FTO介導(dǎo)m6A修飾促進(jìn)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞生長的機(jī)制探究

一、引言1.1研究背景與意義急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）是一種起源于T淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，在所有淋巴細(xì)胞白血病中占比約15%。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要由基因突變或染色體易位引發(fā)，導(dǎo)致調(diào)控T細(xì)胞發(fā)育和分化的關(guān)鍵蛋白異常，進(jìn)而促使白血病細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。例如，超過50%的T-ALL患者存在NOTCH1或與Notch1信號傳導(dǎo)相關(guān)基因的遺傳學(xué)改變，引發(fā)Notch1通路的組成型激活；超70%的患者因CDKN2A位點(diǎn)缺失，致使p16/INK4A和p14/ARF抑制基因缺失。此外，T細(xì)胞受體基因重排也是T-ALL常見的遺傳學(xué)異常，如TCR與HOX基因、LMO基因、TAL基因的易位。T-ALL的發(fā)病率雖相對其他類型白血病較低，但卻嚴(yán)重威脅人類健康。它可發(fā)生于所有人群，其中2至5歲的幼兒最為好發(fā)，且預(yù)后與患者年齡緊密相關(guān)。隨著多藥聯(lián)合強(qiáng)化療方案的應(yīng)用，T-ALL患兒的5年無事件生存期（EFS）已達(dá)70-75%，60歲以下成人的EFS為30-40%，60歲以上成人的EFS僅為10%。然而，該疾病極易復(fù)發(fā)，一旦復(fù)發(fā)，患者往往對化療產(chǎn)生耐藥性，預(yù)后極差，20%的兒童患者和大多數(shù)成年患者死于耐藥或復(fù)發(fā)性疾病。成人T-ALL的發(fā)病率約占成人ALL的25%，惡性程度高，治愈率和預(yù)后較差，患者在發(fā)病期間，淋巴細(xì)胞的異常增殖會破壞正常免疫反應(yīng)，擾亂免疫系統(tǒng)功能，還可能出現(xiàn)發(fā)熱、體重意外減輕、盜汗、感染、出血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累等藥物不良反應(yīng)，這些嚴(yán)重并發(fā)癥甚至?xí)＜吧?。在癌癥研究領(lǐng)域，N6-甲基腺苷（m6A）修飾成為研究熱點(diǎn)。m6A修飾是真核信使RNA（mRNA）中最常見的表觀轉(zhuǎn)錄組修飾，是一個動態(tài)且可逆的過程，對基因表達(dá)調(diào)控起著關(guān)鍵作用，參與多種生物過程，其失衡與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)。在急性髓系白血?。ˋML）中，METTL3增加m6A豐度可增強(qiáng)AML的細(xì)胞生長并抑制髓系分化，同時，F(xiàn)TO參與AML的延遲分化并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白（FTO）作為一種m6A去甲基化酶，是m6A修飾過程中的關(guān)鍵“eraser”，負(fù)責(zé)去除m6A修飾，在多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色。在白血病研究中，F(xiàn)TO被證實在AML的某些特定亞型中高表達(dá)，其表達(dá)增加可使人AML細(xì)胞存活率、增殖能力提高，促進(jìn)正常造血干/祖細(xì)胞（HSPC）的癌化，并抑制ATRA誘導(dǎo)的AML細(xì)胞分化，通過降低m6A修飾豐度、降低靶mRNA轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性，負(fù)調(diào)控ASB2和RARA表達(dá)，進(jìn)而影響白血病的發(fā)展進(jìn)程。在其他癌癥中，如肺鱗狀細(xì)胞癌，F(xiàn)TO通過降低m6A水平和mRNA穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)MZF1表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。探究FTO對T-ALL細(xì)胞生長的影響具有重要的科學(xué)意義和臨床價值。從發(fā)病機(jī)制角度來看，深入研究FTO在T-ALL中的作用，有助于揭示T-ALL發(fā)病的潛在分子機(jī)制，為理解T-ALL的發(fā)生、發(fā)展過程提供新的視角。