細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教案

細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)方案

第一章序論

第一節(jié)細(xì)胞生物學(xué)的特點(diǎn)

第二節(jié)細(xì)胞學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史

的名言

一細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)

二細(xì)胞學(xué)說(shuō)的建立

細(xì)胞學(xué)說(shuō)的主要內(nèi)容

???

0的名言

二細(xì)胞學(xué)的經(jīng)典時(shí)期

原生質(zhì)和原生質(zhì)體概念的提出原生質(zhì)()原生質(zhì)體()

細(xì)胞分裂的研究

重要細(xì)胞器的發(fā)現(xiàn)

三細(xì)胞學(xué)的分支

遺傳學(xué)的發(fā)展

()精卵細(xì)胞染色體數(shù)只是體細(xì)胞染色體數(shù)的一半

()孟德爾定律的重新發(fā)現(xiàn)

⑶1905發(fā)現(xiàn)性別和染色體的關(guān)系

預(yù)見遺傳單位有次序的排列在染色體上()染色體學(xué)說(shuō)

染色體行為和遺傳因子聯(lián)系起來(lái).

()連鎖基因圖

細(xì)胞生理學(xué)

細(xì)胞化學(xué)

四細(xì)胞生物學(xué)的形成與發(fā)展

空間結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)

六十年代”細(xì)胞生物學(xué)”產(chǎn)生

七十年代細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)的開展

八十年代分子細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展

九十年代分子細(xì)胞生物學(xué)高科技手段的發(fā)展和運(yùn)用

指紋技術(shù)

雜交瘤技術(shù)的運(yùn)用

第二章細(xì)胞基本知識(shí)

第一節(jié)非細(xì)胞形態(tài)的生命體

骯病毒()巴布亞新幾內(nèi)亞一土著庫(kù)魯病笑死癥

羊腦風(fēng)牛病

類病毒

病毒

第二節(jié)原核細(xì)胞

支原體

衣原體

立克次氏體

放線菌

細(xì)菌和藍(lán)藻

第三節(jié)真核細(xì)胞基本知識(shí)概要

三大系統(tǒng)

動(dòng)植物細(xì)胞的比較

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

自年荷蘭學(xué)者列文虎克（）用單顯微鏡（單透鏡）第一次看到酵母活

細(xì)胞以來(lái),人們一直在努力改革和發(fā)展觀察手段，來(lái)研究細(xì)胞較深層

次的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。今天人們已經(jīng)有了具有原子尺度高分辨本領(lǐng)的掃描

隧道顯微鏡。與此同時(shí)人們還創(chuàng)造了一系列對(duì)細(xì)胞組分和細(xì)胞生理活

動(dòng)進(jìn)行詳盡分析的方法和手段，它們揭示了各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)與生物大分

子在細(xì)胞內(nèi)的功能和作用。為了提供大量均一的細(xì)胞作為生物學(xué)的研

究材料,人們又發(fā)展了一系列細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。這些培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)給人

類帶來(lái)了極大的利益?？梢哉J(rèn)為，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察技術(shù)，細(xì)胞組

分與功能的分析技術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)賴以發(fā)展的三大

技術(shù)手段。在這里我們只能對(duì)某些具有代表性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基本原理

和技術(shù)特點(diǎn)作一簡(jiǎn)單的介紹。希望學(xué)生通過(guò)本章的學(xué)習(xí)不但能了解實(shí)

驗(yàn)技術(shù)本身，還能夠了解到細(xì)胞生物學(xué)這一實(shí)驗(yàn)科學(xué)的發(fā)展是和實(shí)驗(yàn)

技術(shù)的進(jìn)步休威相關(guān)的，囚此發(fā)展和開發(fā)先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)也是細(xì)胞生

物學(xué)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。

第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

-固定法與活體觀察法

固定法是以一定的化學(xué)物質(zhì)的溶液(有區(qū)是氣體)在盡可能保持細(xì)

胞生活結(jié)構(gòu)的情況下迅速殺死組織塊。這一過(guò)程稱為固定()。然后制

成薄切片,再染色()進(jìn)行觀察。這種方法比起觀察活細(xì)胞有三個(gè)優(yōu)點(diǎn):

第一,它能清楚地顯現(xiàn)細(xì)胞的細(xì)微構(gòu)造,如關(guān)于染色體,各種細(xì)胞器、

細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的微細(xì)構(gòu)造都是靠這種方法闡明的。第二,這種方法

的制片一般均能保存很久,便于前后研究各種現(xiàn)象之比較。第三,應(yīng)用

范圍廣,幾乎可用于所有的組織細(xì)胞。

這種方法不僅在細(xì)胞學(xué)發(fā)展的歷史上發(fā)揮過(guò)很大作用,而且在現(xiàn)代

細(xì)胞學(xué)中也是重要研究手段之一。例如用電子顯微鏡研究細(xì)胞亞顯微

結(jié)構(gòu)時(shí)通常都使用固定法。固定法在細(xì)胞化學(xué)的研究上也有廣泛的應(yīng)

用。

固定法的缺點(diǎn)是,在用固定劑()殺死細(xì)胞的同時(shí),常常難免使細(xì)胞的

某些生活結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變形。因此這種方法不能完全如實(shí)地反映生

活細(xì)胞的情況。在實(shí)踐上往往是能保存細(xì)胞某種結(jié)構(gòu)的固定齊！J,卻不

能使另一些結(jié)構(gòu)保留下來(lái)。例如,適于觀察染色體的固定劑,對(duì)于觀察

線粒體就不合適。有人因?yàn)楣潭ǚǖ倪@種缺點(diǎn)而對(duì)它抱懷疑主義由態(tài)

度。這是過(guò)分偏激的觀點(diǎn)。事實(shí)上只要選擇合適的固定劑，這種方法

是能展示給我們細(xì)胞結(jié)構(gòu)的許許多多細(xì)節(jié)的。當(dāng)然,另一方面在應(yīng)用

此法時(shí)也不應(yīng)該忘掉它的固有缺點(diǎn)。在研究某種結(jié)構(gòu)時(shí),最好同時(shí)多

用幾種固定劑，對(duì)比分析所觀察的現(xiàn)象，以免做出主觀的判斷。

活體觀察法的優(yōu)缺點(diǎn)與固定法正好相反。它的優(yōu)點(diǎn)是能夠如實(shí)

地反映生活細(xì)胞的情況。但完全做到這一點(diǎn)也并不容易，必須嚴(yán)格

控制實(shí)驗(yàn)條件，最大限度地使所觀察的細(xì)胞得到正常生活條件。活

體觀察的缺點(diǎn)是，顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)的精細(xì)程度較差。這和在活體情況

下細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)柩的折光率相近有關(guān)。相差顯微鏡的運(yùn)用雖然在一

定程度上可以克服這一缺點(diǎn)，但較之固定法在顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)的精細(xì)

程度上仍大有遜色。

由于組織培養(yǎng)方法的進(jìn)步，能夠進(jìn)行活體觀察的細(xì)胞種類也大

大增多。

固定法和活體觀察法各有優(yōu)缺點(diǎn)，不能互相代替。只有結(jié)合并

用，取長(zhǎng)補(bǔ)短，方有利于全面認(rèn)識(shí)細(xì)胞生活的真相。

二各種顯微鏡

觀察細(xì)胞離不開顯微鏡0o這正象觀察天體要用望遠(yuǎn)鏡一樣。

常用的顯微鏡有普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒

光顯微鏡、電子顯微鏡等。

、普通光學(xué)顯微鏡0的分辨本領(lǐng)

各種顯微鏡識(shí)別微觀物象的能力常用分辨力0的概念來(lái)表示。

分辨力是指能夠區(qū)分相近兩點(diǎn)的最小距離，能夠區(qū)分的兩點(diǎn)間距離

越小，表示顯微鏡的分辨力越高。分辨力亦稱分辨本領(lǐng)。顯微鏡的

分辨力是由物鏡決定的。它和物鏡的鏡□率、照明光線的波長(zhǎng)有直

接關(guān)系。分辨力可按下式計(jì)算：

0

分辨力

2照明光源的波長(zhǎng)

鏡□率(數(shù)值孔徑)

a

?................()

物鏡與標(biāo)本間的介質(zhì)的折射率

a物鏡的鏡口角

所謂鏡口角是指從物鏡光軸上的物點(diǎn)發(fā)出的光線與物鏡前透鏡

有效直徑的邊緣所張的角度()o鏡口角a小于a,故的最大值也

小于。

從公式0可乂看出，為提高分辨力，光源波長(zhǎng)(越小越好，而

物鏡的鏡口率越大越好。按可視光線的波長(zhǎng)((毫微米)為毫微米，

物鏡的最大鏡口率為計(jì)算，微米。這就是說(shuō)，相近兩點(diǎn)的距離小于

微米時(shí)，普通光學(xué)顯微鏡符不能分辨出這兩點(diǎn)。因?yàn)榭梢暪饩€的波

長(zhǎng)可小到毫微米。所以一般認(rèn)為普通光鏡的分辨本領(lǐng)的極限約為微

米。

細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)如染色體、線粒體、中心體、核仁等大于微米，

在光學(xué)顯微鏡中能觀察到。這種結(jié)構(gòu)稱顯微結(jié)構(gòu)()內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜、

核膜、微管、微絲等囚小于微米，在普通光學(xué)顯微鏡下看不到，稱

為亞顯微結(jié)構(gòu)0O

從公式（）可以看出，要增大鏡口率必須提高物鏡與標(biāo)本間介質(zhì)

的折射率。空氣的折射率為，香柏油的折射率為。因?yàn)橐龃箸R口

率必須用油浸物鏡。

、暗視野顯微鏡

暗視野顯微鏡（）是根據(jù)丁達(dá)爾（）效應(yīng)的原理設(shè)計(jì)的。若在暗室

中穿入一細(xì)束光線,那么由側(cè)面觀察時(shí),那些在普通照明的散射光下

看不見的空氣中的細(xì)小塵埃顆粒,可以看得很清楚。這種現(xiàn)象稱丁達(dá)

