食品中微生物的檢驗(yàn)

食品中微生物的檢驗(yàn)

一、概念和分類

微生物并不是生物學(xué)分類學(xué)上的專門名詞，而是對所有形體微小，單

細(xì)胞的或個(gè)體結(jié)構(gòu)較為簡單的多細(xì)胞的、甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物的統(tǒng)

稱。

微生物群體非常龐雜，種類繁多，包括細(xì)胞型和非細(xì)胞型兩類。凡具

有細(xì)胞形態(tài)的微生物稱為細(xì)胞型微生物。細(xì)胞型微生物按細(xì)胞結(jié)構(gòu)又分為原

核微生物和真核微生物。

I-減微生物：細(xì)氤放線氤支原體、衣原體、立克次氏體

「細(xì)胞型一

微生物JL就微生機(jī)雒神髓

［構(gòu)胞型：病翱類病毒

原核生物的主要特點(diǎn)：細(xì)胞內(nèi)有明顯的核區(qū)，但沒有核膜包圍；核區(qū)內(nèi)

含有一條雙鏈DNA構(gòu)成的染色體；能量代謝和很多合成代謝均在質(zhì)膜上進(jìn)

行，核糖體分布在細(xì)胞之中；相對于原核微生物，真核微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有

了真正的細(xì)胞核，有多種細(xì)胞器；而病毒則不具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由核酸和蛋白質(zhì)

組成，可以認(rèn)為是超顯微的、沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的、專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的實(shí)體。

它們在活細(xì)胞外具有一般化學(xué)大分子的特征，在宿主細(xì)胞內(nèi)又具有生命特征。

可以作為了解的是，病毒可以通過細(xì)菌濾器，且對抗生素不敏感，對干擾素

敏感。

二、細(xì)菌、霉菌、酵母菌和致病菌介紹

細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)在原核生物中具有代表性，主要由細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)

胞質(zhì)、核質(zhì)體等部分構(gòu)成，有的細(xì)菌還有夾膜、鞭毛、菌毛等特殊結(jié)構(gòu)。在自

然界中細(xì)菌是分布最廣、數(shù)量最多的一類生物，并與食品關(guān)系最為密切。是

食品理論、工業(yè)發(fā)酵和釀造研究的主要對象，也是導(dǎo)致食品腐敗的主要類群。

細(xì)菌的基本形態(tài)有球狀、桿狀和螺旋狀，分別被稱為球菌、桿菌和螺旋菌。

霉菌是一些絲狀真菌的統(tǒng)稱。在自然界分布極廣，它的營養(yǎng)來源主要是

糖類和少量氮、礦物鹽等，極易在含糖的食品、餅干、面包和各種谷物、水

果上生長。經(jīng)常會(huì)有食品會(huì)因?yàn)榘l(fā)生霉變而不能食用，還有些霉菌會(huì)產(chǎn)生毒

性很大的毒素，比如黃曲霉素、黃米毒素、雜色曲霉素和展青霉素等等，都

可能導(dǎo)致癌癥，這類霉菌在大米和花生中最多。由此，對霉菌的檢測尤為重

要。霉菌菌體是由分支或不分支的菌絲組成，菌絲細(xì)胞均由細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、

細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體、核糖體以及內(nèi)含物組成。在固體培養(yǎng)基上，部分

菌絲深入培養(yǎng)基內(nèi)吸收養(yǎng)料，稱為營養(yǎng)菌絲；另一部分則向空氣生長，稱為

氣生菌絲；有的氣生菌絲發(fā)育到一定階段分化為繁殖菌絲。霉菌的菌落一般

比細(xì)菌菌落大幾倍到幾十倍，同一種霉菌，在不同成分的培養(yǎng)基上形成的菌

落特征可能有變化，但各種霉菌，在一定的培養(yǎng)基上形成的菌落大小、形狀、

顏色等卻相對穩(wěn)定。菌落特征也是鑒定霉菌的重要依據(jù)之一。

酵母菌多數(shù)為單細(xì)胞，一般呈圓形、橢圓形、圓柱形或檸檬形，也有些

酵母菌細(xì)胞與其子代細(xì)胞連在一起成為鏈狀，形成假菌絲，稱為假絲酵母。

酵母菌在適宜的培養(yǎng)基上形成的菌落與細(xì)菌相似，但比細(xì)菌菌落大而且厚，

菌落表面濕潤、粘稠、易被調(diào)起，有些種因培養(yǎng)時(shí)間太長使菌落表面皺縮。

三、培養(yǎng)基（北京陸橋）

1、微生物的營養(yǎng)

微生物同其他生物一樣，需要不斷地從外部環(huán)境中獲取營養(yǎng)，才能夠維

持生命。微生物細(xì)胞主要有水、有機(jī)物和無機(jī)鹽等化學(xué)成份組成，不同的微

生物種類其細(xì)胞的化學(xué)組成也不相同，而且含量也有差異。因此，維持微生

物生長所需要的化學(xué)元素的種類與含量也不相同。一般來說細(xì)胞含有某種元

素的量高則細(xì)胞對這種元素的需要量也就大，含量低則需要量也小。這也是

為什么我們不同的微生物培養(yǎng)要選擇不同的培養(yǎng)基。另外，同一種微生物在

不同的培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)也有差別，所以在選擇培養(yǎng)基是要注意。

微生物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)按照它們在機(jī)體中的生理作用不同，可以分為

碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長因子四種類型。能被微生物用來構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)的

或代謝產(chǎn)物中碳（氮）素來源的營養(yǎng)物質(zhì)稱為碳（氮）原物質(zhì)；無機(jī)鹽為微

生物機(jī)體提供金屬元素；有些微生物在含有氮源、碳源、無機(jī)鹽的培養(yǎng)基上

人不能生長，而需要添加某些生長因子，滿足生長的需要，比如維生素、氨

基酸、喋吟堿基等。我們經(jīng)常用到營養(yǎng)物質(zhì)：單糖、淀粉等（碳源）；尿素、

硫酸鐵、蛋白月東、牛肉膏等（氮源）；硫酸鋅等（無機(jī)鹽）。

2、培養(yǎng)基配制

培養(yǎng)基是人工配制的合適于不同微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)

基質(zhì)，是進(jìn)行微生物培養(yǎng)的基礎(chǔ)。配制培養(yǎng)基需要遵循一定的原則：

第一，根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基；

自養(yǎng)型微生物合成能力強(qiáng)，可以利用簡單的無機(jī)物質(zhì)合成復(fù)雜的細(xì)胞物

質(zhì)，其培養(yǎng)基可以由簡單的無機(jī)物質(zhì)組成。而異樣型微生物合成能力差，不

能以無機(jī)物質(zhì)作為唯一營養(yǎng)源，就要在培養(yǎng)基中添加一些有機(jī)物質(zhì)（比如葡

萄糖等）。另外細(xì)菌和酵母菌對培養(yǎng)基的要求也不同，細(xì)菌一般用牛肉膏蛋白

月東培養(yǎng)基培養(yǎng)，而酵母菌則用麥芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)。