目前對T-ALL發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識雖有進(jìn)展，但仍存在許多未知領(lǐng)域，F(xiàn)TO在其中的作用機(jī)制研究尚少，填補(bǔ)這一空白有助于完善T-ALL發(fā)病機(jī)制的理論體系。在治療方面，若能明確FTO與T-ALL細(xì)胞生長的關(guān)聯(lián)，有望將FTO作為新的治療靶點(diǎn)，為開發(fā)針對T-ALL的靶向治療藥物提供理論依據(jù)。當(dāng)前T-ALL的治療手段存在諸多局限性，如化療藥物療效差、不良反應(yīng)多，靶向藥物種類有限，開發(fā)新的靶向治療策略迫在眉睫，F(xiàn)TO為T-ALL的治療提供了新的方向和可能，有助于提高T-ALL的治療效果，改善患者預(yù)后，減輕患者痛苦，具有重要的臨床應(yīng)用前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在T-ALL發(fā)病機(jī)制研究方面，國內(nèi)外學(xué)者已取得諸多重要成果。國內(nèi)山東大學(xué)紀(jì)春巖及葉靜靜團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn)，基因改變在T-ALL的啟動和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，如notch受體1（NOTCH1）基因的突變會異常激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信號通路和表觀遺傳改變。國外研究也表明，超過50%的T-ALL患者存在NOTCH1或與Notch1信號傳導(dǎo)相關(guān)基因的遺傳學(xué)改變，引發(fā)Notch1通路的組成型激活；超70%的患者因CDKN2A位點(diǎn)缺失，致使p16/INK4A和p14/ARF抑制基因缺失。T細(xì)胞受體基因重排也是T-ALL常見的遺傳學(xué)異常，如TCR與HOX基因、LMO基因、TAL基因的易位。然而，目前對T-ALL發(fā)病機(jī)制的研究仍存在一些不足。雖然已明確多種基因改變和信號通路異常與T-ALL發(fā)病相關(guān)，但這些因素之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)尚未完全明晰，各信號通路之間如何協(xié)同調(diào)控T-ALL的發(fā)生、發(fā)展過程還需深入探究。在FTO與m6A修飾的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外都進(jìn)行了大量探索。國外研究最早鑒定出FTO是一種m6A去甲基化酶，開啟了m6A修飾動態(tài)可逆研究的新篇章。國內(nèi)研究進(jìn)一步深入解析了FTO去除m6A修飾的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)FTO通過其去甲基化酶活性，特異性識別并結(jié)合含有m6A修飾的RNA底物，利用α-酮戊二酸（α-KG）依賴的雙加氧酶活性，催化m6A位點(diǎn)的去甲基化反應(yīng)，從而調(diào)控基因表達(dá)。在多種生理和病理過程中對FTO與m6A修飾的作用也有了較多研究。在胚胎發(fā)育過程中，F(xiàn)TO介導(dǎo)的m6A修飾對維持胚胎干細(xì)胞的多能性和分化潛能至關(guān)重要；在腫瘤發(fā)生發(fā)展方面，F(xiàn)TO通過調(diào)控m6A修飾影響癌基因和抑癌基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。不過，目前對于FTO在不同組織和細(xì)胞類型中對m6A修飾的特異性調(diào)控機(jī)制，以及FTO與其他m6A修飾相關(guān)蛋白之間的相互作用關(guān)系，仍有待進(jìn)一步研究。不同組織和細(xì)胞中m6A修飾的分布和功能存在差異，F(xiàn)TO如何精準(zhǔn)調(diào)控這些特異性修飾，以及與其他“writer”“reader”蛋白如何協(xié)同作用，尚不清楚。在FTO在白血病中作用的研究方面，國內(nèi)外也取得了一定進(jìn)展。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO在急性髓系白血病（AML）的某些特定亞型中高表達(dá)，其表達(dá)增加可使人AML細(xì)胞存活率、增殖能力提高，促進(jìn)正常造血干/祖細(xì)胞（HSPC）的癌化，并抑制ATRA誘導(dǎo)的AML細(xì)胞分化，通過降低m6A修飾豐度、降低靶mRNA轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性，負(fù)調(diào)控ASB2和RARA表達(dá)，進(jìn)而影響白血病的發(fā)展進(jìn)程。