爾現(xiàn)象。暗視野顯微鏡是因?yàn)橐曇皟?nèi)不能直接看到照明光線,只能看

到被檢物體散射或衍射的光線。故視野內(nèi)呈黑暗狀態(tài)。由于被檢物

體表面散射的光亮.才使我們能夠在黑暗的視野中觀察到被檢物體

的外形和運(yùn)動(dòng)。

普通顯微鏡的最高分辨力如上所述為微米,而暗視顯微鏡雖然

對(duì)被檢物體的細(xì)微構(gòu)造分辨不清，但卻可看到微米以上的微粒子的

存在。這是普通光學(xué)顯微鏡所不具有的特性。

暗視野顯微鏡與普通顯微鏡的構(gòu)造差別,在于集光器的特殊c普

通顯微鏡換上暗視野集光器或用中心擋光法（用黑色厚紙或金屬薄

片制成圓形擋光片。放在普通集光器下面的濾光玻片上，擋住中央

光束）。即可取得暗視野效果。

用中心擋光法若想取得良好的暗視野效果，除了選擇適當(dāng)直徑

的中心擋光片外，還須考慮反射鏡的角度，光源的強(qiáng)度等各種因素。

常見的暗視野集光器是拋物面集光器（圖）。它的集光鏡是一

個(gè)單透鏡，周圍成斜度較小的拋物線形式。由顯微鏡的反光鏡反射

出的光線，被集光鏡的中部遮光板所阻擋，但側(cè)面光線則自由進(jìn)入

遮光板旁和透鏡邊緣之間的縫隙。這些光線在聚光鏡的拋物面的凹

面上發(fā)生折射,結(jié)果光線集中到聚光鏡的界面以外,處于觀察標(biāo)本的

平面上。

由于直線進(jìn)行的光束被遮光板擋住不能進(jìn)入物鏡，因此視野變

暗。而折射光線集中到標(biāo)本的物鏡結(jié)構(gòu)時(shí)被散射非常光亮,通過(guò)物鏡

達(dá)到觀察者眼中，故觀察細(xì)胞的某些結(jié)構(gòu)（尤其是細(xì)胞質(zhì)顆粒）是亮

的（圖）。

、相差顯微鏡

人們?cè)陲@微鏡下觀察被檢標(biāo)本時(shí)，只能靠顏色（光波的波長(zhǎng)）和亮度

（光波的振幅）的差別看到被檢物的結(jié)構(gòu)?；罴?xì)胞近于無(wú)色透明,當(dāng)光

波通過(guò)它時(shí)顏色和亮度變化不大。因此在普通光學(xué)顯微鏡下細(xì)致觀

察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)是很難的。

三十年代.提出相差顯微鏡（）的原理和設(shè)計(jì),四十年代開始制造相

差顯微鏡出售。由于有了相差顯微鏡,在一定程度上克服了上述困難

可以直接看到活細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)變化。

相差是指同一光線經(jīng)過(guò)折射率不同的介質(zhì)，其相位發(fā)生的差異。

那么什么是相位呢？相位是在某一時(shí)間上光的波動(dòng)所能達(dá)到的位

置。當(dāng)光波通過(guò)兩種不同折射率的物質(zhì)時(shí)（如由空氣入水,或由空氣

入玻璃），其波長(zhǎng)、振幅和相位皆有不同程度的變化。例如，使光分別

通過(guò)公分厚的水和玻璃時(shí)，由于水和玻璃的折射率不同,通過(guò)它們的

光波的相位產(chǎn)生一定差異（通過(guò)玻璃的光波的相位落后）。這個(gè)相位

差異稱相差（圖）o相差決定于光波所通過(guò)的介質(zhì)的折射率之差與厚

度,等于折射率與厚度的乘積之差。介質(zhì)越厚或折射率越大,光波減

速也越大。

光線的相差用肉眼分辨不出，只有利用石射和干涉現(xiàn)象,把相差變

為振幅差,即明暗之差,肉眼才能識(shí)別。

光波通過(guò)小顆粒（物體）后產(chǎn)生直射光和衍射光。后者的振幅較

小,相位延后（圖）。當(dāng)在光學(xué)系統(tǒng)中,這種直射光和衍射光相遇時(shí),根

據(jù)它們相位的異同，其振幅發(fā)生減小或加大的變化，使光線變暗或變

亮,這種現(xiàn)象稱為二涉。

相差顯微鏡的工作原理如圖和圖所示。光線通過(guò)聚光鏡下的環(huán)

狀光闌在物鏡的焦點(diǎn)面聚光。載片上的物體受來(lái)自環(huán)狀光闌的光線

照射,直射光在'處成像，而散發(fā)的衍射光一部分也由于物鏡透鏡的

作用在'成像。這時(shí)觀察者看到的是直射光和衍射光在'處干涉形

成的像。但如果使用的是普通物鏡，衍射光的相位落后波長(zhǎng)，并且

比直射光的成像弱，因此干涉合成的光與背景光線的振幅差別很小。

相差顯微鏡的物鏡中安裝有相板。相板有推遲直射光或衍射光的相

位和吸收光量，以調(diào)節(jié)直射光或衍射光的亮度的作用。利用相差物

鏡的相板，把直射光推遲波長(zhǎng)，使直射光和衍射光維持同一相位

（圖、）兩者的光波由于干涉現(xiàn)象，其振幅為二者之和。因背景只

有直射光，故被照射的物體比背景亮，稱明反差（）或負(fù)反差（）。如

用另一種相差物鏡的相板,把衍射光推遲波長(zhǎng),直射光的衍射光內(nèi)相

位差變成波長(zhǎng)，由它們干涉合成的光波振幅為二者振幅之差（圖、），

故被照射物體比背景暗，稱暗反差（）或正反差（）。

相差顯微鏡的裝置和普通顯微鏡不同者是前者聚光鏡下加環(huán)狀

光闌.物鏡里裝有相板。另外有調(diào)軸望遠(yuǎn)鏡。

不同倍數(shù)的相差物鏡要用相應(yīng)的環(huán)狀光闌。因此環(huán)狀光闌有X、

X、X、X等不同直徑的，裝配在一個(gè)旋轉(zhuǎn)盤內(nèi)，按需要調(diào)換使用。

物鏡的相板上有一個(gè)半透明環(huán)，環(huán)和環(huán)以外的部分涂有不同的

物質(zhì),使通過(guò)的光線產(chǎn)生一定的相位差,以取得明反差或暗反差效

果。

用顯微鏡目鏡看不清光闌亮圈和相板的環(huán)狀圈。只有用調(diào)軸望

遠(yuǎn)鏡方能看清楚,以便轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)裝置，使兩個(gè)環(huán)圈重合對(duì)齊。這樣才

能發(fā)揮相差顯微鏡的效能,看清活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。

相差顯微鏡的光源要用強(qiáng)光,并使用波長(zhǎng)較短的單色濾光玻璃,

通常用綠色玻片。

、熒光顯微鏡

某些物質(zhì)受紫外線照射時(shí)發(fā)出熒光（可視光線），這種物質(zhì)稱熒

光物質(zhì)。例如維生素、核黃素、硫胺素等都是細(xì)胞內(nèi)的天然熒光物

質(zhì)。用熒光顯微鏡（）可以觀察這些熒光物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布位置。

另外給細(xì)胞中加入熒光染料（如中性紅、甲基綠、0丫咤橙、口丫咤黃、

剛果紅等）可使細(xì)胞中某些物質(zhì)受紫外線照射使誘發(fā)出熒光。例如固

定的切片標(biāo)本,用。丫。定橙染色,經(jīng)紫外線照射時(shí)可使細(xì)胞內(nèi)的核糖核

酸（）發(fā)生紅色熒光,脫氧核糖核酸（）發(fā)生綠色熒光。

熒光顯微鏡通常采用高壓水銀燈等做為發(fā)生紫外光的光源。在

光源和反光鏡之間放一濾光裝置，把紫外線經(jīng)過(guò)集光器照射到被檢

物體上使之發(fā)生熒光。此外,在熒光顯微鏡的接物鏡上方或日鏡下方

的鏡筒中裝設(shè)另一個(gè)濾光鏡，把剩余的紫外線吸收掉，以保護(hù)眼睛,

但使熒光能夠通過(guò)。這樣就可通過(guò)目鏡觀察細(xì)胞中的熒光現(xiàn)象（圖）0

熒光顯微鏡有時(shí)在光源與標(biāo)本間所用的透鏡是用石英制成的,

反光鏡是涂鋁的或?yàn)槭⑷忡R。

,電子顯微鏡（）

可見光的波長(zhǎng)制約了普通光學(xué)顯微鏡的分辨能力。人們?cè)诳紤]

可能替換的光源。年有人發(fā)現(xiàn)了磁場(chǎng)對(duì)電子束的聚焦效應(yīng)，接著魯

斯卡（）借助于磁力線圈把電子束聚焦于盡可能小的點(diǎn)上。這兩項(xiàng)研

究成果奠定了制作電子顯微鏡的基礎(chǔ)。年魯斯卡等人通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)

了和光學(xué)成象的幾何原理一樣，電子照射的物體也可以用磁電子透

鏡分二次放大的形式顯示出來(lái)。年魯斯卡制成了第一臺(tái)電子顯微鏡,

這臺(tái)電鏡被看作是當(dāng)代各種型號(hào)電鏡的祖先。他得到了的圖象。由

于當(dāng)時(shí)電鏡技術(shù)尚不完善，他們研究的物質(zhì)經(jīng)常被強(qiáng)烈的電子束碳

化。年魯斯卡極大的改善了電子顯微鏡，西門子公司開始批量生產(chǎn)

并成功的將電子顯微鏡推向了市場(chǎng)。年魯斯卡與掃描隧道顯微鏡的

發(fā)明人拜寧（）等一起被授于諾貝爾物理獎(jiǎng)。魯斯卡在高齡得到這次

殊榮，是為了獎(jiǎng)勵(lì)他在歲時(shí)發(fā)明的電子顯微鏡，他可能是歷史二最

老又最年輕的諾貝爾獎(jiǎng)獲得者。

電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡的幾何成象原理雖然一樣，但分辨本

領(lǐng)卻有了顯著的提高.這首先是由于電子顯微鏡是用電子束作為照

明的光源.電子束的波長(zhǎng)遠(yuǎn)比光波的波長(zhǎng)短.其次,電子顯微鏡使用

的是電子透鏡。光學(xué)透鏡是由玻璃制成的可見物質(zhì)透鏡.與此相反，

電子透鏡不是肉眼可見的物質(zhì)透鏡，他是由磁或電所行成的局部空

間來(lái)起透鏡的做用.正如光學(xué)透鏡使光線入射到玻璃時(shí)產(chǎn)生折射一

樣,電子束經(jīng)過(guò)電子透鏡也會(huì)產(chǎn)生折射.電子透鏡共有三組,分別起

類似光學(xué)顯微鏡的聚光鏡、物鏡和目鏡（投射鏡）的作用。

在電鏡中，透過(guò)被檢物的電子束投打到熒光屏上，電子能轉(zhuǎn)

換成光能,成為我們可觀察到的影象。也可以讓電子投射在感光板上,

拍被檢物的相片。那么電子束是怎么成象的呢它和光學(xué)象的形成有

何不同？在光學(xué)顯微鏡中，成象的反差度,即亮度差,是因被檢物的

不同結(jié)構(gòu)吸收光線的強(qiáng)弱程度不同造成的。就是說(shuō)，入射電子與物質(zhì)

原子碰撞后產(chǎn)生散射,被檢的不同部位有不同的散射度,這樣就形成

了電子象的濃淡.電子束的散射度是由物，本的密度與厚之積,以與加

速電壓的大小決定的。

電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)是由鏡筒（本體結(jié)構(gòu)）真空系統(tǒng)和供電系

統(tǒng)三部份組成。

鏡筒是由照明系統(tǒng)，標(biāo)本室,成象系統(tǒng)和照相裝置組成。最

上部是做為電子源的電子槍.給其中的金屬絲（鴇絲）加熱到達(dá)高溫

時(shí)電子就會(huì)從金屬表面發(fā)射出來(lái)。發(fā)射出來(lái)的電子帶負(fù)電荷,可背萬(wàn)

伏的高壓電加速。電壓越高電子加速越大，電子運(yùn)動(dòng)速度大致與電

壓平方根成正比.加速的電子束經(jīng)第一個(gè)電子透鏡（聚光鏡）集攏并

調(diào)節(jié)強(qiáng)度，照射到試料標(biāo)本上.然后在第二個(gè)電子透鏡（物鏡）成象和

放大.物鏡是電子顯微鏡的心臟.第三個(gè)電子透鏡是投影鏡（目鏡）

它起把物鏡放大的象再放大的做用，即僅放大鏡的作用.

