鏈DNAB.若引物的CG堿基含量相對(duì)較高，PCR復(fù)性步驟的溫度需要適當(dāng)升高C.在PCR的復(fù)性步驟，兩種引物分別結(jié)合在模板鏈的3'端和5'端D.若初始有10個(gè)胰島素基因，PCR中進(jìn)行10輪循環(huán)，至少需要20460個(gè)引物分子2.(2023北京朝陽(yáng)一模)PCR除用于擴(kuò)增目的基因外，還可以在目的基因兩端添加合適的限制酶識(shí)別序列，下列敘述正確的是()A.該圖表示PCR循環(huán)中的變性環(huán)節(jié)B.若要在擴(kuò)增產(chǎn)物兩端加上特定的限制酶識(shí)別序列，則可在引物的3'端設(shè)計(jì)添加C.TaqDNA聚合酶催化相鄰的兩個(gè)游離脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵D.用圖中引物擴(kuò)增兩個(gè)循環(huán)后即可獲得添加了限制酶識(shí)別序列的產(chǎn)物3.(2024江西南昌期中)熒光定量PCR是通過(guò)在PCR體系中添加熒光染料來(lái)記錄PCR產(chǎn)物的累積情況，從而達(dá)到對(duì)PCR過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的。Ct值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。通常情況下將已知濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)過(guò)梯度稀釋后分別取樣進(jìn)行熒光定量PCR，得到一系列的Ct值，以梯度稀釋后的濃度對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，濃度所對(duì)應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn)，即可得到一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，如圖所示，下列敘述錯(cuò)誤的是()A.熒光定量PCR反應(yīng)體系中需要添加耐高溫的DNA聚合酶B.熒光定量PCR可以用于檢測(cè)樣品中待測(cè)病毒核酸的濃度C.若兩組樣品中待測(cè)病毒核酸的濃度差了10倍，則兩組Ct值的差異在3與4之間D.若標(biāo)準(zhǔn)樣品的DNA出現(xiàn)降解，則利用所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分析，待測(cè)樣品所測(cè)Ct值偏低4.（不定項(xiàng)）(2024山東日照期末)為獲得轉(zhuǎn)G3-GFP融合基因純合小鼠，科研人員將綠色熒光蛋白(GFP)基因和G3基因拼接到一起(如圖1)，然后導(dǎo)入小鼠受精卵，再通過(guò)PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)了新生小鼠的基因型(如圖2)。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是()圖1圖2A.基因表達(dá)時(shí)圖1中基因的啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)均能轉(zhuǎn)錄B.拼接GFP基因和G3基因時(shí)需要限制酶和DNA連接酶C.由圖可知，PCR檢測(cè)時(shí)選擇的引物是引物1和引物3D.圖2中的小鼠乙是轉(zhuǎn)入G3-GFP融合基因的純合小鼠5.(2024河南信陽(yáng)期末)易錯(cuò)PCR是利用低保真的Taq酶和改變PCR的反應(yīng)條件，降低DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性，在新DNA鏈的合成過(guò)程中增加堿基錯(cuò)配，從而使擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)較多點(diǎn)突變的一種體外誘導(dǎo)DNA序列變異的方法。從自然界中的生物體內(nèi)分離得到的天然酶，在工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中催化效率往往較低。下圖是研究人員利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)某種天然酶進(jìn)行改造，獲得了高催化效率的酶的流程示意圖?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，使反應(yīng)體系中的模板DNA解聚為單鏈的條件是。PCR反應(yīng)體系中需添加引物，引物的作用是。

(2)圖中步驟①為易錯(cuò)PCR過(guò)程，其擴(kuò)增過(guò)程中需要加入Taq酶，這是因?yàn)門(mén)aq酶具有的特點(diǎn)。圖中步驟②是將構(gòu)建的重組質(zhì)粒溶于緩沖液中與用處理的受體菌混合，在一定溫度下完成轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化是指。步驟③采用技術(shù)篩選突變酶；步驟④將一輪易錯(cuò)PCR篩選獲得的有益突變繼續(xù)進(jìn)行新一輪的易錯(cuò)PCR，通過(guò)連續(xù)易錯(cuò)PCR和篩選，導(dǎo)致酶的進(jìn)化，以獲得滿(mǎn)足人們需求的產(chǎn)物。