第二，注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和配比；

微生物生長所需要的營養(yǎng)物往往是在濃度合適的條件下才表現(xiàn)出良好的

作用，濃度大時(shí)反而對微生物生長期抑制作用。微生物只有在適合生長的條

件下，才表現(xiàn)出應(yīng)有的形態(tài)特征，而不適合的條件下生長，會(huì)是微生物的形

態(tài)特征發(fā)生改變。

第三，將培養(yǎng)基的pH控制在一定的范圍之內(nèi)，滿足不同類型微生物的

生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物。

各種微生物生長的最適pH各不相同，一般來說，細(xì)菌生長的pH在中性

和微堿性之間（pH在7-7.5）,酵母菌和霉菌生長的pH值通常是偏酸的（pH

在4.5-6）0另外由于微生物在生長和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代

謝產(chǎn)物的形成與積累，會(huì)改變培養(yǎng)基的pH值，如果不及時(shí)控制，往往會(huì)導(dǎo)

致生長停止。因此，為了維持培養(yǎng)基pH的相對恒定，通常在培養(yǎng)基里加一

些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽。

3、培養(yǎng)基的類型及應(yīng)用

培養(yǎng)基的種類很多，按培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分分為合成培養(yǎng)基和天

然培養(yǎng)基；根據(jù)物理狀態(tài)不同分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基

（常用凝固劑有瓊脂、明膠和硅膠，硅膠是由無兒的硅酸鈉和硅酸鉀被鹽酸

及硫酸中和時(shí)凝聚而成的膠體，不含有機(jī)物，因而適合于用來分離和培養(yǎng)自

養(yǎng)型微生物）；根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途，可將培養(yǎng)基分成基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培

養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基。

牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基是最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

加富培養(yǎng)基：在普通培養(yǎng)基上加入其他營養(yǎng)物質(zhì)，用以培養(yǎng)某種或某類

營養(yǎng)要求苛刻的一樣微生物；

選擇培養(yǎng)基：根據(jù)某種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)需求或?qū)δ撤N化合物

的敏感性不同而設(shè)計(jì)出來的一類培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以將某種或某類

微生物從混雜的微生物群體中分離出來。比如，我們在培養(yǎng)基中加入青霉素

或者四環(huán)素等抗生素(生長抑制劑，抑制細(xì)菌和放線菌生長)，可以分離酵母

菌和霉菌;通過在培養(yǎng)基中加入結(jié)晶紫或提高培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度(7.5%),

可以從混雜的微生物群體中分別分離出革蘭氏陰性菌或葡萄球菌；加孔雀石

綠可以分離出革蘭氏陽性菌。

鑒別培養(yǎng)基：在普通培養(yǎng)基內(nèi)加入某種試劑或化學(xué)藥品，使得某種微生

物在這個(gè)培養(yǎng)基上生長后，可以產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，這種代謝產(chǎn)物可以與培

養(yǎng)基中的特定試劑或化學(xué)藥品起反應(yīng)，產(chǎn)生某種明顯的特征性變化。根據(jù)這

種特點(diǎn)來區(qū)分微生物。比如：大腸菌群測定中，液體培養(yǎng)基中加入浪甲酚紫

和發(fā)酵管，來指示微生物生長過程中是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基是一種

鑒別培養(yǎng)基，常用于檢查乳制品和飲用水中是否含有致病性的腸道細(xì)菌，伊

紅為酸性染料?，美藍(lán)則為堿性染料當(dāng)大腸桿菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)生混合酸時(shí)，與

伊紅染色，再與美藍(lán)結(jié)合生成紫黑色化合物。在此培養(yǎng)基上生長的大腸桿菌

形成呈紫黑色帶金屬光澤的小菌落。而產(chǎn)氣桿菌則形成呈棕色的大菌落。不

能發(fā)酵乳糖的細(xì)菌產(chǎn)堿性物較多，帶負(fù)電荷，與美藍(lán)結(jié)合，被染成藍(lán)色菌落。

還可以加入明膠，看液化明膠的情況。

四、微生物檢驗(yàn)

食品中的微生物檢驗(yàn)項(xiàng)目主要有四個(gè)：菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵

母菌、致病菌。其中致病菌又主要包括沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球

菌。

首先，我們看一下菌落總數(shù)的測定。我們先弄清楚幾個(gè)概念什么是菌落、

菌落總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)？我們都知道單個(gè)細(xì)菌用肉眼是看不見的，但是，當(dāng)單

個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)?，便會(huì)形成一個(gè)肉眼可見的，具有

一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，這就是菌落。而菌落總數(shù)就是指食品經(jīng)過檢樣

處理，在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、PH、需

氧性質(zhì)等)，所得1mL(g)檢樣中所含菌落的總數(shù)。更確切地說即在需氧情

況下，36℃±1℃培養(yǎng)48h,能在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長的菌落總數(shù)，所以

厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌，由于現(xiàn)有條件不

能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。因此菌落總數(shù)并不表示實(shí)際中的所有

細(xì)菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類，所以有時(shí)被稱為雜菌數(shù)，

需氧菌數(shù)等。可見把菌落總數(shù)就等同于細(xì)菌總數(shù)是不確切的。我們可以看看

長在營養(yǎng)瓊脂平板上最常見的菌落形態(tài)，當(dāng)然并不是所有的菌落都會(huì)長的這

么規(guī)則，而且也不是所有的菌落都會(huì)長的這么大，像葡萄酒、水這樣的樣品

長出的菌落就會(huì)很小。這就需要我們借助放大鏡來觀察，防止漏數(shù)菌落數(shù)。

弄清這兒個(gè)概念后，我們就來看一下菌落總數(shù)測定的具體操作步驟：

(1)以無菌操作，將檢樣25g(25ml)剪碎放于含有225mL滅菌生理鹽水或其

他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體

檢樣最好用均質(zhì)器以8000-10000r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀

釋液。

（2）用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生

理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液），振搖試管,

混合均勻，做成1：100的稀釋液。

（3）另取1ml滅菌吸管，按上面操作順序，做10遞增稀釋液，如此每增加一

次，即換用1支1ml滅菌吸管。

（4）根據(jù)樣品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)颖疚廴厩闆r進(jìn)行估計(jì)，選擇2-3個(gè)適宜稀釋

度，分別在做10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移1ml稀釋液

于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。

（5）稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)（從檢樣稀釋到傾注平板不超過20min）將涼

至46℃左右營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿內(nèi)15ml,并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。同時(shí)，

將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入不加有1ml稀釋液的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。

（6）待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h,。取出計(jì)算平板

內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。

在操作過程中要注意幾個(gè)事項(xiàng)：

L操作中必須有“無菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的。

所用剪刀、鏡子等器具也必須進(jìn)行滅菌處理。樣品如果有包裝，應(yīng)用75%乙醇在

包裝開口處擦拭后取樣。操作應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺(tái)或經(jīng)過消毒處理的無菌室進(jìn)行。

2.采樣的代表性：如系固體樣品，取樣時(shí)不應(yīng)集中一點(diǎn)，宜多采幾個(gè)部位。

固體樣品必須經(jīng)過均質(zhì)或研磨，液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。

3.傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46℃水浴內(nèi)保溫，溫度過高會(huì)影響菌的生長，過低瓊

脂易于凝固而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。

4.傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從12?20ml不等，一般以15ml較為適宜，平

板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時(shí)，培基底部如有沉淀物，應(yīng)將底

部棄去，以免與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀察。

5.為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并

旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)