所以，從鏡筒的主要部分的構(gòu)成看,電子顯微鏡和光學(xué)顯微

鏡是相似的。但由于電子顯微鏡中是使用電子束代替照明的光源,

故在構(gòu)造上有以下主要特點(diǎn)：

（）空氣對(duì)電子束起明顯的阻礙做用，因此鏡筒必須保持高度

真空。所以電鏡要配備真空泵裝置。

0配備有加速電子用的高壓電源.

（）為電子束的波長(zhǎng)單一化，配備有穩(wěn)壓裝置。

（）為使電子象變成肉眼可見的光學(xué)象，在觀察部位上設(shè)置熒

光屏（觀察室）和照相室.

（）放大倍贊高的電鏡在物鏡和投影鏡之間還裝置一個(gè)中間鏡,

以多一級(jí)放大。調(diào)節(jié)中間鏡的電流，可在很大范圍內(nèi)變動(dòng)放大倍數(shù)。

電鏡觀察的標(biāo)本必須是非常干燥的，同時(shí)切片必須很?。ㄒ话?/p>

位）因?yàn)殡娮邮且恢袔щ姷牧Ｗ恿?進(jìn)入被檢物體后與物質(zhì)的池子

和原子核發(fā)生作用而散射，故只能透過(guò)極薄的物體。

近年來(lái)，電鏡的研究和制造有了很大的進(jìn)展。一方面電鏡的分辨率不

斷提高，透射電鏡的分辨率由最初魯斯卡發(fā)明電鏡的提高到了一，晶

格分辨率已接近;另一方面除透射電鏡（掃描電鏡（）分析電

鏡（）外，還發(fā)展了其他種電鏡。如高壓電鏡（），加速電壓在以上

的電鏡即為高壓電鏡，如果電壓超過(guò)就稱為超高壓電鏡。目前世界上

最高的加速電壓可以達(dá)到，電鏡體積龐大，相當(dāng)于二層樓房的高度。

高壓電鏡主要特點(diǎn)是穿透力強(qiáng)，可用于觀察較厚的樣品，整體培養(yǎng)的

細(xì)胞不需超薄切片即可觀察內(nèi)部的三維微細(xì)結(jié)構(gòu)，如微絲、微管等。

.掃描隧道顯微鏡（，簡(jiǎn)稱）。

人類永遠(yuǎn)不會(huì)停止對(duì)微觀世界的探索，在電子顯微鏡發(fā)明大約

半個(gè)世紀(jì)后，年拜寧()等又發(fā)明了掃描隧道顯微鏡它的成象原理

完全不同于光鏡和電鏡。?；诹孔恿W(xué)原理，研究者們發(fā)展出了

一系列高分辨顯微鏡。這些發(fā)明為人類打開了通向微觀世界的一扇

又一扇大門，使人類真正進(jìn)入了納米世界。

是這類顯微鏡的代表，它能探索微觀世界物質(zhì)表面原子排列的

狀況。的探頭有一根探針，針尖只有一個(gè)原子的大小，探針的針尖

接近但不接觸觀測(cè)樣品的表面并且同時(shí)進(jìn)行掃描.根據(jù)量子物理學(xué)

原理，當(dāng)針尖上的原子與樣品表面的原子的距離小于納米時(shí)，針尖

和樣品間會(huì)產(chǎn)生隧道效應(yīng)，即產(chǎn)生隧道電流.通過(guò)記錄隧道電流的變

化就可以獲得樣品表面原子排列的情況并把它轉(zhuǎn)化為圖像。

具有其他顯微鏡不可比擬的功能和特點(diǎn)：0具有高分辨能力。

它平行于物體表面的分辨率,即側(cè)分辯率可以達(dá)到一，而垂直于物體

表面方向的分辨率,即縱分辯率可以達(dá)到納米。(2)具有搬移能力。

不僅可以直接觀察物質(zhì)表面的原子排列情況，而且還可以通過(guò)探針

對(duì)物質(zhì)表面的原子或分子進(jìn)行搬移.從而人們可以按著自己的意愿

在原子水平上進(jìn)行重構(gòu)或組建新的材料。0具有刻蝕能力。能對(duì)

物質(zhì)表面進(jìn)行刻蝕，通過(guò)計(jì)算知道一個(gè)大頭針大小的地方就能記錄

下來(lái)象“紅樓夢(mèng)”那樣的一部書.這為制作高密度信息儲(chǔ)存文件和納

米的電子原件提供了新途徑。0具有在多種多樣下的工作能刀。

對(duì)于生物學(xué)研究尤其重要的是可以在真空、大氣等多種條件下工作。

()不破壞樣品，在工作時(shí)既不接觸樣品又沒(méi)有高能電子束的轟擊.

因此，可以避免樣品的變形?？傊挠^察到的原子是目前人類所

能直接看到的微觀世界的最小尺度，這項(xiàng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科

學(xué)的研究領(lǐng)域。用得到的照片使人類第一次清楚的看到了它的表面

形態(tài)?？梢钥隙?，等基于量子力學(xué)原理倉(cāng)」建的顯微鏡將在納米生物

學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

第二節(jié)細(xì)胞組分與功能的分析方法

首先人們利用一系列顯微鏡對(duì)細(xì)胞與其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了卓有成效的

觀察，并且結(jié)合一些化學(xué)手段確定了細(xì)胞器與一些大分子聚合物在

細(xì)胞中的排布.如對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞核、染色體、細(xì)胞分裂等的觀察。

在深入研究中人們不禁要問(wèn)，這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)組成如何？它們

在執(zhí)行著什么樣的功能？要解決這些問(wèn)題只靠觀察手段就不夠了。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展人們逐步創(chuàng)造了一系列分析細(xì)胞組分與功能的

方法。這些方法大致可分為三種：第一種方法是把細(xì)胞與大分子分

離出來(lái)進(jìn)行研究，即分離分析法；第二種是不破壞細(xì)胞或組分，在

原位進(jìn)行組分和功能的研究，既原位分析法.第三種則是在細(xì)胞或細(xì)

胞組分生活狀態(tài)下進(jìn)行的動(dòng)態(tài)分析法。當(dāng)然觀察方法和分析的方法

并沒(méi)有嚴(yán)格的界限。正是觀察方法和分析方法有機(jī)的結(jié)合才使得細(xì)

胞生物學(xué)有了長(zhǎng)

足的進(jìn)步。

一、分離分析法

、細(xì)胞分離技術(shù)

要對(duì)不同類型的細(xì)胞與組分進(jìn)行詳盡的分析研究，首先要

得到一定量的同一類型的細(xì)胞，進(jìn)而才能得到純化的細(xì)胞器與其它

細(xì)胞組分。

可以用蛋白水解酶（胰蛋白酶和膠原酶）和鈣整合劑乙二

胺四乙酸（）處理組織，從中得到大量分上散較好的細(xì)胞懸液。再利

用細(xì)胞不同的物理性質(zhì)，通過(guò)沉降和離心把大小不同的細(xì)胞或輕重

不同的細(xì)胞分離開。

利用免疫技術(shù)分離細(xì)胞是比較先進(jìn)的方法。將某一種類型

細(xì)胞表面特異性抗原的抗體與某種材料結(jié)合（如膠元、多糖小珠或

塑料）形成集合表面。這樣當(dāng)各種細(xì)胞通過(guò)這一集合表面時(shí)，只有

被這種抗體識(shí)別的細(xì)胞才能粘附在集合表面，然后用輕微的振蕩或

用酶破壞可溶性基質(zhì)（如膠元）就可將同一類型的細(xì)胞回收。

目前流式細(xì)胞術(shù)和分類術(shù)（，）是一項(xiàng)較新的開拓性技

術(shù)，可以用此項(xiàng)技術(shù)來(lái)分離細(xì)胞。首先要用熒光染料偶聯(lián)的抗體來(lái)

標(biāo)記需要分離的細(xì)胞，然后招這種混合的單細(xì)胞懸液樣品和鞘流液

（蒸憎水或等滲鹽水）由氣體壓力裝置送進(jìn)流動(dòng)室，使樣品和鞘流

液同軸流動(dòng)。鞘流管末端成圖錐形，具尖端有一直徑的孔，這樣迫

使細(xì)胞排成單行流出鞘流管尖端小孔進(jìn)入樣品流與激光束交叉區(qū)既

檢測(cè)區(qū)。。通過(guò)振動(dòng)蕩流動(dòng)室時(shí)細(xì)胞流束已成為小水滴。荷電環(huán)系

對(duì)帶有熒光細(xì)胞的小水滴充電。當(dāng)帶電小水滴通過(guò)高壓偏轉(zhuǎn)板時(shí)，

充電的小水滴就會(huì)偏離原來(lái)的流向，而不帶電的小水滴（其中含有

未標(biāo)記細(xì)胞）不偏向。收集偏向的小水滴就可以得到大量標(biāo)記的特

殊細(xì)胞。

現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)是結(jié)合計(jì)算機(jī)科學(xué)、激光技術(shù)、單克隆抗

體制劑、定量細(xì)胞化學(xué)等的一項(xiàng)綜和技術(shù)，它不但可以分離細(xì)胞而

且還可以測(cè)量細(xì)胞的多種參數(shù)，其中包括象細(xì)胞大小、形狀等不經(jīng)

染色處理就可直接測(cè)量的固有（）參數(shù)，還包括經(jīng)過(guò)的熒光劑染色后

可測(cè)出的細(xì)胞含量、含量和細(xì)胞總蛋白量等的外源（）參數(shù)。例如當(dāng)

排成單列的細(xì)胞通過(guò)激光束時(shí)，熒光染色的單個(gè)細(xì)胞受到激光束的

激發(fā)，會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，信號(hào)檢測(cè)器可測(cè)定出標(biāo)記細(xì)胞上的熒光強(qiáng)

度。從而對(duì)許多外源參數(shù)進(jìn)行測(cè)定（表）。

流式細(xì)胞計(jì)可在小時(shí)內(nèi)分類收集一億八千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，純度

可達(dá)一?？稍诜昼妰?nèi)測(cè)出個(gè)細(xì)胞的、、蛋白質(zhì)含量和細(xì)胞體積。此

儀器應(yīng)用廣泛但價(jià)格十分昂貴（圖）。

、細(xì)胞器與生物大分子的分離技術(shù)

通過(guò)細(xì)胞分離方法可以得到純化的細(xì)胞群體，并且可以在細(xì)

胞整體水平上進(jìn)行研究。如果要深入研究各種細(xì)胞器與細(xì)胞內(nèi)含物

就需要用低滲、超聲波等方法使細(xì)胞崩解，造成細(xì)胞勻漿，這一過(guò)

程叫做細(xì)胞的勻漿化（）。然后便可以根據(jù)需要招亞細(xì)胞組分或各種

顆粒分別分離出來(lái)。分離的方法主要應(yīng)用的是離心技術(shù)。

離心機(jī)是一種借離心力把顆粒從中心向外推移的機(jī)器，當(dāng)

離心力超過(guò)地球引力時(shí)，懸浮在液體里的顆粒就會(huì)離開中心向外沉

降。用普通離心機(jī)可以很快使紅細(xì)胞沉降下來(lái)，也可把鮮奶分成奶

油和較重的脫脂妞兩部分。然而要分離亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)只有普通離心機(jī)

是不夠的。年代，瑞典化學(xué)家斯維德伯格（）發(fā)明了一種超速離心

機(jī)，它的轉(zhuǎn)數(shù)可達(dá)每分鐘十幾萬(wàn)轉(zhuǎn)，產(chǎn)生的離心力相當(dāng)于地心引力

的幾十萬(wàn)倍。超速離心機(jī)的出現(xiàn)極大的推動(dòng)了細(xì)胞生物學(xué)的研究.