國外研究團(tuán)隊也在探索FTO在白血病中的作用機(jī)制，以及針對FTO的靶向治療策略。但當(dāng)前FTO在白血病中的研究仍存在局限。雖然已明確FTO在部分白血病亞型中的作用及機(jī)制，但對于不同白血病亞型，F(xiàn)TO的作用是否存在差異，以及如何針對這些差異開發(fā)更精準(zhǔn)的治療策略，還需要進(jìn)一步研究。在臨床應(yīng)用方面，針對FTO的靶向藥物研發(fā)尚處于早期階段，面臨著藥物特異性、有效性和安全性等諸多挑戰(zhàn)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究FTO對急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）細(xì)胞生長的影響，并揭示其潛在的分子機(jī)制，為T-ALL的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體研究目標(biāo)如下：明確FTO表達(dá)水平與T-ALL細(xì)胞生長之間的關(guān)系，包括FTO高表達(dá)或低表達(dá)對T-ALL細(xì)胞增殖、凋亡、周期等生物學(xué)行為的影響。探究FTO影響T-ALL細(xì)胞生長過程中，對關(guān)鍵基因的m6A修飾水平及相關(guān)信號通路的調(diào)控作用。解析FTO促進(jìn)T-ALL細(xì)胞生長的分子機(jī)制，確定FTO的直接作用靶點(diǎn)及上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。基于上述研究目標(biāo)，本研究將開展以下內(nèi)容：FTO表達(dá)與T-ALL細(xì)胞生長關(guān)系研究：通過檢測不同T-ALL細(xì)胞系及臨床樣本中FTO的表達(dá)水平，分析其與T-ALL細(xì)胞生長狀態(tài)、患者預(yù)后等的相關(guān)性。運(yùn)用基因編輯技術(shù)，構(gòu)建FTO過表達(dá)和敲低的T-ALL細(xì)胞模型，通過CCK-8、EdU、克隆形成等實驗檢測細(xì)胞增殖能力；通過AnnexinV-FITC/PI雙染、TUNEL等實驗檢測細(xì)胞凋亡情況；通過PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布，明確FTO對T-ALL細(xì)胞生長的影響。FTO對關(guān)鍵基因及信號通路影響研究：利用MeRIP-seq、RNA-seq等高通量測序技術(shù)，篩選出FTO調(diào)控T-ALL細(xì)胞生長過程中，發(fā)生m6A修飾變化的關(guān)鍵基因及差異表達(dá)基因，通過生物信息學(xué)分析，富集相關(guān)信號通路。運(yùn)用qRT-PCR、Westernblot、免疫組化等實驗技術(shù)，驗證關(guān)鍵基因和信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。采用信號通路抑制劑或激動劑處理T-ALL細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長及關(guān)鍵基因表達(dá)變化，明確FTO對關(guān)鍵信號通路的調(diào)控作用。FTO促進(jìn)T-ALL細(xì)胞生長分子機(jī)制研究：通過RNApull-down、RIP等實驗技術(shù)，確定FTO直接結(jié)合的RNA靶點(diǎn)，驗證FTO對靶點(diǎn)mRNA的m6A修飾及穩(wěn)定性的影響。運(yùn)用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，驗證FTO對靶點(diǎn)基因啟動子活性的調(diào)控作用。通過構(gòu)建小鼠T-ALL模型，體內(nèi)驗證FTO對T-ALL細(xì)胞生長的影響及分子機(jī)制，為臨床治療提供實驗依據(jù)。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究將綜合運(yùn)用多種研究方法，從細(xì)胞水平、動物水平和分子水平深入探究FTO對急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）細(xì)胞生長的影響及分子機(jī)制，具體研究方法如下：細(xì)胞實驗：選取多種T-ALL細(xì)胞系，如Jurkat、Molt-4等，以及正常T淋巴細(xì)胞作為對照。