(3)Taq酶的某一區(qū)域負(fù)責(zé)將堿基與模板鏈正確地互補(bǔ)配對(duì)，Mn2+可以降低這一功能；非互補(bǔ)的堿基對(duì)由于氫鍵不易形成，穩(wěn)定性差，Mg2+可以提高該錯(cuò)配區(qū)的穩(wěn)定性。因此，與普通PCR相比，易錯(cuò)PCR的反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)(填“提高”或“降低”)Mn2+濃度、(填“提高”或“降低”)Mg2+濃度。

6.(2024河北部分高中模擬)為研究干旱脅迫基因LEA和VOC對(duì)甘藍(lán)型油菜油脂的積累機(jī)制，科研人員構(gòu)建了兩個(gè)基因表達(dá)載體。其中基因LEA與熒光素酶基因(LUC)構(gòu)建成基因表達(dá)載體甲，基因VOC和標(biāo)記基因構(gòu)建成基因表達(dá)載體乙，相關(guān)序列及酶切位點(diǎn)如圖所示。(1)利用PCR擴(kuò)增LEA基因時(shí)，需要在引物的(填“3'端”或“5'端”)添加限制酶識(shí)別序列，添加序列對(duì)應(yīng)的限制酶是。

(2)為了構(gòu)建基因表達(dá)載體甲，依據(jù)圖中已知堿基序列，在PCR擴(kuò)增儀中加入的引物的堿基序列為，擴(kuò)增代后會(huì)得到等長(zhǎng)的8條DNA片段。

(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜細(xì)胞時(shí)，T-DNA的作用是，該過(guò)程發(fā)生的變異類(lèi)型為。

(4)乙酰-CoA羧化酶基因(AC)是油脂合成過(guò)程的關(guān)鍵酶基因，甘油三酯酯酶基因(ATGL)是油脂分解過(guò)程的關(guān)鍵酶基因。將基因表達(dá)載體甲、乙分別導(dǎo)入植物細(xì)胞培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因植物A、B，在干旱脅迫的環(huán)境下培養(yǎng)兩種轉(zhuǎn)基因植物和正常植物，分別檢測(cè)植物體內(nèi)AC和ATGL基因的表達(dá)水平，結(jié)果如下圖。①在分子水平上，用方法檢測(cè)AC酶和ATGL酶的含量可得到上述結(jié)果。

②基于以上研究，干旱脅迫基因LEA和VOC在甘藍(lán)型油菜油脂積累中的機(jī)制是。

7.(2024廣東名校聯(lián)考)fat1基因和fat2基因控制的酶分別調(diào)控兩種多不飽和脂肪酸的合成，兩種酶的共同表達(dá)對(duì)于細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂肪酸的合成具有協(xié)同效應(yīng)。2A肽是一種來(lái)源于病毒的短肽，受2A基因序列控制。2A基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以通過(guò)“核糖體跳躍”斷開(kāi)位于2A肽尾端甘氨酸和脯氨酸之間的肽鍵，將2A基因編碼的蛋白分割成2個(gè)獨(dú)立蛋白。圖甲表示科研人員利用重疊延伸PCR技術(shù)成功構(gòu)建融合基因fat1-2A-fat2的過(guò)程。圖乙表示構(gòu)建成功的包含融合基因的重組質(zhì)粒的部分片段，F(xiàn)1~F4、R1~R4表示引物。通過(guò)基因工程成功實(shí)現(xiàn)了fat1基因和fat2基因在小鼠體內(nèi)的共同表達(dá)，大大提高了細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂肪酸的含量。圖甲圖乙(1)利用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)在體外快速大量DNA擴(kuò)增，其與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的共同點(diǎn)是(答出2點(diǎn))。若圖乙中融合基因的b鏈為模板鏈，則圖甲PCR1中的引物甲與圖乙中的引物的絕大部分序列相同。

(2)PCR1和PCR2需要分開(kāi)單獨(dú)進(jìn)行，原因是。PCR3不需要引物，高溫加熱后fat1-2A和2A-fat2的雙鏈解開(kāi)，其中能正常延伸形成融合基因的是(填序號(hào))形成的雜交鏈。