有了一系列離心機(jī)還不夠，為了更精確的分離研究對(duì)象，人們

還創(chuàng)造了各種離心方法以適應(yīng)不同研究層次的需要。

0差速離心法（）

差速離心法是利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同的離心

力，將各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分離開.勻漿液在離心場(chǎng)中，不同

大小的顆粒沉向離心管底部的速度不同，當(dāng)離心力不高并且離心時(shí)

間不長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞核首先沉到管底。取出上清液進(jìn)行離心并加大離心

力，這時(shí)可分離出線粒體，這樣進(jìn)行下去不斷增大離心力，最后可

分離出核糖體（圖）O怎樣對(duì)分離出的物質(zhì)進(jìn)行純度鑒別呢？一般

有兩種方法，一種是用電鏡作形態(tài)學(xué)鑒定。更為簡(jiǎn)便的是利用各種

細(xì)胞器的特征酶或特殊分子做生化分析。

用差速離心法對(duì)細(xì)胞器的分離只是初步的，要取得比較純

的細(xì)胞器還需要進(jìn)一步的分離純化。另外，經(jīng)離心分離出核穗體以

后所剩的上清液是可溶性部分和極微小的顆粒與一些生物大分子所

組成。這些成分需要用更產(chǎn)格的超速離心才能分離出來(lái)，為此人們

又發(fā)展出了密度梯度離心法。

（）密度梯度離心法（）

這種方法是利用離心溶液形成梯度來(lái)維持重力的穩(wěn)定性和抑制

對(duì)流的。這需要在溶液中加入化學(xué)惰性物質(zhì)，如蔗糖、甘油與鹽類

（如氯化艷、氯化鋤）。這些物質(zhì)不影響分離物的物理與化學(xué)性質(zhì),

分離物的密度一定要在梯度柱密度的范圍內(nèi)，經(jīng)高速離心后，不同

密度的分離物就會(huì)集中在等密度帶中而得到相互的分離.

①蔗糖密度梯度離心這種方法比較適合于對(duì)細(xì)胞器的進(jìn)一步

分離（表）。這需要預(yù)先制成不同濃度的蔗糖液（一般濃度在一

或一）。用一定的方法在離心管中做成自下而上遞減的濃度梯度，

將待分離的懸液加在最上面，經(jīng)超速離心，不同大小、密度的顆粒

由于沉降速率不同，它們揩會(huì)分別集中在不同的區(qū)帶中，這樣就達(dá)

到了分離它們的目的（圖）o

②氯化艷（）密度梯度離心氯化艷是重金屬鹽類，它的溶解度

高，其溶液密度可達(dá)，它在離心場(chǎng)中會(huì)自動(dòng)形成密度梯度。用來(lái)分

離的物質(zhì)可直接和金屬氯化銅溶液混合，然后進(jìn)行等密度離心。這

種方法適合于測(cè)定大分子或顆粒的浮力密度（圖）。也就是說(shuō)，

它是根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的浮力密度的差異而不是根據(jù)他的大小來(lái)進(jìn)行分

離的,比如線粒體、溶酶體或過(guò)氧化物酶體的大小相近，但密度不同,

我們可以根據(jù)浮力密度對(duì)它們做進(jìn)一步的分離。這種方法的精確和

靈敏是令人信服的，早在年人們就用氯化艷密度梯度離心技術(shù)將含

有15標(biāo)記的細(xì)菌和未標(biāo)記的細(xì)菌分子分離開，這個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)直接證明

了的半保留復(fù)制。

利用離心特別是超速離心技術(shù)對(duì)細(xì)胞與其組分進(jìn)行分離分析,

在細(xì)胞生物學(xué)的研究中起著極重要的作用。例如，從對(duì)分離純化出

的線粒體和葉綠體的研究中人們了解到了這些細(xì)胞器在能量轉(zhuǎn)化過(guò)

程中的作用。用分離分析方法可以使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的封閉泡互

相分離開。粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)分離形成的小泡稱微粒體0,它給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

的研究帶來(lái)了極大的方便.正是對(duì)微粒體分離研究使我們得到了關(guān)

于分泌蛋白合成機(jī)制等許多成果。又如，在蛋白質(zhì)合成機(jī)制的研究

中，當(dāng)初發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞粗提液中能使翻譯成蛋白質(zhì)。然后將粗提液分

步分離，依次得到了核糖體、和各種酶，是否是這些物質(zhì)構(gòu)成了蛋

白質(zhì)合成體系呢？我們可以向這個(gè)體系中加入或不加入各種純組

分，這樣就可以研究出每個(gè)組分在整個(gè)過(guò)程中發(fā)揮準(zhǔn)確作用。事實(shí)

上，在研究細(xì)胞與其組分的功能過(guò)程中,分離分析的方法是在構(gòu)建一

種非細(xì)胞體系（）。這種體系來(lái)源于細(xì)胞，但不具有完整的細(xì)胞結(jié)

構(gòu)，它包含了部分細(xì)胞提取物，這些提取物能夠進(jìn)行正常的生物學(xué)

反應(yīng)。用這種方法使細(xì)胞中各種生物學(xué)過(guò)程相互分開，不受細(xì)胞中

復(fù)雜副反應(yīng)的干擾，因而可以確定這些生物學(xué)過(guò)程的詳細(xì)的分子機(jī)

制。近年來(lái)，非細(xì)胞體系有了更廣泛的應(yīng)用，以非洲瓜蟾卵提取物

非細(xì)胞體系為例，來(lái)自非洲瓜蟾的卵首先去膠膜后，經(jīng)活化、裂解、

然后超速離心，去掉上層脂類和下層卵黃、色素顆粒后剩下的提取

物即是非細(xì)胞反應(yīng)體系。向該體系中加入外源，孵育一段時(shí)間后即

可重構(gòu)成新的細(xì)胞核。人們利用這一體系研究探討了許多細(xì)胞生物

學(xué)的重要問(wèn)題。女［細(xì)胞周期調(diào)空、復(fù)制，核膜與染色質(zhì)組裝、核質(zhì)

運(yùn)輸?shù)取?/p>

需要說(shuō)明的是，離心技術(shù)有二個(gè)主要參數(shù).一是離心力，一般用

離心機(jī)的每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)。來(lái)表示。文獻(xiàn)中也經(jīng)常直接用離心力（）來(lái)

表示。它們之間的換算關(guān)系是：。二是沉降系數(shù)0,它是用

來(lái)表示大分子沉降速度的，各種大分子顆粒均具有一定的沉降系數(shù)。

為了紀(jì)念諾貝爾獎(jiǎng)獲得者斯維德伯格，沉降系數(shù)的單位用了他的名

字命了名，即斯維德伯格單位（），秒，簡(jiǎn)稱。

二、細(xì)胞的原位分析方法

人們除了用分離的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行研究外，同時(shí)還發(fā)展出了一

系列對(duì)細(xì)胞進(jìn)行原位分析的方法。顧名思義，這種方法要求被測(cè)定

的物質(zhì)必須保持在細(xì)胞的原來(lái)位置不動(dòng)。一般的細(xì)胞化學(xué)方法都屬

于這一類。比如為了測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂類等細(xì)胞組分，

通常利用一些顯色劑與被檢物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性的結(jié)合，通

過(guò)這種結(jié)合所產(chǎn)生的顏色和顏色深淺度的不同來(lái)判斷各種物質(zhì)在細(xì)

胞中的分布和含量。四氧化械與不飽和脂肪酸反應(yīng)呈黑色，用以證

明脂肪滴的存在。用氮汞試劑與組織中蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨酸殘基

反應(yīng),形成紅色沉淀。這是著名的米倫()反應(yīng)。原位分析的方法很多,

我們?cè)谶@里僅作一簡(jiǎn)單的介紹.

免疫細(xì)胞化學(xué)法

在一些經(jīng)典的蛋白質(zhì)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)中，如米倫反應(yīng)、重氮反應(yīng)

等，都只是一種一般蛋白質(zhì)的定位反應(yīng)，如果想了解其一特殊蛋白

質(zhì)的情況需要用特殊蛋白質(zhì)的原位分析法。近些年發(fā)展起來(lái)的免疫

細(xì)胞化學(xué)法。開創(chuàng)了這方面研究工作的新領(lǐng)域.這項(xiàng)技術(shù)主要是利

用抗原和其相應(yīng)的抗體能作特異性結(jié)合即免疫反應(yīng)這一原理，來(lái)定

位組織或細(xì)胞中蛋白質(zhì)抗原成分的一類技術(shù)。我們可以利用這一技

術(shù)來(lái)對(duì)蛋白類抗原進(jìn)行定位定性分析。雖然抗原和抗體的結(jié)合具有

高度的敏感性和特異性，但是抗體與抗原的結(jié)合是看不見的，為了

解決這一問(wèn)題，早在四十年代巧妙的使熒光素和抗體項(xiàng)結(jié)合，然后

用這種被標(biāo)記的抗體同被檢測(cè)的抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)，這樣就很容易

在熒光顯微鏡下檢測(cè)到組織或細(xì)胞中的抗原物質(zhì)。從而創(chuàng)建了這項(xiàng)

技術(shù),后來(lái)，用于標(biāo)記抗體的物質(zhì)不斷得到改進(jìn)，先后出現(xiàn)了免疫酶

標(biāo)記技術(shù)、免疫鐵蛋白技術(shù)。特別是年和創(chuàng)造的免疫膠體金技術(shù)是

日前最受歡迎的免疫電鏡技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)的特點(diǎn)是，膠體金能迅速