間不宜超過20min,以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。

6.為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，不易

分辨，可同時(shí)作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境中放

置，以便計(jì)數(shù)時(shí)作對照觀察。

7.在某些場合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營養(yǎng)瓊脂中加入

氯化三苯四氮哇(TTC),培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別。

8.吸管上端要塞上棉花，避免交叉污染；棉花塞得不宜過緊也不能過松。

9.倒培養(yǎng)基前，瓶口要過火焰。

10.做空白對照，順便可以鑒定一下你的器皿、培養(yǎng)基以及水是否滅好菌了。

11.平板一定要倒置放入培養(yǎng)箱里，因?yàn)榕囵B(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境溫?zé)?，培養(yǎng)基內(nèi)水份

充足，培養(yǎng)過程中會(huì)形成水份，蒸發(fā)，遇到平板的頂部會(huì)凝聚形成水珠，這時(shí)

如果不倒置，會(huì)滴到培養(yǎng)基表面，使瓊脂表面濕潤，細(xì)菌就會(huì)長“糊”了，從

而不利于形成菌落。

培養(yǎng)完后還要進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，這點(diǎn)也很重要，前面的工作做的再好,

不會(huì)計(jì)數(shù)或是記得不準(zhǔn)確前面的一切都是徒勞。

(1)平板菌落數(shù)的選擇

選取菌落數(shù)在30—300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)，一個(gè)稀釋度使

用兩個(gè)平板，應(yīng)采用兩個(gè)平板平均數(shù)，其中一個(gè)平板有較大片狀菌數(shù)生長時(shí)，

則不宜采用，應(yīng)以無片狀菌數(shù)生長的平板柞為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落

不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2

代表全皿菌落數(shù)，平皿內(nèi)如有鏈狀菌落生長時(shí)（菌落之間無明顯界線）若僅有

一條鏈，可視為一個(gè)菌落，如有不同來源的兒條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個(gè)菌

落計(jì)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，

而另一半又分布均勻，則可以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。當(dāng)

計(jì)數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于300時(shí)），但分布很均勻，可

取平板的一半或1/4計(jì)數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。

（2）稀釋度的選擇

1.應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30~300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表

1中例1）。

2.若有兩個(gè)稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30~300之間，則視兩者之比如何

來決定若其比值小于或等于2,應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；若大于2則報(bào)告其中較小的數(shù)

字（見表1中例2及例3）o

3.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300,則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)

乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表1中例4）。

4.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)

乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表1中例5）。

5.若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表

1中例6）.

6.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30~300之間，其中一部分大于300

或小于30時(shí)，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表

1例7）o

（3）菌落數(shù)的報(bào)告

菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，采用兩位有效數(shù)字,

在兩位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入的方法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面的零

數(shù)，也可用10的指數(shù)來表示（見表1）。

例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀菌落總數(shù)報(bào)告方式

10-110-210-3釋液[cfu/g(mL)][cfu/g(mL)]

之比

1多不16420—1640016000或1.

可計(jì)6X101

2多不295461.63775038000或

可計(jì)3.8X10,

3多不271602.22710027000或

可計(jì)2.7X10'

4多不多不可313—313000310000或

可計(jì)計(jì)3.1X10!

527115—270270或2.7

X102

6000—<1X10<10

7多不30512—3050031000或

可計(jì)3.1X101

微生物檢測的第二個(gè)重要指標(biāo)就是大腸菌群的測定，大腸菌群系指一群在

37度能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性的無芽胞桿菌。

該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，

推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群系以100mL(g)檢樣

內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)(MPN)表示。大腸菌群MPN是采用一定的方法，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)

學(xué)的原理所測定和計(jì)算出的一種最近似數(shù)值。大腸菌群MPN常規(guī)的檢驗(yàn)方法有

三管系列、五管系列和其它系列，最常用的是三管系列，也有采用五官系列的,

像生活飲用水中總大腸菌群的測定采用的就是五官系列。其原理相同，區(qū)別在

于接種樣品的稀釋度和各稀釋度的管數(shù)，三管系列接種三個(gè)稀釋度、每個(gè)稀釋

度三管、五管系列接種五個(gè)稀釋度、每個(gè)稀釋度五管。以三管系列較為簡便。

那我們就以三管系列為例說說大腸菌群測定的步驟，其實(shí)食品中微生物的

檢測首先第一步都是要進(jìn)行檢樣處理，然后根據(jù)樣品標(biāo)準(zhǔn)中微生物的限量及污

染程度，選擇合適的稀釋度，根據(jù)要培養(yǎng)的菌種選擇適宜的培養(yǎng)基及時(shí)間、溫

度等。前面我們已經(jīng)講過菌落總數(shù)測定的檢樣過程，就不重復(fù)了，我們看下面

的操作，將處理好的樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上者，用

雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，每一稀釋度

接種3管，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2小時(shí)，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管均不產(chǎn)

氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性。如有產(chǎn)氣者，按下列程序進(jìn)行。

分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種到伊紅美蘭瓊脂平板上，置36±1℃溫

箱內(nèi)培養(yǎng)18—24小時(shí)，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并作革蘭氏染色和證實(shí)試

驗(yàn)。

證實(shí)試驗(yàn)：對典型和可疑菌落進(jìn)行觀察和證實(shí)試驗(yàn)。由于大腸菌群是一群

細(xì)菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面與大腸菌群的檢出率密

切相關(guān)。國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌

群菌落呈黑紫色有綠色金屬光澤或無金屬光澤時(shí)，檢出率最高；紅色、粉紅色

菌落檢出率較低。另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，只挑取

一個(gè)菌落，由于機(jī)率問題，尤其當(dāng)菌落不典型時(shí)，很難避免假陰性的出現(xiàn)。所

以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應(yīng)多挑幾個(gè)，以免出現(xiàn)假陰性。

將挑取的可疑大腸菌群菌落進(jìn)行革蘭氏染色。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管置36±1℃

溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2小時(shí)，觀察產(chǎn)氣情況，凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰

性的無芽胞桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。到這里我們就要了解一下什么是

革蘭氏染色？革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，通過這一

染色，可把幾乎所有的細(xì)菌分成革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌兩大類，因此它

是分類鑒定菌種的重要方法。我們來看看這種方法的步驟：細(xì)菌先經(jīng)堿性

染料結(jié)晶紫溶液初染后，分別染上紫色，而經(jīng)碘液媒染，結(jié)晶紫就與碘分子形

成了一個(gè)分子量較大的染色較牢固的復(fù)合物。接著用95%酒精脫色，在一定條件

下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，脫色后再用一種紅色染料如堿性番

紅等進(jìn)行復(fù)染，前者仍帶紫色，后者則被染上紅色。因此可把細(xì)菌分為兩大類,

前者叫做革蘭氏陽性菌（GO,后者為革蘭氏陰性菌（G-）o有芽胞的桿菌和絕

大多數(shù)的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽性反應(yīng)；弧菌，螺旋體

和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。

染色反應(yīng)的主要依據(jù)就是革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理

性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣?，F(xiàn)在一般認(rèn)為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特

殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易

脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色。

另外，陽性菌菌體等電點(diǎn)較陰性菌為低，在相同PH條件下進(jìn)行染色，陽性

菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時(shí)的條件要嚴(yán)

格控制。例如，在強(qiáng)堿的條件下進(jìn)行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈

正反應(yīng)；PH很低時(shí)，則可都呈負(fù)反應(yīng)。此外，兩類菌的細(xì)胞壁等對結(jié)晶紫一碘

復(fù)合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易

脫色。所以脫色時(shí)間，脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，具體操作方

法是：

1）涂片干燥固定。涂片不宜過后，以免脫色不完全造成假陽性；火焰固

定不宜過熱否則會(huì)改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。

2）草酸鏤結(jié)晶紫染1分鐘。

3）自來水沖洗。

4）加碘液覆蓋涂面染1分鐘。

5）水洗，用吸水紙吸去水分。

6）加95%酒精數(shù)滴進(jìn)行脫色，直至流出的乙醇無紫色，立即水洗，吸去水

分。結(jié)果是否正確，這步是關(guān)鍵。脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過

度，陽性菌被誤染成陰性菌，脫色時(shí)間為20?30秒。

7）番紅染色液（稀）染1分鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。

染色的結(jié)果，革蘭氏陽性反應(yīng)菌體都呈紫色，陰性反應(yīng)菌體都呈紅色。

證實(shí)實(shí)驗(yàn)完成后就可以進(jìn)行報(bào)告了，報(bào)告：根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管

數(shù)，查MPN的檢索表（見表），報(bào)告每100ml（g）大腸菌群的最近似數(shù)（MPN）。

陽性管數(shù)MPN100mL(g)

1mL(g)X30.1mL(g)X30.01mL(g)X3

000<30

00130

00260

00390

01030

01160

01290

表內(nèi)所列檢樣量如改用10、1、0.1時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用

0.1、0.01、0.001時(shí),則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加10倍。

標(biāo)準(zhǔn)中還提到了糞大腸菌群的檢出，它從屬于大腸菌群，我在這里簡單地

給大家提一下，用接種環(huán)將前面講述的操作中所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)

物轉(zhuǎn)種于EC肉湯中，置44.5±0.2℃水浴箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h,培養(yǎng)后不產(chǎn)氣則報(bào)

告為陰性；將產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉(zhuǎn)種于EMB上，培養(yǎng)18?24h,凡平板上有

典型菌落者，則證實(shí)為糞大腸菌群陽性。報(bào)告同上。

微生物檢驗(yàn)還有兩個(gè)重要指標(biāo)就是霉菌、酵母的計(jì)數(shù)及致病菌的檢驗(yàn)，因

為企業(yè)的出廠檢驗(yàn)微生物這塊主要是菌落總數(shù)和大腸菌群，所以后兩個(gè)指標(biāo)我

就給大家簡單介紹一下，讓大家了解一下。霉菌和酵母的培養(yǎng)可以使用同一種

培養(yǎng)基，通過長出的菌落形態(tài)特征來判斷計(jì)數(shù)，霉菌最顯著的特征就是一般有

菌絲，不規(guī)則無固定大小，最初往往是白色或淺色，當(dāng)長出抱子后就成好多顏

色，像紅色、綠色、黑色等等。而酵母菌一般比較光滑，隆起，多為乳白色，

少數(shù)有紅色，與細(xì)菌菌落特征相似。一般使用的培養(yǎng)基是孟加拉紅，檢樣操作

和前面一樣，但是培養(yǎng)霉菌要求稀釋樣品要充分振搖30min以上，還要反復(fù)吹

吸50次，一是霉菌抱子充分散開。檢樣完畢后選擇合適的稀釋度，取1mL稀釋

液加到平板內(nèi)，加入培養(yǎng)基待凝固后倒置放入25℃?28℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，3天后

開始觀察，共培養(yǎng)觀察5天。然后選擇菌落數(shù)在10?150之間的進(jìn)行報(bào)數(shù)，稀

釋度的選擇及菌落的報(bào)告方式都可參照菌落總數(shù)報(bào)出方式。我們再來說說致病

菌的檢驗(yàn)，主要的是三種沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌。我們以沙門

氏菌為例簡單的介紹一下操作，致病菌的檢測第一步都要進(jìn)行增菌，將25g樣

品加入到225mL緩沖蛋白月東水(BP)中于36℃±1℃培養(yǎng)4h,取10mL加入到

100mL四硫酸鈉煌綠增菌液(TTB)內(nèi)于42℃培養(yǎng)18h?24h,同時(shí)，另取10mL于

100mL亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液內(nèi)于36c±1℃培養(yǎng)18h?24h。分離，取增菌

液劃線接種一個(gè)亞硫酸鈿(BS)瑚旨和一個(gè)HEKTOEN氏腸道菌(HE)瓚旨上,

于36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h,BS上培養(yǎng)40?48h°根據(jù)沙門氏菌在每種培養(yǎng)基

上菌落形態(tài)挑取典型的可疑菌落(BS上產(chǎn)硫化氫的菌落呈褐色，灰色或黑色，有

時(shí)帶有金屬光澤。有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不

變；HE上菌落呈蘭綠至蘭色，帶或不帶黑色中心。許多沙門氏菌培養(yǎng)物可呈現(xiàn)

大的光澤黑色中心或兒乎全部黑色的菌落，多數(shù)產(chǎn)硫化氫)進(jìn)行生化試驗(yàn)接種到

三糖鐵上，于36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h,通過在TSI內(nèi)的反應(yīng)來判定，然后進(jìn)

一步進(jìn)行血清學(xué)的鑒定。

我們都知道微生物的檢測最主要的就是要保證無菌操作，只有這樣才能保證出

具數(shù)據(jù)的真實(shí)性和可靠性。下面講的內(nèi)容就是怎樣做才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。首

先我們來區(qū)別兩個(gè)概念，消毒和滅菌這兩個(gè)詞在實(shí)際使用中常被混用，其實(shí)它

們的含義是有所不同的。消也是指應(yīng)用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病

原菌營養(yǎng)體的方法，而滅菌是指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有

微生物，使之呈無菌狀態(tài)。從概念中我們就能看出來我們在做微生物的試驗(yàn)是

要進(jìn)行前期的滅菌工作，而不是簡單的消毒。我們就來看看通常采用地滅菌方

法：

一、物理方法：有高溫、輻射、超聲波、激光、過濾等等，在實(shí)驗(yàn)室中最常用

的就是高溫滅菌和輻射滅菌。

1、高溫

利用高溫進(jìn)行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高溫可

使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶類發(fā)生變性而失活，從而起滅菌作用，不光是高

溫可以殺菌，通常低溫也可以起抑菌作用，所以我們可以把預(yù)先配好的培養(yǎng)基

放到冰箱里進(jìn)行保存。高溫滅菌包括干熱滅菌法和濕熱滅菌法，在同樣的溫度

下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好，這是因?yàn)橐环矫鏉駸嵋子趥鬟f熱量，另一

方面由于濕熱更易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵結(jié)構(gòu)，從而加速蛋白質(zhì)變性而