(3)為了確定fat1基因連接到質(zhì)粒中且插入2A序列的上游，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖乙中的引物。

答案與解析專(zhuān)題強(qiáng)化練PCR技術(shù)1.C2.D3.D4.AC1.C生物體內(nèi)的DNA合成和PCR都需要引物，PCR引物一般是單鏈DNA，A正確；G與C之間有3個(gè)氫鍵，穩(wěn)定性高，若引物的CG堿基含量相對(duì)較高，PCR復(fù)性步驟的溫度需要適當(dāng)升高，B正確；在PCR的復(fù)性步驟，兩種引物都結(jié)合在模板鏈的3'端，C錯(cuò)誤；若初始有10個(gè)胰島素基因，PCR中進(jìn)行10輪循環(huán)，得到10×210=10240(個(gè))DNA分子，共10240×2=20480(條)鏈，由于每一條子鏈都以引物為起點(diǎn)進(jìn)行延伸，故新合成的子鏈數(shù)=消耗的引物數(shù)=20480-20(初始模板鏈)=20460，D正確。2.D題圖中引物與模板鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)，表示PCR循環(huán)中的復(fù)性環(huán)節(jié)，A錯(cuò)誤；PCR引物的3'端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵堿基，5'端無(wú)嚴(yán)格限制，如圖所示：可將限制酶識(shí)別序列添加到引物的5'端，以實(shí)現(xiàn)在目的基因兩端添加限制酶識(shí)別序列的目的，用圖中引物擴(kuò)增兩個(gè)循環(huán)后即可獲得添加了限制酶識(shí)別序列的產(chǎn)物，B錯(cuò)誤，D正確；延伸時(shí)，在TaqDNA聚合酶催化下，游離的脫氧核苷酸會(huì)依次連接到正在形成的子鏈的3'端，C錯(cuò)誤。歸納總結(jié)(1)可將限制酶識(shí)別序列添加到引物的5'端，以實(shí)現(xiàn)在目的基因兩端添加限制酶識(shí)別序列的目的。(2)若兩個(gè)引物均結(jié)合到DNA分子的內(nèi)部，則循環(huán)3次才能得到兩條鏈等長(zhǎng)的DNA。3.DPCR的延伸過(guò)程需要耐高溫的DNA聚合酶，A正確；熒光定量PCR的Ct值與病毒核酸的濃度有關(guān)，病毒核酸的濃度越高，達(dá)到設(shè)定的熒光閾值所需循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小，B正確；根據(jù)圖中Ct值與梯度稀釋后的濃度對(duì)數(shù)值之間的關(guān)系可知，若兩組樣品中待測(cè)病毒核酸差了10倍，則Ct值相差大約3.3個(gè)單位，C正確；由于DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度越高，達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)越少，Ct值越小，因此若標(biāo)準(zhǔn)樣品的DNA出現(xiàn)降解，DNA濃度下降，則標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)值偏高，待測(cè)樣品所測(cè)Ct值偏高，D錯(cuò)誤。4.AC基因表達(dá)時(shí)，圖1中基因編碼區(qū)能轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，但啟動(dòng)子區(qū)不轉(zhuǎn)錄，A錯(cuò)誤。構(gòu)建目的基因的表達(dá)載體、將GFP基因整合到野生型小鼠G3基因一端時(shí)，需要限制酶和DNA連接酶，B正確。已知：G3-GFP融合基因電泳后的DNA片段較大，G3基因電泳后的DNA片段較小。分析選擇不同引物進(jìn)行PCR后的電泳結(jié)果：引物結(jié)果分析引物1和引物2整合了GFP基因，核酸片段較大；未整合GFP基因，核酸片段較小引物1和引物3整合了GFP基因，有PCR產(chǎn)物；未整合GFP基因，無(wú)PCR產(chǎn)物，與圖2不符根據(jù)以上分析可知，PCR檢測(cè)時(shí)選擇的引物是引物1和引物2，C錯(cuò)誤。圖2中的小鼠乙只有大片段，由此可判斷小鼠乙是轉(zhuǎn)入G3-GFP融合基因的純合小鼠，D正確。5.