而穩(wěn)定地與蛋白質(zhì)即抗體相結(jié)合.這是一種由于蛋白質(zhì)被膠體金表

面負(fù)電荷吸引而結(jié)合的過(guò)程。這種結(jié)合主要是物理過(guò)程，不會(huì)影響

蛋白質(zhì)的活性.另外金顆粒容易識(shí)別，能產(chǎn)生強(qiáng)烈的二次電子，是理

想的掃描電鏡的標(biāo)記物。今天，免疫電鏡技術(shù)已得到了廣泛的應(yīng)用,

如分泌蛋白的研究、胞內(nèi)酶的研究、一些結(jié)構(gòu)蛋白的研究，包括膜

蛋白的定位與細(xì)胞骨架蛋白的定位等。膠體金不但能與免疫球蛋白

即抗體相結(jié)合形成金標(biāo)記抗體，而且還可以同其他蛋白相結(jié)合形成

金標(biāo)記酶、金標(biāo)記凝集素等。因此金標(biāo)記酶不僅可用于光鏡和電鏡

的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，還可以用于其它物質(zhì)的檢測(cè)。

孚爾根。反應(yīng)

年德國(guó)化學(xué)家孚爾根()在研究核酸時(shí)找到了一種方法，

它只能使著色，而不著色。他發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞核里，特別是在染色體里。

他用此方法證明，普遍存在于動(dòng)植物細(xì)胞核中。后來(lái)，人們稱這種

能特異顯示存在部位的方法為孚爾根反應(yīng)。這一技術(shù)的基本步驟是:

首先用酸處理已固定好的材料，酸水解可以除去,保留，并在的膘吟

一脫氧核糖昔鍵水平上除去瞟瞪，使脫氧核糖的醛基暴露。然后用

希夫試劑()處理，所暴露的自由醛基就會(huì)與希夫試劑起反應(yīng)而呈現(xiàn)

紫紅色.在顯微鏡下可以看到紫紅色的核，無(wú)色的胞質(zhì)和核仁,即細(xì)

胞核的福爾根反應(yīng)為正，而胞質(zhì)為負(fù)反應(yīng)。核中異染色質(zhì)區(qū)為強(qiáng)的

正反應(yīng)，核仁為負(fù)反應(yīng)。

原位雜交技術(shù)

福爾根技術(shù)可使我們了解到一般在細(xì)胞中的存在位置.但

如果我們想知道某段特殊核甘酸順序在染色體上或在細(xì)胞中的確切

位置，福爾根技術(shù)便無(wú)能為力了，這需要用原位雜交技術(shù)。

原位雜交（）是一項(xiàng)核酸分子雜交技術(shù)（）。其原理

是，兩條具有互補(bǔ)核甘酸順序的單鏈核苜酸分子片斷,在一定條件下

通過(guò)氫鍵的結(jié)合形成一一或一的雙鏈分子。進(jìn)行原位雜交首先要制

作探針，即對(duì)一段特異的核酸序列進(jìn)行放射性同位素或熒光素的標(biāo)

記.然后要把所要研究的樣品如細(xì)胞或染色體固定于載玻片上,并使

或原位變性,再注入探針，使樣品與標(biāo)記的核酸進(jìn)行原位雜交反應(yīng)。

將未反應(yīng)的標(biāo)記核酸分離后，用放射自顯影術(shù)或螢光技術(shù)對(duì)雜交分

子進(jìn)行觀察和定位。例如，年等從細(xì)胞的多核糖體中分離出，并以儂

標(biāo)記制成探針，并測(cè)探出的基因在染色體上的位置。具體過(guò)程是這

樣的，首先對(duì)載片上的人體細(xì)胞中期染色體進(jìn)行原位變性，并加入

探針?這時(shí)，探針只能和產(chǎn)生它的模板互補(bǔ)，即進(jìn)行分子雜交，而其

他部位則不行。放射自顯影暴露二個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)在所有制片的染色

體組中，一對(duì)一號(hào)染色體均被標(biāo)記，標(biāo)記的位置是短臂末端，這說(shuō)

明基因位于第一號(hào)染色體的短臂末端。原位雜交技術(shù)首先是在光鏡

水平上發(fā)展起來(lái)的。近年來(lái)隨著免疫電鏡技術(shù)的不斷進(jìn)步，電鏡原

位雜交技術(shù)也得到了發(fā)展。電鏡原位雜交和光鏡原位雜交的基本原

理是一致的，區(qū)別是探針的標(biāo)記物不同，一般以生物素等一些小分

子取代同位素或螢光素來(lái)標(biāo)記特異核甘酸序列來(lái)制作探針進(jìn)行原位

雜交。然后用與膠體相連的生物素的特異性抗體對(duì)原位雜交樣品進(jìn)

行免疫反應(yīng)，這樣就可在電鏡下觀察到探針的位置，從而把特異核

酸序列的定位與細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)分析結(jié)合了起來(lái)。

三、細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析的方法

事實(shí)上，在生活狀態(tài)的細(xì)胞中生物大分子總是呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化

的。人們?cè)缇拖Ｍ苷业揭恍┓椒?可以對(duì)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)內(nèi)分

析研究.

第一位在這個(gè)方向上努力的是德國(guó)生物化學(xué)家努普（）。早

在年他就用苯環(huán)標(biāo)記脂肪分子對(duì)脂肪代謝進(jìn)行研究，得出了在體內(nèi)

脂肪代謝過(guò)程中脂肪分子每次斷裂下兩個(gè)碳原子的結(jié)論。這個(gè)結(jié)果

被年后的進(jìn)一步研究所證實(shí)。年德國(guó)化學(xué)家帕內(nèi)斯0等人想到可

以用放射性同位素標(biāo)記生物大分子來(lái)研究大分子在細(xì)胞中的活動(dòng)和

代謝情況。這樣就有了放射自顯影技術(shù)0O

放射自顯影技術(shù)是利用放射性同位素的電離輻射對(duì)含有乳膠的

感光作用來(lái)研究生物大分子在細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程的一種技術(shù)。開始，

帕內(nèi)斯等曾用放射性鉛作為標(biāo)記，然而鉛的同位素極容易打亂活細(xì)

胞正常的代謝過(guò)程。后來(lái)逐漸摸索到了一些常用的同位素（表）。

這些同位素都是細(xì)胞生命活動(dòng)中基本的起重要作用的元素。放射性

同位素技術(shù)所以能被應(yīng)用是由于存在兩個(gè)基本條件，一是放射性同

位素不影響機(jī)體的正常代謝。二是機(jī)體組胞對(duì)某種元素與其不穩(wěn)定

同位素“一視同仁”O(jiān)該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用使得細(xì)胞生物學(xué)取得了很大

的進(jìn)展.例如象檸檬酸循環(huán)，尿素循環(huán)過(guò)程的發(fā)現(xiàn)；首次證明核仁是

合成的場(chǎng)所；半保留復(fù)制的證明等都是應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)得到的成果。

制造帶有放射性同位素的小分子并不復(fù)雜，只要把普通化合物

放在核反應(yīng)堆里用中子轟擊，取出后就帶有放射性同位素了。如今

用于標(biāo)記的幾乎所有小分子前體都可以通過(guò)商品銷售得到。囚此現(xiàn)

在這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用已十分廣泛。這種方法的基本過(guò)程是，先使紐胞

含有示蹤原子（例如

3143214323214323232143232323214323232323214323232323232M323232323232321132323232323232321432323232323232323214323232

32323232323232M3232323232323232323232I4323232323232323232323232M32323232323232323232323232或其他）的化

合物，然后把這種組織細(xì)胞做成切片，使液體乳膠涂于其上，經(jīng)過(guò)

一定時(shí)間的暴光（即放射性物質(zhì)放出的射線落在乳膠上使其溟化銀

還原而析出金屬銀，這個(gè)過(guò)程稱為自顯過(guò)程，亦稱曝光），再進(jìn)行

顯影和定影。根捱乳膠上出現(xiàn)的銀粒在組胞中的位置，便可判斷放

射性物質(zhì)（或由這種放射性物質(zhì)以與其他物質(zhì)合成的化合物）在細(xì)

胞內(nèi)的分布.這種方法的基本過(guò)程是,先使細(xì)胞含有示蹤原子的化合

物，然后把這種組織細(xì)胞制成切片，使液體乳膠涂與其上，經(jīng)過(guò)一

定的時(shí)間暴光（即放射性物質(zhì)放出的射線落在乳膠上使其溟化銀還

原而析出金屬銀,這個(gè)過(guò)程稱為自選過(guò)程，亦稱暴光），在進(jìn)行顯影和

定影手續(xù)。根據(jù)乳膠上出顯的銀粒在細(xì)胞中的位置，便可判斷放射

性的物質(zhì)（或由這種放射性物質(zhì)以與它物質(zhì)合成的化合物）在紐胞

內(nèi)的分布.

自顯過(guò)程的具體操作步驟是：（）:將染色或未染色的切片標(biāo)本

先覆蓋一層明膠保護(hù)膜；（）在暗室聘凝膠;士液體加熱融化，然后招盛

乳膠的小杯放入攝氏度的水浴鍋中，再招切片浸入乳膠內(nèi)片刻；（）

取出載片，立于染色缸內(nèi)自干，或揩去載片被面的乳膠，平放在溫臺(tái)

內(nèi)烘干；（）將干燥的乳膠片放入暴光暗匣內(nèi),再攝氏度低溫下暴光；（）

顯影定影后，再用常規(guī)方法制片,最后用樹膠封藏.

制備電子顯微鏡的放射自顯影標(biāo)本的程序是把用3等放射性同

位素標(biāo)記的化合物引入組織細(xì)胞,制成超薄切片,放在有支持膜（火

棉膠加碳）的載網(wǎng)二，噴碳膜后再涂一薄層核乳膠。然后放在暗處暴

光（暴光時(shí)間的長(zhǎng)短視條件而不同，例如溫度,切片中放射性物質(zhì)的

量和半衰期等，常要靠實(shí)踐來(lái)確定，一般要幾周乃至數(shù)月的時(shí)間），

暴光后進(jìn)行顯影定影和沖洗.再經(jīng)電子染色制成的標(biāo)本即可在電鏡

下觀察（圖）o

放射自顯影術(shù)不但在定位研究上有靈敏度高，定位精確的

特點(diǎn)，它還是動(dòng)態(tài)研究中最有效的手段。針對(duì)活細(xì)胞一般都采用放

射自顯影的追蹤標(biāo)記也稱脈沖標(biāo)記（-）的方法。這種方法是先用帶

同位素標(biāo)記的前體分子摻入到生活細(xì)胞的代謝中去，標(biāo)記一段時(shí)間

后便把它徹底洗掉，再用不帶標(biāo)記的前體分子代替。然后在不同時(shí)

間取樣并分析同位素的量和它所在的位置，從而了解它們的代謝途

徑。許多生物大分子在細(xì)胞中的合成、修飾、排出、蓄積、更新等

作用的機(jī)制和部位的研究結(jié)果都是利用脈沖標(biāo)記的方法得到的.