迅速死亡。

1）干熱滅菌法：

a.灼燒滅菌法：利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠，滅菌迅速，

但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環(huán)、試管口及放培養(yǎng)基

的瓶口，檢樣使用的剪子鏡子等。

b.干熱空氣滅菌法：即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫至160°C,

恒溫1小時(shí)即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。這一般這可以用來

烘干滅好菌的平板和吸管。

2）濕熱滅菌法：

多數(shù)細(xì)菌和真菌的營養(yǎng)細(xì)胞在60℃左右處理5-10分鐘即可殺死，酵母菌

和真菌的抱子稍耐熱些，要用80C以上處理才能殺死，而細(xì)菌的芽抱最耐熱，

一般要在120℃下處理15分鐘才能殺死。這就是為什么器皿及蒸儲(chǔ)水的滅菌都

要在121c高壓滅菌15分鐘以上，而一般的培養(yǎng)基滅菌也都采用121c高壓滅

菌15分鐘。濕熱滅菌法包括常壓法和加壓法。

常壓法：

a.巴氏消毒法：有些食物會(huì)因高溫破壞營養(yǎng)成分或影響質(zhì)量，如牛奶、醬

汕、啤酒等，所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持食

物的營養(yǎng)和風(fēng)味，又進(jìn)行了消毒，保證了食品衛(wèi)生。該法一般在60?85℃處理

15秒至30分鐘既可達(dá)到消毒目的。此法為法國微生物學(xué)家巴斯德首創(chuàng)，故名為

巴氏消毒法。

b.煮沸消毒法：直接將要消毒的物品放入清水中，煮沸數(shù)分鐘，即可殺死

細(xì)菌的全部營養(yǎng)和部分芽抱。此法適用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。

c.間歇滅菌法：適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。具體做法是：將待滅菌的培養(yǎng)

基在80?100°C蒸煮15?60分鐘，殺死其中所有微生物的營養(yǎng)細(xì)胞。然后置

室溫或放入37°C恒溫箱中過夜，誘導(dǎo)殘留的芽抱發(fā)芽。第2天再重復(fù)上述步

驟，三次左右，就可達(dá)到滅菌的目的。此法不需加壓滅菌鍋，但操作麻煩，所

需時(shí)間長。

加壓法：常規(guī)加壓滅菌法和連續(xù)加壓滅菌法

常規(guī)加壓滅菌法：這是發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)療保健、食品檢測和微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室

中最常用的一種滅菌方法。它適用于各種耐熱、體積大的培養(yǎng)基的滅菌，也適

用于玻璃器皿、工作服等物品的滅菌。

常規(guī)加壓蒸汽滅菌是把待滅菌的物品放在一個(gè)可密閉的盛有適量水的加壓

蒸汽滅菌鍋中，把鍋內(nèi)的水加熱煮沸，并把其中原有的空氣徹底驅(qū)盡后將鍋密

封。再繼續(xù)加熱就會(huì)使其中壓力升高。由于蒸汽壓的上升，從而溫度也隨之提

高到100℃以上。在蒸汽壓達(dá)到1kg/厘米2時(shí)即o.IMPa,加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的溫

度可達(dá)到121。C。在這種情況下，微生物（包括芽抱）在15?20分鐘便會(huì)被殺

死，而達(dá)到滅菌目的。如滅菌的對象是砂土、石蠟油等面積大、含菌多、傳熱

差的物品，則應(yīng)適當(dāng)延長滅菌時(shí)間。

在加壓蒸汽滅菌中，要引起注意的一個(gè)問題是，在恒壓之前，一定要排盡滅

菌鍋中的冷空氣，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對應(yīng)關(guān)系，這樣會(huì)大

大降低滅菌效果。

2影響加壓蒸汽滅菌的因素

a.不同的微生物或同種微生物的不同菌齡對高溫的敏感性不同。多數(shù)微生

物的營養(yǎng)體和病毒在50飛5。C,10分鐘就會(huì)被殺死；但各種泡子、特別是細(xì)菌

芽抱最能抗熱，，要在121。C,15分鐘才被殺死。對同種微生物來講，幼齡菌

比老齡菌對熱更敏感。

b.微生物的數(shù)量多少顯然會(huì)影響滅菌的效果，數(shù)量越多，熱死時(shí)間越長。

c.滅菌對象PH的影響PH6.0?8.0時(shí),微生物較不易死亡；PHV6.0時(shí),最

易引起死亡。

d.滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度的影響原理是在驅(qū)盡鍋內(nèi)空氣的前提下，通過加

熱把密閉鍋內(nèi)純水蒸汽的壓力升高而使蒸汽溫度相應(yīng)提高，也就是說是依靠溫

度而不是壓力達(dá)到滅菌的目的。因此，在一切利用加壓蒸汽滅菌法的場合下，

必須做到徹底排除滅菌鍋內(nèi)的殘余空氣。

e.滅菌對象的體積滅菌對象體積的大小會(huì)影響熱的傳導(dǎo)速率。

3滅菌對培養(yǎng)基成分的影響

除對培養(yǎng)基中的淀粉成分有促進(jìn)糊化和水解等少數(shù)有利影響外，很多是不

利因素：

a.pH值改變，普遍下降。

b.產(chǎn)生混濁或沉淀，這主要是由于一些離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生混濁或沉

淀。例如Ca，2與POJ化合，就會(huì)產(chǎn)生磷酸鈣沉淀。

c.破壞營養(yǎng)，提高色澤，不少培養(yǎng)基顏色加深。

d.體積和濃度有所變化，降低濃度氣溫低時(shí)會(huì)增加冷凝水。

可以采用特殊加熱滅菌的方法消除有害影響，像對含有在高溫下易破壞成

分的培養(yǎng)基，如含糖組合培養(yǎng)基，可進(jìn)行低壓滅菌15分鐘，所以像我們培養(yǎng)大

腸菌群所用的乳糖膽鹽培養(yǎng)基就是采用了115℃0.07MPa左右滅菌15分鐘。

2、輻射

利用輻射進(jìn)行滅菌消毒，可以避免高溫滅菌或化學(xué)藥劑消毒的缺點(diǎn)，所以

應(yīng)用越來越廣，目前主要應(yīng)用在以下兒個(gè)方面：

1）像微生物實(shí)驗(yàn)室、超凈工作臺(tái)都應(yīng)用紫外燈殺菌。避免紫外燈的照射,

打開時(shí)人員要離開。

2）還有應(yīng)用B射線作食品表面殺菌，Y射線用于食品內(nèi)部殺菌。經(jīng)輻射

后的食品，因大量微生物被殺滅，再用冷凍保藏，可使保存期延長。

3、過濾

采用機(jī)械方法，設(shè)計(jì)一種濾孔比細(xì)菌還小的篩子，做成各種過濾器。通過

過濾，只讓液體培養(yǎng)基從篩子中流下，而把各種微生物菌體留在篩子上面，從

而達(dá)到除菌的目的。這種滅菌方法適用于一些對熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)

基的滅菌以及氣體的滅菌。它的最大優(yōu)點(diǎn)是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學(xué)成

分。但是比細(xì)菌還小的病毒仍然能留在液體培養(yǎng)基內(nèi)，有時(shí)會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來一定

