NK細(xì)胞殺傷活力檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

質(zhì)量管理體系操作規(guī)程N(yùn)K殺傷活力檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)版本號(hào)PAGE3of=NUMPAGES4-13質(zhì)量管理體系操作規(guī)程N(yùn)K殺傷活力檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)版本號(hào)文件變更更改前版本號(hào)變更內(nèi)容摘要修改人/修改日期文件審核項(xiàng)目簽名日期起草人/修訂人審核人批準(zhǔn)人受控狀態(tài)分發(fā)號(hào)生效日期目的規(guī)范NK的殺傷活力的檢測操作和結(jié)果判定。通過流式法檢測NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷作用。范圍本標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程適用于細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)室及GMP實(shí)驗(yàn)室所制備NK細(xì)胞對靶細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。責(zé)任人質(zhì)檢人員：嚴(yán)格按照本規(guī)程進(jìn)行NK殺傷活力檢測。QA：負(fù)責(zé)監(jiān)督操作人員嚴(yán)格按照本規(guī)程執(zhí)行。定義與縮寫FBSFetalBovineSerum胎牛血清DPBSDulbecco'sPhosphateBufferSaline杜氏磷酸緩沖鹽溶液引用文件NA儀器試劑樣本：效應(yīng)細(xì)胞：NK細(xì)胞靶細(xì)胞：K562-#5細(xì)胞主要儀器：離心機(jī)，A2生物安全柜，潮化5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀，血球計(jì)數(shù)板，搖床，50μl排槍，200μl排槍，流式細(xì)胞儀。試劑序號(hào)名稱品牌貨號(hào)備注1AIM-VGibcoA30210022-8℃2IMDMLonza12-722F2-8℃3FBSPAN≤-20℃496孔板（U形底）NUNC163320常溫51×DPBS--常溫流式法操作規(guī)程試劑準(zhǔn)備請將所有相關(guān)試劑恢復(fù)到室溫再使用。細(xì)胞毒試驗(yàn)培養(yǎng)液：AIMV+5%FBS，IMDM+5%FBS。流式緩沖液：DPBS+2%FBS靶細(xì)胞準(zhǔn)備收獲K562-#5細(xì)胞，200g、10分鐘，并計(jì)數(shù)。將細(xì)胞沉淀按照2×105cells/mL重懸在IMDM+5%FBS培養(yǎng)液中。將靶細(xì)胞接種至96孔U形板，每孔100μl，至少18孔。在3個(gè)空孔中分別加入100μlIMDM+5%FBS培養(yǎng)液作為對照。將細(xì)胞放入37℃潮化5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，孵育過夜。效應(yīng)細(xì)胞準(zhǔn)備第二日，收獲效應(yīng)細(xì)胞，300g、10分鐘離心。將效應(yīng)細(xì)胞重懸在AIMV+5%FBS培養(yǎng)液中，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至4×106cells/mL，并標(biāo)記“20”。另取4個(gè)1.5mLEP管，每管加入500μlAIMV+5%FBS培養(yǎng)液，并標(biāo)記10，5，2.5，1.25。從4×106cells/mL的細(xì)胞懸液中取500μl加入標(biāo)記有“10”的EP管中，充分混勻。再取出500μl細(xì)胞懸液加入標(biāo)記有“5”的EP管中，充分混勻。以此類推，梯度稀釋至1.25倍。共孵育設(shè)計(jì)用于細(xì)胞毒試驗(yàn)的96孔板（U形底），設(shè)立用于實(shí)驗(yàn)組、靶細(xì)胞組和效應(yīng)細(xì)胞組，3復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組中效應(yīng)細(xì)胞(E):靶細(xì)胞(T)比例設(shè)定為20:1，10:1，5:1，2.5:1，1.25:1。靶細(xì)胞組中只有靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞組中只有效應(yīng)細(xì)胞。從不同密度的NK細(xì)胞懸液中分別取100μl加入前一日已加好靶細(xì)胞的對應(yīng)孔中。效應(yīng)細(xì)胞組中每孔加入100μl1.25倍的效應(yīng)細(xì)胞。注意留出對照組只有K562-#5，加入100μlAIMV+5%FBS培養(yǎng)液，不加NK細(xì)胞。具體比例分配如下圖所示：將接種完成的96孔板放入潮化5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，蓋一層鋁箔紙，孵育過夜。檢測孵育結(jié)束后，將96孔板離心500g、5分鐘。吸出每孔中的上清液并廢棄，將細(xì)胞沉淀重懸于100μlPBS+2%FBS中。用細(xì)胞流式儀以中速吸取20μl，在FSC-SSC圖中圈出細(xì)胞群所在位置，并在FL1-A-FSC途中圈出GFP陽性的K562-#5，記錄每20μl中的K562-#5數(shù)量。最終靶細(xì)胞殺傷計(jì)算公式殺傷注意事項(xiàng)在接種96孔板時(shí)，盡量不用邊緣一圈孔，邊緣一