第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)和單克隆抗體技術(shù)

-細(xì)胞培養(yǎng)

在細(xì)胞生物學(xué)與其它有關(guān)細(xì)胞的研究中，如何取得充足的高質(zhì)

量的細(xì)胞始終是一個(gè)需要解決的基本問(wèn)題。特別是高等動(dòng)物或人的

細(xì)胞.從生物個(gè)體上取細(xì)胞不但費(fèi)用貴而且不方便。解決這一問(wèn)題

的有效方法就是體外培養(yǎng)細(xì)胞。實(shí)際上人們?cè)缇烷_始了細(xì)胞的體外

培養(yǎng)工作。

年，德國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)雞脛細(xì)胞可在溫?zé)岬纳睇}水中存活一段時(shí)

間，他稱這項(xiàng)試驗(yàn)為，即體外種植的意思。年美國(guó)動(dòng)物學(xué)家從

兩棲類胚胎中取下一塊神經(jīng)管組織，放在一滴淋巴液中作懸滴培養(yǎng)，

他觀察到了神經(jīng)管分化或神經(jīng)元，并且向培養(yǎng)液中伸出了軸突。這

些可以說(shuō)是細(xì)胞培養(yǎng)的開拓性工作。從這些工作可以看出細(xì)胞培養(yǎng)（）

是指將細(xì)胞從機(jī)體中分離出來(lái)，進(jìn)行體外培養(yǎng)的技術(shù)。近年來(lái)，這

項(xiàng)技術(shù)得到了很大的發(fā)展，許多動(dòng)植物細(xì)胞都可以在人工配制的特

定的培養(yǎng)基中存活，有的培養(yǎng)細(xì)胞還可以分裂增殖甚至分化。目前

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已在細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)，遺傳學(xué)，免疫學(xué)等許

多領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

人們?cè)谘芯考?xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，雖然動(dòng)物細(xì)胞的種類繁多，

性質(zhì)各異，但它們?cè)隗w外培養(yǎng)的生長(zhǎng)方式上大致可分為二種類型.一

類是貼壁依賴性細(xì)胞，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都屬這一類型.另一類型是非

貼壁依賴性細(xì)胞，比如來(lái)源于血液，淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)

胞屬于這一類型。

0貼壁培養(yǎng)

剛接種的細(xì)胞常成圓形并游離于培養(yǎng)液中，經(jīng)數(shù)十分鐘到數(shù)小

時(shí)后細(xì)胞從游離期進(jìn)入貼附期，細(xì)胞伸展并貼附于瓶壁。這叫細(xì)胞

貼壁。圓形細(xì)胞一經(jīng)貼壁就立刻鋪展成多種形態(tài)并開始有絲分裂，

細(xì)胞在分裂過(guò)程中并沒(méi)有停止移動(dòng)，由于細(xì)胞數(shù)目不斷增多，細(xì)胞

間的距離也越來(lái)越小了。平展生長(zhǎng)數(shù)天后就會(huì)形成致密的細(xì)胞單層.

這時(shí)細(xì)胞彼此之間已經(jīng)接觸，這使細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)受到抑制，這種現(xiàn)象

叫接觸抑制()。然而接觸抑制實(shí)際上只抑制了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)而并沒(méi)有

抑制細(xì)胞的分裂。所以我們看到細(xì)胞長(zhǎng)滿生存平面后仍能繼續(xù)分裂,

直到細(xì)胞達(dá)到一定密度，才停止分裂。這后一種抑制叫密度抑制()。

這時(shí)如果要細(xì)胞繼續(xù)分裂增殖就要進(jìn)行與時(shí)的分散，分瓶接種于新

鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。這一過(guò)程叫傳代培養(yǎng)OO這種直接從有機(jī)

體取出的細(xì)胞培養(yǎng)至第一次傳代為止，稱原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代培養(yǎng)

的細(xì)胞一般傳到代左右，大部份細(xì)胞才會(huì)進(jìn)入退化期，出現(xiàn)細(xì)胞的

大量死亡。有人據(jù)此而把培養(yǎng)代以前的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。

經(jīng)過(guò)代培養(yǎng)的細(xì)胞仍有極少數(shù)存活下來(lái)，這些細(xì)胞往往會(huì)繼續(xù)順利

傳代一次。雖然這些細(xì)胞的形態(tài)有了很大的變化，但它們?nèi)员３种?/p>

染色體的倍體數(shù)量和接觸抑制的行為。多數(shù)學(xué)者把這種傳代細(xì)胞稱

為細(xì)胞株()O經(jīng)過(guò)次左右傳代的細(xì)胞，已不能再繼續(xù)正常生長(zhǎng)了。

然而在“漫長(zhǎng)”的細(xì)胞傳代過(guò)程中可能會(huì)有極少數(shù)細(xì)胞發(fā)生了帶有

癌變特點(diǎn)的遺傳性突變.發(fā)生突變的細(xì)胞可能無(wú)限制的進(jìn)行分裂和

增殖，這種能無(wú)限傳代的細(xì)胞叫作細(xì)胞系O0將初始細(xì)胞在體外

轉(zhuǎn)化成能無(wú)限傳代的細(xì)胞的過(guò)程叫作建系()這些細(xì)胞被稱為轉(zhuǎn)化

細(xì)胞。轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特點(diǎn)是染色體數(shù)量明顯改變，一般呈亞倍體或非

正倍體。細(xì)胞失去接觸抑制行為，容易傳代培養(yǎng)。著名的細(xì)胞就是

年從一位名叫的美國(guó)婦女的子宮頸上皮癌分離出來(lái)的細(xì)胞系.目前

這一細(xì)胞系已遍布世界各地的實(shí)驗(yàn)室，但仍沒(méi)有壽終正寢的跡象“

表列出了一些常用的細(xì)胞系。

細(xì)胞系細(xì)胞來(lái)源

纖維細(xì)胞（小鼠）

纖維細(xì)胞（敘利亞）

上皮細(xì)胞（人）

腎細(xì)胞（）

卵巢細(xì)胞（中日）

上皮細(xì)胞（袋）

成肌細(xì)胞（大鼠）

漿細(xì)胞（小鼠）

體外培養(yǎng)的細(xì)胞畢竟和體內(nèi)的細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境有很大的差別，

因此它們的細(xì)胞形態(tài)也會(huì)有較大的變化,體外培養(yǎng)細(xì)胞一般會(huì)呈現(xiàn)

兩種基本形態(tài)：成纖維樣細(xì)胞（）與上皮樣細(xì)胞（）

0懸浮培養(yǎng)

非貼壁依賴性細(xì)胞如雜交瘤細(xì)胞等比較適合于懸浮培養(yǎng)，它是

指細(xì)胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長(zhǎng)的過(guò)程。這種方法是在微生物發(fā)酵

的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。但由于動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁的保護(hù)，它不能

耐受劇烈的攪拌和通氣。因此在許多方面又與發(fā)酵培養(yǎng)不同。

懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，有成熟的理論計(jì)算，可以借

鑒微生物發(fā)酵的部分經(jīng)驗(yàn)。它的不足是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度較低。

轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮培養(yǎng)有潛在的致癌危險(xiǎn)等。

二植物細(xì)胞培養(yǎng)

德國(guó)植物學(xué)家從年開始共做了年的細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，從多種植物的

葉柵欄組織，莖髓薄壁組織，表皮等分離出單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)相信植

物體細(xì)胞有再生完整植株的可能性。遺憾的是由于當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件

的限制，他始終未能觀察到培養(yǎng)細(xì)胞的分裂現(xiàn)象。真正的植物紐胞

培養(yǎng)技術(shù)是世紀(jì)年代至今逐漸發(fā)展起來(lái)的。目前這項(xiàng)技術(shù)正在農(nóng)業(yè)、

醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。并取得了極大的效益。據(jù)報(bào)道，全

美國(guó)的藥方中四分之一是含有來(lái)源于植物的藥品。

植物細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)不同對(duì)象可分為原生質(zhì)體培養(yǎng)和單倍體細(xì)胞

培養(yǎng)。

原生質(zhì)體培養(yǎng)去壁的植物細(xì)胞稱原生質(zhì)體（）。原生質(zhì)體類

似動(dòng)物細(xì)胞。它既可供基礎(chǔ)理論的研究，也可作應(yīng)用的研究.其主要

方法步驟是：①原生質(zhì)體的制備；②原生質(zhì)體的培養(yǎng)；③原生質(zhì)體

培養(yǎng)到細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)渡；④愈傷組織或脛狀體的形成；⑤植株再生

（圖）.也可以用不同植物的原生質(zhì)體進(jìn)行融合與體細(xì)胞的雜交，

由此而獲得體細(xì)胞雜交的植株。近年來(lái)轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)現(xiàn)也是由于

首先培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞獲得了成功。

單倍體細(xì)胞培養(yǎng)此方法主要用花藥在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培

養(yǎng)，可以從小父子（雄性生殖細(xì)胞）直接發(fā)育成脛狀體，然后長(zhǎng)成

單倍體植株；或通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)分化出芽和根，最終長(zhǎng)成植株。

單倍體細(xì)胞培養(yǎng)主要應(yīng)用于植物育種工作，并已取得很大的成就。

三單克隆抗體技術(shù)

二十世紀(jì)六、七十年代，麥爾斯坦0和柯勒0在對(duì)抗體深

入研究過(guò)程中遇到了一個(gè)困難，他們必須得到大量的試驗(yàn)材料即單

一特異性的抗體,否則就無(wú)法進(jìn)行對(duì)抗體的活性分析.然而人或動(dòng)物

血清中，存在大量十分混雜的各種各樣的抗體。要解決抗血清的異

質(zhì)性問(wèn)題，要求有一個(gè)永久抗體產(chǎn)生系，以無(wú)限制地提供抗體。而

體外培養(yǎng)條件下淋巴細(xì)胞的壽命很短。事實(shí)上自然界中存在能分泌

均質(zhì)的免疫球蛋白又永不死亡的細(xì)胞，它們是在漿細(xì)胞階段發(fā)生了

成瘤轉(zhuǎn)化的淋巴腫瘤細(xì)胞。這種細(xì)胞很容易克隆和體外培養(yǎng)。遺憾

的是他們始終沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能與淋巴腫瘤細(xì)胞分泌的抗體的相應(yīng)抗原。

因此不能用來(lái)進(jìn)行抗體分析。年麥爾斯坦和科勒合作，試圖培養(yǎng)一

株骨髓瘤細(xì)胞，使之能永久產(chǎn)生針對(duì)一個(gè)已知抗原的抗體。

他們用羊紅細(xì)胞免疫小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞和一種小鼠的骨髓

瘤細(xì)胞，在病毒或細(xì)胞融合劑聚乙二醇（）的作用下，使脾細(xì)胞中

的淋巴細(xì)胞和瘤細(xì)胞融合為一個(gè)雜合細(xì)胞.這項(xiàng)工作獲得了成功，他

們把這種雜合細(xì)胞稱作雜交瘤細(xì)胞.然而在實(shí)際得到的培養(yǎng)液中并

非只有雜交瘤細(xì)胞，它們是淋巴細(xì)胞，瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞的混合