的麻煩。

二、化學(xué)方法

一般化學(xué)藥劑無法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原微生物，所

以是起消毒劑的作用，而不是滅菌劑。

能迅速殺滅病原微生物的藥物，稱為消毒劑。能抑制或阻止微生物生長繁

殖的藥物，稱為防腐劑。但是一種化學(xué)藥物是殺菌還是抑菌，常不易嚴(yán)格區(qū)分。

消毒劑在低濃度時(shí)也能殺菌（如1：1000硫柳汞）。由于消毒防腐劑沒有選擇

性，因此對一切活細(xì)胞都有毒性，不僅能殺死或抑制病原微生物，而且對人體

組織細(xì)胞也有損傷作用，所以只能用于體表、器械、排泄物和周圍環(huán)境的消毒。

常用的化學(xué)消毒劑有：石碳酸、來蘇水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。

像在做試驗(yàn)時(shí)可以用75%的酒精對手進(jìn)行消毒。

為了保證滅好菌的器皿和培養(yǎng)基不被污染都要將口包好密封，而且為了避

免微生物的滋生和繁殖，做完實(shí)驗(yàn)的器具必須先進(jìn)行滅菌再洗刷?？傊⑸?/p>

檢驗(yàn)既要保證環(huán)境的無菌又要保證操作規(guī)范不引入外來菌。

我想在座的各位其中應(yīng)該有罐頭生產(chǎn)企業(yè)，罐頭的微生物檢驗(yàn)要求商業(yè)無

菌，那我簡單的介紹一下商業(yè)無菌的檢測。首先打開一罐測一下PH值，PH值等

于或小于4.6的為酸性罐頭，大于4.6的為低酸性罐頭，然后最少取3罐進(jìn)行

保溫，低酸型于36℃±1℃保溫10天，酸性的于30℃±1℃保溫10天。保溫過

程中每天觀察，如有胖聽或泄漏等現(xiàn)象，立即剔出作開罐檢查。胖聽是由于罐

頭內(nèi)微生物活動(dòng)或化學(xué)作用產(chǎn)生氣體，形成正壓，使一端或兩端外凸的現(xiàn)象。

泄漏是罐頭密封結(jié)構(gòu)有缺陷，或由于撞擊而破壞密封，或罐壁腐蝕而穿孔致使

微生物侵入的現(xiàn)象。開罐檢查包括PH測定，看與開始時(shí)有否顯著差異；感官檢

查，外觀、色澤、狀態(tài)、氣味等進(jìn)行觀察和嗅聞、用餐具按住食品或戴薄紙?zhí)?/p>

以手指觸感，鑒別是否腐敗變質(zhì)。對感官或PH檢查結(jié)果認(rèn)為可疑的，進(jìn)行涂片

染色鏡檢。若是出現(xiàn)胖聽、泄漏或開罐檢查發(fā)現(xiàn)PH、感官異常、腐敗變質(zhì)，進(jìn)

一步鏡檢發(fā)現(xiàn)有異常，均應(yīng)及時(shí)進(jìn)行微生物接種培養(yǎng)。

以上就是我對食品中微生物檢測的一些總結(jié)和個(gè)人的理解和積累，希望對

大家有所幫助。謝謝大家!

第三節(jié)致病性微生物

食品首先是應(yīng)考慮其安全性，其次才是可食性和其他，食品中一旦含有致病性微生物，其

安全性就隨之喪失，當(dāng)然其食用性也不復(fù)存在了；各國的衛(wèi)生部門對致病性微生物都作了

嚴(yán)格的規(guī)定，把它作為食品衛(wèi)生質(zhì)量的最重要的指標(biāo)。

一、食品中常見的致病性微生物

食品生產(chǎn)是一個(gè)時(shí)間長、環(huán)節(jié)多的復(fù)雜過程?？傊?，與食品有直接和間接關(guān)系的致病性微

生物都可能污染食品。（以乳制品為例）

1、能引起人類疾病和食物中毒的致病性微生物：

沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等。

2、能產(chǎn)生毒襄并引起食物中毒的微生物：

肉毒梭菌、葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌，也包括一些真菌，都會(huì)產(chǎn)生毒素。

二、食品中致病性微生物的檢驗(yàn)

1、致病性微生物的檢驗(yàn)

按照國家統(tǒng)一的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

2、特例:

在加工食品中能夠存活下來的致病性微生物注往受到了某種程度的損傷，它們會(huì)受到增菌

液中抑制劑的影響而不能被檢測出來。因此，需要進(jìn)行前增菌，以幫助致病菌恢復(fù)到正常

狀態(tài)。前增菌的適宜方法和使用的培養(yǎng)基則因食品的理化性質(zhì)、加工方法不同而異。

以檢驗(yàn)沙門氏菌為例，干蛋品中的細(xì)菌用緩沖蛋白陳水進(jìn)行前增菌，脫脂乳粉中的細(xì)菌用

煌綠水進(jìn)行前增菌，全脂乳粉則用滅菌蒸儲(chǔ)水進(jìn)行前增菌，椰子用乳糖肉湯，干酵母用胰

酪月東大豆肉湯前增菌。

第四節(jié)細(xì)菌相與食品衛(wèi)生的關(guān)系

1、細(xì)菌相：指存在于某一物質(zhì)中的細(xì)菌種類及其相對數(shù)量的構(gòu)成。

食品中的各種細(xì)菌就構(gòu)成了該食品的細(xì)菌相，水中的細(xì)菌構(gòu)成了水的細(xì)菌相。細(xì)菌相是對

細(xì)菌的種類面言，在菌相中相對數(shù)量較大的一種或兒種細(xì)菌被稱為優(yōu)勢菌。

2、嗜冷菌：這類細(xì)菌在接近0℃時(shí)生長得比較好，最適溫度為10C—20℃,最高溫度在

30℃—35℃o

3、嗜溫菌：這類細(xì)菌都能在25℃氣40℃迅速生長，在55°。不生長。

4、嗜熱菌：這類細(xì)菌生長范圍為43℃?75℃,最適為50~C—55~C,在32c以下很難生長。

嗜溫菌和嗜熱菌的一些細(xì)菌在生長溫度范圍上有重迭，產(chǎn)生芽胞的細(xì)菌尤其如此。

一、細(xì)菌相對食品衛(wèi)生質(zhì)量的影響

1、新鮮畜禽肉的細(xì)菌相:

主要是嗜溫菌，包括大腸菌群、腸球菌、金黃色葡萄球菌、魏氏梭菌和沙門氏菌等。

新鮮肉類的細(xì)菌相以嗜溫菌為主，在溫度適宜時(shí)，嗜溫菌會(huì)大量繁殖造成肉的變質(zhì)，同時(shí)

發(fā)生臭味；在冷藏條件下，嗜溫菌生長很慢甚至不生長，嗜冷菌開始大量繁殖，逐漸成為

優(yōu)勢菌，最后會(huì)導(dǎo)致肉表面形成粘液并產(chǎn)生氣味；在冷凍條件下，所有的細(xì)菌都不再生長

繁殖，因而可以較長期保存而不變質(zhì)。

2、液體蛋晶的細(xì)菌相：

主要是革蘭氏陰性菌，包括假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、變形菌屬和埃希氏菌屬等。

3、鮮魚的細(xì)菌相

以嗜冷菌為主，有假單胞菌屬、黃色桿菌屬和弧菌屬等。

如在水產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)了沙門氏菌，一般認(rèn)為是外來污染，應(yīng)對該產(chǎn)品的生產(chǎn)，加工過程進(jìn)行

分析、檢測，從而找到污染源。

二、食品的正常菌相和細(xì)菌數(shù)量

食品及原料都有正常的細(xì)菌相，它們因受多種因素的影響，其種類和數(shù)量有很大差別。

1、鮮肉的細(xì)菌相以嗜溫菌為主，其次為嗜冷菌。加工良好的鮮肉細(xì)菌數(shù)為103個(gè)/g左右,

如加工不良會(huì)達(dá)到106個(gè)/g,肉制品的細(xì)菌數(shù)約為103—104個(gè)/g,大腸菌群MPN為

10—102個(gè)/100g,金黃色葡萄球菌為10—102個(gè)/g。

2、鮮蛋的細(xì)菌相以革蘭氏陽性球菌為主，革蘭氏陰性桿菌數(shù)量很少。

3、液體蛋晶的細(xì)菌相是革蘭氏陰性菌，包括假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、變形菌屬和埃希氏

