DB31T 600-2012 豬附紅細胞體PCR檢測方法

豬附紅細胞體PCR檢測方法MethodofdetectingEperythrozoonsuisbyPCR上海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由上海交通大學提出。本標準由上海市畜牧辦公室歸口。本標準由上海交通大學、中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局、上海市動物疫病預防控制中心、上海市動物衛(wèi)生監(jiān)督所起草。1豬附紅細胞體PCR檢測方法本標準規(guī)定了豬附紅細胞體PCR檢測方法。本標準適用于豬附紅細胞體的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。附紅細胞體Eperythrozoons豬附紅細胞體Eperythrozoonsuis以從血液樣本中提取的基因組DNA作為模板，加入到擴增豬附紅細胞體的PCR反應(yīng)混合液中，進行PCR擴增。最后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，與DNAMarker進行比較，來確定擴增產(chǎn)物所用引物是根據(jù)豬附紅細胞體16SrRNA保守序列設(shè)計。5試劑和材料除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682的滅菌雙蒸水。5.1豬附紅細胞體PCR反應(yīng)混合物：上、下游引物各1μL,10×PCR緩沖液2.5μL(含鎂離子)、雙蒸水加至23μL。引物序列如下，擴增長度為396bp,引物濃度為20μmol/L。2Tris-HCl(pH8.8),1%TritonX-100,1mg5.4dNTP混合液(四種脫氧核苷酸的含量均為2.5mmol/L)。6.2核酸電泳儀和水平電泳槽。6.3凝膠成像系統(tǒng)(或紫外透射儀)。6.6臺式冷凍離心機(轉(zhuǎn)速>12000r/min;溫度4℃)。6.7天平：稱量范圍0.1g～1000g,讀數(shù)6.9恒溫水浴箱(37℃)。采集豬檸檬酸鈉抗凝血1mL～2mL,于4℃保存?zhèn)溆?建議在一個星期內(nèi)檢測完畢)。7.2DNA的制備按照常規(guī)方法抽提DNA。取各血樣100μL加入PBS(pH7.4)至總體積達500μL,加入15μL濃度為10%的SDS以及5μL濃度為20g/L蛋白酶K,在EP管中50℃孵育30min。加入等體積酚-三氯甲烷-異戊醇混合液(體積比為25:24:1),上下充分混勻。8000r/min離心5min,取上清繼續(xù)抽預冷(-4℃)的70%乙醇洗滌沉淀，-20℃保存?zhèn)溆?。也可用等效的DNA提取試劑盒提取DNA模板。7.3PCR擴增陽性對照為確定感染附紅細胞體的陽性質(zhì)粒。陰性對照為健康豬血液DNA?？瞻讓φ沼玫润w積37.3.2PCR反應(yīng)體系和條件取比待檢樣品數(shù)多兩只的豬附紅細胞體PCR反應(yīng)混合物的PCR管，2000r/min離心10s后各加入TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL,分別加入待檢樣品DNA提取物和陰性、陽性、空白對照2μL到PCR管中，2000r/min離心10s,立即進行PCR擴增。擴增條件為：94℃、1min;60℃、1min;72℃、7.4PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測用1.5%瓊脂糖凝膠板，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。取10μLPCR擴增產(chǎn)物分別和2μL6×加樣緩沖液混合后，加樣到凝膠孔。在電泳緩沖液中，3V/cm～4V/cm電泳約30min,當溴酚藍到達底部時停止電泳，將電泳好的凝膠放到紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。8結(jié)果判定8.1判定條件陽性對照會有一條396bp片段?？瞻讓φ?、陰性對照PCR產(chǎn)物電泳后在396bp處無條帶，試驗有8.2結(jié)果判定待檢樣本經(jīng)PCR擴增后在396bp位置上有條帶，判為豬附紅細胞體陽性；在396bp位置無條帶，判為豬附紅細胞體陰性。9廢棄物處理、防止污染的措施和生物安全要求檢測過程中的廢棄物的處理，采樣、樣品處理及檢測過程所涉及的實驗操作應(yīng)遵守GB19489的有關(guān)規(guī)定。4(規(guī)范性附錄)試劑的配制A.1電泳緩沖液TBE的配制A.1.15×TBE的配制硼酸27.5gA.1.21×TBE使用液的配制加蒸餾水定容至1000mL,混勻備用。A.21.5%瓊脂糖凝膠板的配制瓊脂糖1.5g加1×TBE定容至100mL,完全融化后，溶液冷卻至60℃,加10mg/mL溴化乙錠5μL(終濃度A.36×加樣緩沖液的配制溴酚藍0.25g蔗糖40g加蒸餾水溶解并定容至100mLA.410g/L溴化乙錠溶液的配制1.0g溴化乙錠(EB),溶于100mL水中。A.5冰乙醇將100%乙醇溶液置于-20℃冰箱，完全冷卻后備用。在900mL水中溶解100g電泳級SDS(十二烷基硫酸鈉),加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2,加水定容至1L,分裝備用。5A.720g/L蛋白酶K將200mg的蛋白酶K加入到9.5mL水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10mL,然后分裝成小份貯存于-20℃?zhèn)溆谩?(規(guī)范性附錄)結(jié)果判定標準豬附紅細胞體PCR檢測方法關(guān)中國標