體.為此他們應(yīng)用年創(chuàng)立的選擇培養(yǎng)基對(duì)混合細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)選擇。其

選擇原理是這樣的。正常細(xì)胞在培養(yǎng)基中合成有兩條途徑，一是主

要合成途徑，另外還有一條是補(bǔ)救旁路。主途徑是利用培養(yǎng)基中的

糖和氨基酸這些簡(jiǎn)單的含碳含氮復(fù)合物來(lái)合成瞟吟與邀咤核甘酸。

這一過(guò)程需要四氫葉酸來(lái)供應(yīng)甲?；?。這一途徑可以被葉酸拮抗物

氨基瞟吟所阻斷；細(xì)胞的補(bǔ)救途徑是通過(guò)次黃瞟聆鳥瞟吟磷酸核糖

轉(zhuǎn)移酶0和細(xì)胞。密淀核苛激酶（）,揩核甘酸前體合成核甘酸，

以提供合成的原料。（圖）

麥爾斯坦用于融合的腫瘤細(xì)胞是經(jīng)過(guò)選擇的缺失次黃瞟峰磷酸

核糖轉(zhuǎn)化酶的即陰性細(xì)胞，它是補(bǔ)救旁路途徑經(jīng)酶缺失的突變纖胞

系，這種細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中不能存活，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中含有氨

基瞟吟，它阻斷了的主要合成途徑，同時(shí)這一細(xì)胞系又缺失補(bǔ)救途

徑所需要的。正常淋巴細(xì)胞在體外的壽命很短，所以它也不能在培

養(yǎng)基上有效傳代，只有雜交瘤細(xì)胞能夠生存和傳代。因此很容易在

培養(yǎng)上選擇雜交瘤細(xì)胞.這樣得到的雜交瘤細(xì)胞既能無(wú)限的增殖又

可分泌抗體.但這里還存在一個(gè)問(wèn)題，由于抗原大分子有不同的抗原

部位，所以我們這時(shí)得到的實(shí)際是多克隆抗體。要從產(chǎn)生各種不同

抗體的各種雜交瘤混合群體中篩選出產(chǎn)生特異抗體的雜交瘤還要經(jīng)

過(guò)有限稀釋法，通過(guò)檢測(cè)單細(xì)胞雜交瘤生長(zhǎng)小孔的上清液來(lái)選擇出

需要的單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞。然后,再進(jìn)一步進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，即克

隆化。多次克隆化可淘汰遺傳性狀不穩(wěn)定的雜交瘤，從而得到能產(chǎn)

生高效單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。這個(gè)原本只是為了得到試駒材

料所設(shè)計(jì)的技術(shù)流程單克隆抗體技術(shù)這個(gè)理論研究的副產(chǎn)品,現(xiàn)在

己被廣泛的應(yīng)用，它成為分析蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的分子生物學(xué)

方法，它為免疫診斷和治療開辟了新的途徑年代初，單克隆抗體診

斷盒開始成為受歡迎的商品，有著廣泛的市場(chǎng).這是生物技術(shù)最早開

發(fā)的項(xiàng)目。這說(shuō)明，在許多看不出有任何商業(yè)價(jià)值或醫(yī)學(xué)重要性的

理論研究中，可以衍生出意想不到的巨大的實(shí)用價(jià)值。麥爾斯坦、

科勒和杰尼()等三人也為此共同獲得年諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)。

第四節(jié)常用分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)是當(dāng)前生命科學(xué)發(fā)展的主流.其主要內(nèi)容之一是對(duì)蛋

白質(zhì)和核酸大分子結(jié)構(gòu)的研究.和這些研究相關(guān)的技術(shù)曾經(jīng)歷了一個(gè)

戲劇性的發(fā)展過(guò)程.

年和提出雙螺旋結(jié)構(gòu)模型.同年英國(guó)科學(xué)家確立了胰島素的一級(jí)

結(jié)構(gòu).雖說(shuō)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究走在了前面，但當(dāng)時(shí)這個(gè)僅由個(gè)氨基酸

組成的最小的蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的測(cè)定經(jīng)歷了年才得以完成.七十年代

初期對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸序列分析的研究日臻成熟而對(duì)核酸堿基序列分

析的研究進(jìn)展不大,那時(shí)測(cè)定一個(gè)僅由二十幾個(gè)核甘酸組成的鏈,需

要一個(gè)熟練的研究者工作三年.七十年代中期核酸測(cè)定工作有了關(guān)鍵

性的突破年建立了快速測(cè)定序列的“加減法”,后來(lái)經(jīng)過(guò)改進(jìn)又稱為

“末端終止法”年美國(guó)科學(xué)家等又建立了快速測(cè)定序列的“化學(xué)斷裂

法”.這些先進(jìn)分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用使得不但象噬菌體那樣上萬(wàn)個(gè)

核甘酸序列分析成為可能,甚至象人的單倍體細(xì)胞基因組的上億個(gè)核

甘酸序列的分析也指日可待了.近些年,蛋白質(zhì)氨基酸序列分析技術(shù)

卻顯得相形見細(xì).甚至目前一些蛋白質(zhì)序列的分析大都依靠其的堿基

順序.一般先以某蛋白質(zhì)的已知部分肽段的氨基酸順序?yàn)榛A(chǔ),合成

一段相應(yīng)的探針,然后用分子雜交技術(shù)從基因組文庫(kù)中克隆出該蛋白

質(zhì)的對(duì)應(yīng)基因.再根據(jù)堿基序列推導(dǎo)出相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列來(lái).

由此看來(lái),有關(guān)核酸序列的分析技術(shù)是當(dāng)前最受關(guān)注的分子生物學(xué)技

術(shù).在這里我們僅對(duì)此做一般的介紹，以便對(duì)分子生物學(xué)技術(shù)有一個(gè)

大概的了解.

—基因組文庫(kù)的構(gòu)建

基因組()在分子水平上是指某一機(jī)體或某一機(jī)體的染色體所

含的全部.基因組文庫(kù)()是指一個(gè)機(jī)體全套的基因組克隆.建立基

因組文庫(kù)是為了能夠方便的提取某種特殊的基因，以便對(duì)其進(jìn)行研究

和應(yīng)用.如何構(gòu)建基囚組文庫(kù)呢？首先通過(guò)一定的手段如用限制性內(nèi)

切酶,將全部基因組的切成片段,并且招每一片段都與載體拼連成一

重組.然后，1各所有重組分子分別引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行繁殖.結(jié)果是每

一個(gè)細(xì)胞集落（）含一特定基因組片段的重組分子，也稱為基因組克

?。ǎ▓D）這樣就建立起了某一機(jī)體的文庫(kù)。

從理論上講基因組文庫(kù)的建立是可行的，但在實(shí)際操作中卻

要復(fù)雜的多。通過(guò)內(nèi)切酶從某種哺乳動(dòng)物的全部基因組中可以得到58

片段.在克隆過(guò)程中可以產(chǎn)生上百萬(wàn)個(gè)不同的載體細(xì)胞集落.每個(gè)集

落細(xì)胞中都含有插入不同的片段的質(zhì)粒片段的分布是隨機(jī)的.有些片

段可能只是基因的一部分,有的片段可能不編碼.如果

對(duì)某種特殊蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行研究就要用被標(biāo)記的一段探針從文庫(kù)

中揩研究對(duì)象選擇出來(lái).

二文庫(kù)的構(gòu)建

如果我們從細(xì)胞中提取某種，并根據(jù)堿基配對(duì)的原則在體外由

逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成相應(yīng)的，這種就稱之為即互補(bǔ)（，）.由逆轉(zhuǎn)錄酶

合成的單鏈分子可以利用聚合酶轉(zhuǎn)換成雙辭分子，并可通過(guò)質(zhì)粒引入

宿主細(xì)胞進(jìn)行繁殖,形成克?。▓D）.如果具有某一特定細(xì)胞的全部克

隆，它就被稱為文庫(kù)（圖）.是從反轉(zhuǎn)錄而來(lái)的，就是說(shuō)只有細(xì)胞內(nèi)

存在的才能建立起相應(yīng)的克隆.另外,同一機(jī)體不同類型的細(xì)胞、同一

類型不同發(fā)育階段的細(xì)胞、甚至不同生理狀態(tài)下的細(xì)胞的基因表達(dá)都

會(huì)有所差異,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的的種類和數(shù)量也會(huì)不同.所以,同一機(jī)體細(xì)

胞的文庫(kù)并不一樣.這一點(diǎn)與基因組文庫(kù)有所不同.

文庫(kù)的建立至少有兩個(gè)意義.其一,克隆可以在宿主細(xì)胞中合成

編碼的蛋白質(zhì),人們利用這一手段可以生產(chǎn)出大量有用的蛋白質(zhì),如

胰島素、干擾素和生長(zhǎng)素等.其二,用帶有放射性標(biāo)記的單鏈即核竣探

針去對(duì)基因組文庫(kù)的克隆系統(tǒng)進(jìn)行分子雜交，從而可以選擇出某一特

殊序列的片段.

三特異核酸序列的研究方法

核酸分子雜交無(wú)論是建立基因組文庫(kù),還是建立文庫(kù),其

目的都是為了能對(duì)某一特殊基因進(jìn)行方便和有效的研究和應(yīng)用,我們

知道用核酸分子雜交這一靈敏的方法可以從文庫(kù)中檢出特殊的核昔

酸序列.如何利用探針檢出特異的呢

0印記法世紀(jì)代中朗，英國(guó)科學(xué)家提出了印記分析法.這一方

法的基本程序是,①酶解,將高分子量用限制內(nèi)切酶酶解成一定的片

段.②電泳,將酶解的片段在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，使之大小分離.

③轉(zhuǎn)移,電泳后用堿處理，使凝膠中的變成單鏈,然后將單股鏈轉(zhuǎn)移至

硝酸纖維濾膜上.④用合適的探針與膜片雜交,標(biāo)記與膜片上的同源

序列會(huì)通過(guò)氫鏈形成雜交分子.⑤洗去非特異性片段和未雜交的放射

性核素.⑥放射自顯影(圖).這種方法大大提高了分子雜交的靈敏

度,被廣泛的應(yīng)用于分子生物學(xué)的研究.目前人們正習(xí)慣用作者E勺名

字命名,因此這種印跡法被稱為.

()印記法與相對(duì)應(yīng)的方法是年提出的印跡分析法,這是一種用

探針來(lái)檢測(cè)特異序列的方法.由于印跡法以作者的名字命了名，所以

人們習(xí)慣上把印跡法稱為.