菌屬，細(xì)菌數(shù)量一般為104?106個(gè)/g,大腸菌群為103?105個(gè)/100g,沙門氏菌為1—100

個(gè)/go

2、無菌操作

培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含

菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過程叫做無菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室

檢驗(yàn)中的各種接種必須是無菌操作。

圖5-4斜面接種時(shí)的無菌操作

（1）接種滅菌（2）開啟棉塞（3）管口滅菌（4）挑起菌苔（5）接種（6）塞好棉塞

志賀氏菌的檢驗(yàn)

一、增菌

稱取檢樣25g,加入裝有225mLGN增菌液的500mL廣口瓶內(nèi)，固體食品用均質(zhì)器以

8000-10000r/min打碎lmin,或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用金屬匙或玻璃棒研磨使

其乳化，于36℃培養(yǎng)6?8h。

培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)菌生長情況而定，當(dāng)培養(yǎng)液出現(xiàn)輕微混濁時(shí)即應(yīng)中止培養(yǎng)。

二、分離和初步生化試驗(yàn)

取增菌液1環(huán)，劃線接種于HE瓊脂平板或SS瓊脂平板1個(gè)；另取1環(huán)劃線接種于麥

康凱瓊脂平板和伊紅美藍(lán)瓊脂平板各1個(gè)，于36℃培養(yǎng)18?24h。

志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上呈現(xiàn)無色透明不發(fā)酵乳糖的菌落。

挑取平板上的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體各1管。一般應(yīng)多挑兒個(gè)菌

落,以防遺漏，經(jīng)36c培養(yǎng)18?24h,分別觀察結(jié)果。

下述培養(yǎng)物可以棄去：

a.在三糖鐵瓊脂斜面上呈蔓延生長的培養(yǎng)物；

b.在18?24h內(nèi)發(fā)酵乳糖、蔗糖的培養(yǎng)物；

c.不分解葡萄糖和只生長在半固體表面的培養(yǎng)物；

d.產(chǎn)氣的培養(yǎng)物；

e.有動(dòng)力的培養(yǎng)物；

f.產(chǎn)生硫化氫的培養(yǎng)物。

凡是乳糖、蔗糖不發(fā)酵，葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣（福氏志賀氏菌6型可產(chǎn)生少量氣體），無

動(dòng)力的菌株，可做血清學(xué)分型和進(jìn)一步的生化試驗(yàn)。

三、血清學(xué)分型

挑取三糖鐵瓊脂上的培養(yǎng)物，做玻片凝集試驗(yàn)。

先用4種志賀氏菌多價(jià)血清檢查，如果由于K抗原的存在而不出現(xiàn)凝集，應(yīng)將菌液煮

沸后再檢查；

如果呈現(xiàn)凝集，則用Al、A2、B群多價(jià)和D群血清分別試驗(yàn)。

如系B群福氏志賀氏菌，則用群和型因子血清分別檢查。福氏志賀氏菌各型和亞型的

型和群抗原見表1?？上扔萌阂蜃友鍣z查，再根據(jù)群因子血清出現(xiàn)凝集的結(jié)果，依次選用

型因子血清檢查。

4種志賀氏菌多價(jià)血清不凝集的菌株，可用鮑氏多價(jià)1、2、3分別檢查，并進(jìn)一步用1?

15各型因子血清檢查。如果鮑氏多價(jià)血清不凝集，可用痢疾志賀氏菌3?12型多價(jià)血清及

各型因子血清檢查。

四、進(jìn)一步的生化試驗(yàn)

在做血清學(xué)分型的同時(shí)，應(yīng)做進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，即：

葡萄糖鏤

西蒙氏檸檬酸鹽

賴氨酸和鳥氨酸脫竣酶

pH7.2尿素

KCN生長

水楊甘和七葉甘的分解

除宋內(nèi)氏菌和鮑氏13型為烏氨酸陽性外，志賀氏菌屬的培養(yǎng)物均為陰性結(jié)果。

。必要時(shí)還應(yīng)做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗(yàn)，應(yīng)為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生

化反應(yīng)不符合的菌株，即使能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集，仍不得判定為志賀氏菌

屬的培養(yǎng)物。

已判定為志賀氏菌屬的培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)一步做

5%乳糖發(fā)酵

甘露醇

棉子糖

甘油的發(fā)酵

靛基質(zhì)試驗(yàn)

志賀氏菌屬4個(gè)生化群的培養(yǎng)物，應(yīng)符合該群的生化特性。但福氏6型的生化特性與A

群或c群相似。

五、結(jié)果報(bào)告：綜合生化和血清學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果判定菌型并作出報(bào)告。

金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)

我們以SN標(biāo)準(zhǔn)中的最近似值(MPN)測定法來進(jìn)行講解：

這種方法適用于檢測認(rèn)為帶有大量競爭菌的食品及其原料和未經(jīng)處理的食品中的少量

金黃色葡萄球菌。

1＞樣品制備：

固體或半固體食品：以無菌操作稱取25g樣品,放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌均

質(zhì)杯內(nèi),于8000r/min均質(zhì)l~2min,制成1:10樣品勻液。

液體食品：用滅菌吸管吸取25mL樣品，放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內(nèi)

(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖制成1：10樣品勻液。

供計(jì)數(shù)檢驗(yàn)時(shí),可按十進(jìn)位遞增稀釋法將樣品勻液再進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

2、選三個(gè)連續(xù)稀釋度，從每個(gè)稀釋度分別取1mL稀釋樣品液，接種3管含10%氯化鈉why?

還記得么？金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10T5%NaCl肉湯中生長。因此，這事

實(shí)上是一種選擇性的增菌。胰蛋白月東大豆肉湯。樣品的最高稀釋度必須達(dá)到能獲得陰性終

點(diǎn)，置36±1℃培養(yǎng)48h0

3、用3mm接種環(huán)，從有細(xì)菌生長的各管中移取1環(huán)，劃線接種于表面干燥的Baird-Parker

瓊脂平板，置36±1℃培養(yǎng)45?48h。

4、從有細(xì)菌生長的每一平板上至少挑取1個(gè)可疑金黃色葡萄球菌菌落,移種到肉湯培養(yǎng)基

中，置36±1℃培養(yǎng)20?24ho

5、取肉湯培養(yǎng)物0.3mL同0.5mL凝固酶試驗(yàn)兔血漿于8mmX100mm試管內(nèi)充分混合,置

36±1℃培養(yǎng),定時(shí)觀察是否有凝塊形成,至少觀察6h,以內(nèi)容物完全凝固，使試管倒置或

傾斜時(shí)不流動(dòng)者為陽性。試驗(yàn)中需同時(shí)做巳知陽性和陰性對照。對可疑結(jié)果,應(yīng)進(jìn)行革蘭氏

染色、鏡檢和其他輔助試驗(yàn)｛如耐熱核酸酶試驗(yàn)等｝加以證實(shí)。

6、報(bào)告結(jié)果：根據(jù)凝固酶試驗(yàn)結(jié)果查最近似值(MPN)表,報(bào)告金黃色葡萄球菌的MPN/g

(mL)o

志賀氏菌的生物學(xué)特性

志賀氏菌屬(Shigella)的細(xì)菌(通稱痢疾桿菌)，是細(xì)菌性痢疾的病原菌人類對痢

疾桿菌有很高的易感性。在幼兒可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。

志賀氏菌和大腸桿菌都屬于腸桿菌科，根據(jù)DNA雜交研究結(jié)果表明，志賀氏菌屬的四

個(gè)種和大腸桿菌屬在生化上是難以區(qū)分的，因?yàn)橛挟a(chǎn)氣的志賀氏菌，也有乳糖陰性、不產(chǎn)