答案(1)溫度超過(guò)90℃使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸(2)耐高溫Ca2+目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程抗原—抗體雜交定向(3)提高提高解析(1)在體外利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，利用DNA高溫變性的特點(diǎn)加熱至90℃以上，破壞雙鏈之間的氫鍵，使DNA解聚變?yōu)閱捂湣Ｓ肞CR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，需要在PCR擴(kuò)增儀中加入2種引物，其作用是使DNA聚合酶(Taq酶)從引物的3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸。(2)PCR技術(shù)需要高溫加熱使DNA雙鏈解旋，而Taq酶熱穩(wěn)定性高，在高溫條件下不會(huì)失活。受體菌用Ca2+處理后更容易吸收周?chē)h(huán)境中的DNA，步驟②是將構(gòu)建的重組質(zhì)粒溶于緩沖液中與用Ca2+處理的受體菌混合，在一定溫度下完成轉(zhuǎn)化，通過(guò)轉(zhuǎn)化可使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)。(3)根據(jù)題干信息可知，Mn2+可以降低堿基與模板鏈正確地互補(bǔ)配對(duì)，Mg2+可以提高錯(cuò)配區(qū)非互補(bǔ)的堿基對(duì)的穩(wěn)定性，因此與普通PCR相比，易錯(cuò)PCR的反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)提高M(jìn)n2+、Mg2+濃度。6.答案(1)5'端EcoRⅤ和XbaⅠ(2)5'-GATATCATGGGC-3'和5'-TCTAGACTAGTG-3'4(3)攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞并將其整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上基因重組(4)①抗原—抗體雜交②在干旱脅迫的環(huán)境下，LEA通過(guò)促進(jìn)AC的表達(dá)使植物油脂增加；VOC通過(guò)抑制ATGL的表達(dá)減弱油脂的分解解析(1)由于LUC基因中存在BamHⅠ識(shí)別序列，且一種酶切會(huì)導(dǎo)致載體、LEA自身環(huán)化及LEA與載體反向連接等，所以選擇的限制酶是EcoRⅤ和XbaⅠ。(2)結(jié)合(1)可知，利用PCR擴(kuò)增LEA基因時(shí)，在引物的5'端添加了EcoRⅤ和XbaⅠ的識(shí)別序列，已知載體上多酶切位點(diǎn)、LEA基因的序列及轉(zhuǎn)錄方向，則經(jīng)PCR后擴(kuò)增出來(lái)的序列如下圖：引物只能引導(dǎo)子鏈從5'→3'延伸，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，為了構(gòu)建基因表達(dá)載體甲，在PCR擴(kuò)增儀中加入的引物的堿基序列為5'-GATATCATGGGC-3'和5'-TCTAGACTAGTG-3'。設(shè)PCR通過(guò)n輪循環(huán)，獲得等長(zhǎng)片段的數(shù)量為2n-2n=8，n=4，即應(yīng)該擴(kuò)增4代。(4)①在分子水平上檢測(cè)酶(本質(zhì)為蛋白質(zhì))采用抗原—抗體雜交技術(shù)。②根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，轉(zhuǎn)基因植物A(LEA基因表達(dá))的AC酶變高了，轉(zhuǎn)基因植物B(VOC基因表達(dá))的ATGL酶變低了，推測(cè)在干旱脅迫的環(huán)境下，LEA通過(guò)促進(jìn)AC的表達(dá)使植物油脂增加，VOC通過(guò)抑制ATGL的表達(dá)減弱油脂的分解。7.答案(1)都需要模板、引物、DNA聚合酶，原料都是脫氧核苷酸(答出2點(diǎn)即可)R4(2)引物甲和引物丁部分堿基互補(bǔ)配對(duì)，影響子鏈的合成①④(3)F1、R3解析(1)若圖乙中融合基因的b鏈為模板鏈，根據(jù)啟動(dòng)子和終止子的位置可知圖乙中轉(zhuǎn)錄方向是從左向右，則可判斷圖乙DNA雙鏈和引物的方向：圖甲PCR1中fat1的雙鏈和引物方向：根據(jù)以上分析可知，圖乙中fat1片段中與R4配對(duì)的單鏈?zhǔn)莂鏈，因此圖甲PCR1中的引物甲與圖乙中引物R4的絕大部分序列相同。(2