通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在適宜的培養(yǎng)條件下維持細(xì)胞生長。運(yùn)用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建FTO過表達(dá)和敲低的T-ALL細(xì)胞模型。利用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性，通過檢測細(xì)胞在不同時間點(diǎn)的吸光度值，繪制細(xì)胞生長曲線，直觀反映細(xì)胞增殖情況；采用EdU實驗，標(biāo)記正在進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察EdU陽性細(xì)胞的比例，準(zhǔn)確評估細(xì)胞增殖能力；進(jìn)行克隆形成實驗，將單細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)一定時間后，計數(shù)形成的細(xì)胞克隆數(shù)，分析細(xì)胞的克隆形成能力，以進(jìn)一步了解FTO對T-ALL細(xì)胞增殖的影響。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞；采用TUNEL法，標(biāo)記凋亡細(xì)胞中的DNA斷裂末端，通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞數(shù)量，全面分析FTO對T-ALL細(xì)胞凋亡的影響。通過PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，分析細(xì)胞周期分布，檢測G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的比例，探究FTO對T-ALL細(xì)胞周期的調(diào)控作用。動物實驗：選用免疫缺陷小鼠，如NOD/SCID小鼠，構(gòu)建小鼠T-ALL模型。將過表達(dá)或敲低FTO的T-ALL細(xì)胞通過尾靜脈注射或皮下注射的方式接種到小鼠體內(nèi)，觀察小鼠的發(fā)病情況，包括體重變化、精神狀態(tài)、外周血白細(xì)胞計數(shù)等指標(biāo)。定期處死小鼠，取骨髓、脾臟、肝臟等組織，進(jìn)行病理分析，通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組化檢測FTO及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗證FTO對T-ALL細(xì)胞生長的影響。分子生物學(xué)技術(shù)：利用MeRIP-seq技術(shù)，對FTO過表達(dá)和敲低的T-ALL細(xì)胞進(jìn)行m6A修飾測序，篩選出發(fā)生m6A修飾變化的關(guān)鍵基因；運(yùn)用RNA-seq技術(shù)，分析細(xì)胞中基因表達(dá)譜的變化，篩選出差異表達(dá)基因。通過生物信息學(xué)分析，對篩選出的基因進(jìn)行功能富集分析，如GO富集分析和KEGG通路富集分析，明確FTO調(diào)控T-ALL細(xì)胞生長過程中涉及的主要生物學(xué)功能和信號通路。采用qRT-PCR技術(shù)，檢測關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)水平，驗證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性；運(yùn)用Westernblot技術(shù)，檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，分析FTO對關(guān)鍵基因和信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。利用免疫組化技術(shù)，檢測組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位，進(jìn)一步了解FTO在體內(nèi)對關(guān)鍵基因和信號通路的調(diào)控作用。通過RNApull-down實驗，結(jié)合質(zhì)譜分析，確定FTO直接結(jié)合的RNA靶點(diǎn)；運(yùn)用RIP實驗，驗證FTO與靶點(diǎn)RNA的相互作用。通過mRNA穩(wěn)定性實驗，如放線菌素D處理實驗，檢測靶點(diǎn)mRNA的半衰期，分析FTO對靶點(diǎn)mRNA穩(wěn)定性的影響。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒炞CFTO對靶點(diǎn)基因啟動子活性的調(diào)控作用，明確FTO在分子水平上促進(jìn)T-ALL細(xì)胞生長的作用機(jī)制。