氣、不運(yùn)動(dòng)的大腸桿菌，有些大腸桿菌也能引起痢疾狀的腹瀉。

志賀氏菌的形態(tài)學(xué)特征：

志賀氏菌屬細(xì)菌的形態(tài)與一般腸道桿菌無明顯區(qū)別，為革蘭氏陰性桿菌，長約2-3um,

寬0.5-0.7Rmo不形成芽胞，無莢膜，無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，有菌毛。

志賀氏菌的培養(yǎng)特性:

需氧或兼性厭氧。營養(yǎng)要求不高，能在普通培養(yǎng)基上生長，最適溫度為37℃,最適pH

為6.4-7.80

37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)后菌落呈圓形、微凸、光滑濕潤、無色、半透明、邊緣整齊，直

徑約2nm,宋內(nèi)氏菌菌落一般較大，較不透明，并常出現(xiàn)扁平的粗糙型菌落。

在液體培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長，無菌膜形成。

志賀氏菌的生化特性：

本菌屬都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。大多不發(fā)酵乳糖，僅宋內(nèi)氏菌遲緩發(fā)酵乳糖。

靛基質(zhì)產(chǎn)生不定，甲基紅陽性，VP試驗(yàn)陰性，不分解尿素，不產(chǎn)生H2S。根據(jù)生化反應(yīng)可

進(jìn)行初步分類。

志賀氏菌屬的細(xì)菌對甘露醇分解能力不同，可分為二大組。

志賀氏菌的抗原構(gòu)造與分型：

志賀氏菌屬細(xì)菌的抗原結(jié)構(gòu)由菌體抗原（0）及表面抗原（K）組成。主要抗原有三種。

型特異性抗原、群特異性抗原、表面抗原（K抗原）。

根據(jù)抗原構(gòu)造的不同，按最新國際分類法，將本屬細(xì)菌分為四個(gè)群、39個(gè)血清型（包

括亞型）

志賀氏菌的抵抗力：

志賀氏菌屬在外界環(huán)境中的生存力，以宋內(nèi)氏最強(qiáng)，福氏菌次之，志賀氏菌最弱。

一般在潮濕土壤中能存活34天，37c水中存活20天，在糞便內(nèi)（室溫）存活H天。

日光直接照射30分鐘，56-60℃10分即被殺死，對高溫和化學(xué)消毒劑很敏感，1%石炭酸中

15-30分鐘即被殺死，對氯霉素、磺胺類、鏈霉素敏感，但易產(chǎn)生耐藥性。

志賀氏菌的變異性：

S-R型變異：菌落可由光滑型變?yōu)榇植谛停瑫r(shí)常伴有生化反應(yīng)、抗原構(gòu)造和致病性的

變異。在機(jī)體內(nèi)，尤其在慢性患者和恢復(fù)期患者，志賀氏菌可發(fā)生變異而失去原來的生化

和抗原特性，成為不典型菌株。但其中部分不典型菌株，可通過10%膽汁肉湯等返祖為典型

菌株。故在慢性患者或帶菌者糞便檢查時(shí).，對這類菌株要特別注意，必須多次反復(fù)檢查。

因這對傳染源的發(fā)現(xiàn)及控制有重要意義。

耐藥性變異：自從廣泛使用抗菌素以來，志賀氏菌的耐藥菌株不斷增加，給防治工作

帶來許多困難。國內(nèi)部分地區(qū)報(bào)道（1972-1974）,志賀氏菌對四環(huán)素的耐藥率達(dá)74%、氯

霉素73.6-97%、鏈霉素84-98%、合霉素75T00%、磺胺類97-100%,可見國內(nèi)對常用幾種

抗菌素的耐藥率相當(dāng)高。

毒力變異與其他變異：1963年南斯拉夫Mel氏首先創(chuàng)用依賴鏈霉素的志賀氏菌株（依

鏈Sd株，口服預(yù)防痢疾。Sd株是一株必須有鏈霉素存在下才能生長的菌株，其毒力減弱但

仍保持免疫原性。美國以天然變異無毒株與大腸桿菌雜交而獲得的MH株制成疫苗，其免疫

效果和穩(wěn)定性均較Sd株差。我國正大力利用變異方法通過動(dòng)物和藥物處理等尋找安全有效

可供口服的痢疾桿菌活菌苗，并已取得初步成效。

大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌的從屬關(guān)系及介紹

大腸菌群介紹總大腸菌耐熱大腸菌糞大腸菌群大腸桿菌

群群

致病性大腸菌0517

相互關(guān)系

大腸菌群（總大腸菌群）>糞大腸菌群&耐熱大腸菌群>大腸桿菌

一、大腸菌群介紹

大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個(gè)或某一屬細(xì)菌,

而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非

完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞

桿菌。一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸

桿菌等。

大腸菌群分布較廣，在溫血?jiǎng)游锛S便和自然界廣泛存在。調(diào)查研究表明，大腸菌群細(xì)菌多

存在于溫血?jiǎng)游锛S便、人類經(jīng)?；顒?dòng)的場所以及有糞便污染的地方，人、畜糞便對外界環(huán)

境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環(huán)

境中則以大腸菌群其他型別較多。

大腸菌群是作為糞便污染指標(biāo)菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否

糞便污染。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大

小。糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞

便內(nèi)除一般正常細(xì)菌外，同時(shí)也會(huì)有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌、志賀氏菌等），因

而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物

中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險(xiǎn)性。

大腸菌群是評價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，目前已被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作

中。

二、總大腸菌群

所謂總大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24小時(shí)能發(fā)酵乳酸、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革

蘭氏陰性無芽胞桿菌。

三、耐熱大腸菌群與糞大腸菌群的比較

北美國家一般使用“糞大腸菌群”概念，如AOAC、FDAoSN中的“糞大腸菌群”概

念為等同采用AOAC方法，故而使用糞大腸菌群概念；而歐洲使用“耐熱大腸菌群”概念,

較少使用“糞大腸菌群”。一般歐洲學(xué)者認(rèn)為，“糞大腸菌群”的提法不太科學(xué)，耐熱大腸

菌群的范圍比糞大腸菌群范圍大。

項(xiàng)目依據(jù)定義

在44.5℃培養(yǎng)，24h天內(nèi)能產(chǎn)

耐熱大腸菌群NMKL、ISO

酸產(chǎn)氣的細(xì)菌

在胰蛋白陳肉湯中于44.5℃,

NMKL24h內(nèi)產(chǎn)生口引跺的耐熱大腸菌

群

糞大腸菌群

于LST中36℃培養(yǎng)4