的基本程序同的相似,也要經(jīng)過(guò)抽提變性瓊脂糖凝膠電泳，（變

性破壞分子內(nèi)局部雙螺旋法構(gòu)），轉(zhuǎn)移,雜交,放射自顯影等基本步驟.

序列分析法

當(dāng)所要研究的一段被檢出后就可以對(duì)其進(jìn)行序列分析.目

前應(yīng)用的比較廣泛的方法是的“末端終止法”和后來(lái)與提

出的化學(xué)斷裂法.

0末端終止法“末端終止法”的基本操作是這樣的,以待測(cè)序列

的單鏈作為模版,加一個(gè)引物與被放射性核素標(biāo)記的底物.另外再加

一定比例的即''雙脫氧核糖核甘三磷酸.以加入為例，在聚合酶催化合

成過(guò)程中就會(huì)有和的競(jìng)爭(zhēng)參與，就會(huì)出現(xiàn)兩種可能性,一種是填充位

置,新合成的鏈繼續(xù)延伸.另一種可能性是參與配對(duì).在這種情況下，

由于的‘位置沒(méi)有定由羥基,不能再與下一個(gè)形成磷酸二酯錠.結(jié)果

就會(huì)可以得到不同長(zhǎng)度的以為結(jié)尾的片段.如果加入同時(shí)參與競(jìng)爭(zhēng)，

同樣道理,結(jié)果就會(huì)得到以和為結(jié)尾的四種片段。這樣經(jīng)過(guò)放射自顯

影后,就可以直接讀出這段的堿基順序。（圖）

（）化學(xué)斷裂法化學(xué)斷裂法的基本原理是用化學(xué)試劑特異性破壞與

不同堿基相連的磷竣二酯鍵，這樣就可以得到以特定堿基為結(jié)尾的四

組片段.自顯影后我們也可以直接讀出的順序來(lái)（圖）o

不論是酶法還是化學(xué)法在應(yīng)用過(guò)程中都有了明顯的改進(jìn)。研究者

們還根據(jù)這些原理制造了自動(dòng)分析儀.目前不但一些病毒和原核生物

基因組的全部序列已分析清楚。并且已開始向分析更大的基因組發(fā)展.

美國(guó)早就有計(jì)劃將人類基因組的X9個(gè)堿基對(duì)全部分析清楚。并且成

立了國(guó)際性合作機(jī)構(gòu):人類基囚組織（，）此項(xiàng)計(jì)劃預(yù)計(jì)招在未來(lái)十

幾年內(nèi)完成。

四技術(shù)

在對(duì)的研究中，有時(shí)樣品可能很少，可能只有一根毛發(fā)，一滴血或

者極少的體液.甚至有可能是冷凍多年的少許古生物組織.要對(duì)這些

進(jìn)行分析。首先要進(jìn)行體外擴(kuò)增以滿足的需要量。技術(shù)，既聚合酶鏈

反應(yīng)（，）就是一種體外擴(kuò)增技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)能在實(shí)驗(yàn)室的試管內(nèi)

將所要研究的片段在數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增成千上萬(wàn)倍.它的基本過(guò)程是這樣

的,①變性0,將片段加熱使雙鏈解離成單推。②退火（）溫度下降時(shí),

由化學(xué)合成的引物與所要擴(kuò)增的兩側(cè)相結(jié)合。③延伸。在種和引物等

條件下聚合酶從引物的'端進(jìn)行延伸,合成方向?yàn)檫@樣一個(gè)過(guò)程得

到分子與原來(lái)結(jié)構(gòu)相同的片段。這三個(gè)基本步驟每循環(huán)一次分子數(shù)就

會(huì)按指數(shù)倍增（（）.由此可知其驚人的擴(kuò)增量.（圖）.

值得一提的是年發(fā)表他的方法后，他關(guān)于這一理論和技術(shù)的論文

至今仍是被全世界科技論文引用最多的文獻(xiàn)也因技術(shù)的發(fā)明而榮獲

了年諾貝爾獎(jiǎng).

（圖：由流式細(xì)胞計(jì)測(cè)得一個(gè)群體細(xì)胞相對(duì)含量圖解，測(cè)定的是一群

生長(zhǎng)的細(xì)胞群體，由于它們的生長(zhǎng)并不同步，當(dāng)幾萬(wàn)個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)流式

細(xì)胞計(jì)后，就可得出一個(gè)柱形圖。第一個(gè)高峰的細(xì)胞數(shù)是含量，代表

期細(xì)胞，第二個(gè)高峰是含量，代表期和期細(xì)胞，介于二者之間的含量,

代表期的細(xì)胞。）

第四章細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞表面

第一節(jié)細(xì)胞質(zhì)膜

一、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)模型

三明治模型

單位膜模型

液態(tài)鑲嵌模型

二膜質(zhì)

（一）成分

磷脂卵磷脂

糖脂血型糖脂

膽固醇

（二｝膜質(zhì)的運(yùn)動(dòng)方式

側(cè)向運(yùn)動(dòng)

自旋運(yùn)動(dòng)

尾部擺動(dòng)

翻轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)

（三）脂質(zhì)體

三膜蛋白

（一）類型外在蛋q內(nèi)在蛋白

四膜的流動(dòng)性

（一）膜質(zhì)的流動(dòng)人鼠細(xì)胞的融合試驗(yàn)（有色熒光）

（二）膜蛋白的流動(dòng)細(xì)胞（熒光抗體）二價(jià)抗體成斑成帽

五膜的不對(duì)稱性

（-）質(zhì)膜各部分的名稱

（二）膜質(zhì)的不對(duì)稱性

（三）膜蛋白的不對(duì)稱性

六質(zhì)膜的功能

第一節(jié)細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)

一膜骨架

（一）紅細(xì)胞的生物學(xué)特性血影

（二）紅細(xì)胞質(zhì)膜蛋芻與膜骨架（圖）不運(yùn)動(dòng)纖毛綜合癥

第三節(jié)細(xì)胞連接

?細(xì)胞連接的營(yíng)養(yǎng)分配暢通說(shuō)明構(gòu)成組織的細(xì)胞之間有機(jī)械的連接

也有生理活動(dòng)的聯(lián)系。我們統(tǒng)稱它們?yōu)椤凹?xì)胞連接“，因此細(xì)胞

連接是多細(xì)胞有機(jī)體中相鄰細(xì)胞相互聯(lián)系，協(xié)同作用必不可少的

組織形式。它是對(duì)細(xì)胞功能的一種補(bǔ)充。

?按其功能可以將細(xì)胞連接分成兩大類，一類是機(jī)械連接，另一類

是通訊連接（CONNUNICATI0NJUNCTI0N

S）。

一細(xì)胞連接的分類

1-機(jī)械連接

（1）緊密連接

0錨定連接

A粘合帶連接細(xì)胞與細(xì)胞

B粘合斑連接細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)

C橋粒連接細(xì)胞與細(xì)胞

D半橋粒連接細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)

2.通訊連接

(I)間隙連接

(2)化學(xué)突觸

(3)胞間連絲

一?機(jī)械連接顧名思義，這種連接主要起到把細(xì)胞和細(xì)胞機(jī)械連

系在一起的作用。

(I)緊密連接(TIGHTJUNCTION)

緊密連接是腺體上皮細(xì)胞特有的連接方式。它存在于細(xì)胞頂部

下方質(zhì)膜上的一個(gè)特化區(qū)域。(圖)目前認(rèn)為緊密連接的構(gòu)造是這樣

的，相鄰質(zhì)膜上的許多跨膜蛋白互相之間在對(duì)應(yīng)的位置上互相連接。

這樣就構(gòu)成了一條封閉索(SEALINGSTRAND)。緊密連

接正是由數(shù)條交錯(cuò)成網(wǎng)的封閉索組成(圖)

緊密連接普遍存在于脊椎動(dòng)物體內(nèi)各種腔道的上皮細(xì)胞中，除

了具有機(jī)械的支持功能外還有一個(gè)重要的功能，它封閉了細(xì)胞之間的

空隙，將細(xì)胞連接成具有韌性的一層，使這一細(xì)胞層內(nèi)側(cè)的大多數(shù)物

質(zhì)不能自由通透。如，腸腔內(nèi)容物不能沿腸上皮細(xì)胞側(cè)壁溢入體液中O

腸上皮細(xì)胞對(duì)多糖氨基酸重要營(yíng)物質(zhì)的吸收靠分布在細(xì)胞頂部質(zhì)膜

上的主動(dòng)運(yùn)輸載體完成的，而葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞

外液是靠位于細(xì)胞基部和側(cè)面質(zhì)膜上被動(dòng)運(yùn)輸載體完成的。(圖)顯

然，這一系列運(yùn)輸過(guò)程的正常有序運(yùn)行有賴于不同功能的載體蛋白在

質(zhì)膜上的不同分布，正是緊密連接封閉了細(xì)胞間隙維持了這兩種載體

蛋白的正常分布，從面保證了小腸上皮細(xì)胞的極性的吸收功能。

（2）錨定連接（ANCHORINGJUNCTIONS）細(xì)

胞能夠結(jié)合成一個(gè)有一定機(jī)械支撐能力，一個(gè)有利于發(fā)揮

其功能的有序的細(xì)胞群體，主要是靠錨定連接.錨定連接是

一個(gè)細(xì)胞中的骨架系統(tǒng)成分與另一個(gè)細(xì)胞中的骨架成分

相連接（橋粒、粘合帶）；以與一個(gè)細(xì)胞的骨架系統(tǒng)和細(xì)

胞外基質(zhì)相連接（半橋粒、粘合斑）構(gòu)成的。錨定連接又

可分為與中間纖維相關(guān)的連接（橋粒、半橋粒）和與肌動(dòng)

蛋白相關(guān)的連接（粘合帶、粘合斑）。

A、橋粒（DESMOSOME）和半橋粒（HEMIDESMOS

OME）

有一種天皰瘡患者，他的體液滲漏至上皮導(dǎo)致嚴(yán)重的表皮大皰，

這是由于患者的身體產(chǎn)生了某種橋粒連接蛋白的抗體，這些抗體作用

于皮膚上皮細(xì)胞的橋粒使其失去功能的緣故?？梢姌蛄?duì)維持上皮結(jié)

構(gòu)的正常是非常重要的。

橋粒在細(xì)胞之間的連接作用如同鉀釘，它的結(jié)構(gòu)也呈鉀構(gòu)樣（圖）

在橋粒處相鄰細(xì)胞質(zhì)膜間的間隙約NM。在質(zhì)膜的胞質(zhì)側(cè)有一直徑約

NM的盤狀致密斑，其成分是細(xì)胞內(nèi)附著蛋白。細(xì)胞骨架的中間纖維

在此落腳，它即是胞胞質(zhì)中骨架成分又是組成橋粒的結(jié)構(gòu)。相鄰兩個(gè)

細(xì)胞的致密斑是通過(guò)跨膜連接糖蛋白相連。就這樣，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的中間

纖維通過(guò)橋粒相互連接成了于多個(gè)組織的網(wǎng)絡(luò)保持組織細(xì)胞致密