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示，首先收集T-ALL細(xì)胞系及臨床樣本，檢測FTO表達(dá)水平并分析其與細(xì)胞生長和患者預(yù)后的相關(guān)性。接著構(gòu)建FTO過表達(dá)和敲低的T-ALL細(xì)胞模型及小鼠T-ALL模型，通過細(xì)胞實驗和動物實驗檢測FTO對T-ALL細(xì)胞生長的影響。然后利用高通量測序技術(shù)篩選關(guān)鍵基因和信號通路，通過分子生物學(xué)實驗驗證FTO對關(guān)鍵基因和信號通路的調(diào)控作用，確定FTO直接作用靶點(diǎn)及上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終揭示FTO促進(jìn)T-ALL細(xì)胞生長的分子機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中應(yīng)清晰展示從樣本收集、模型構(gòu)建、實驗檢測到機(jī)制解析的整個研究流程，各步驟之間用箭頭連接，注明主要實驗方法和技術(shù)]二、急性T淋巴細(xì)胞白血病及FTO相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1急性T淋巴細(xì)胞白血病概述急性T淋巴細(xì)胞白血病（T-ALL）是急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）的一種重要病理類型，是一類起源于T淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。在正常生理狀態(tài)下，T淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞在骨髓中產(chǎn)生，隨后遷移至胸腺進(jìn)行發(fā)育和成熟，這一過程受到多種基因和信號通路的精確調(diào)控，以確保T淋巴細(xì)胞具備正常的免疫功能。然而，在T-ALL患者體內(nèi)，T系前體細(xì)胞在骨髓和胸腺中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程出現(xiàn)嚴(yán)重紊亂。這些異常的白血病細(xì)胞呈現(xiàn)出不受控制的克隆性擴(kuò)增特性，大量積聚在骨髓、血液以及其他淋巴組織中，逐漸取代正常的造血干細(xì)胞和免疫細(xì)胞，導(dǎo)致正常造血功能被嚴(yán)重破壞。從分類角度來看，依據(jù)細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況，T-ALL可細(xì)分為多個亞型。其中，流式細(xì)胞儀檢測原始/前體細(xì)胞胞漿CD3陽性是診斷T-ALL的關(guān)鍵指標(biāo)之一，在此基礎(chǔ)上，再結(jié)合其他T系標(biāo)志分子表達(dá)情況，可將其分為4個主要亞型。這種免疫表型分型對于評估成人T-ALL的預(yù)后具有重要指導(dǎo)意義，T-Ⅱ和T-Ⅲ是成人T-ALL的常見類型，二者約占85%。研究表明，T-Ⅰ和T-Ⅱ亞型的完全緩解率顯著低于T-Ⅲ和T-Ⅳ，這可能與成人T-ALL中CD34、CD13及CD33陽性表達(dá)高，以及復(fù)雜核型比例高密切相關(guān)。對于兒童T-ALL患者，免疫表型的預(yù)后評估意義相對不及成人。2016年WHO造血與淋巴系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)提出了早期前體T淋巴母細(xì)胞白血?。‥TP-ALL）這一暫定分類，該亞型在細(xì)胞生物學(xué)行為和臨床特征等方面與其他類型T-ALL存在顯著差異。例如，早期T前體細(xì)胞高表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志分子CD34、CD117等，以及髓系標(biāo)志分子CD13、CD33等，且造血干細(xì)胞和（或）髓系標(biāo)志分子陽性率≥25%，使其具有髓系分化潛能，卻不具備典型的淋系分化潛能；不表達(dá)CD1a和CD8或CD5弱表達(dá)，提示ETP白血病細(xì)胞具有干細(xì)胞生物學(xué)特征，如增殖活躍、自我更新增強(qiáng)；FLT3基因突變率（35%）高于Notch突變率（7.1%），58%的ETP-ALL存在RUNX1、IKZF1、ETV6、BCL2、GATA3和EP300等基因突變，這也為靶向藥物治療提供了潛在的靶點(diǎn)和方向；ETP-ALL約占兒童T-ALL的5.5%-16.2%，占成人T-ALL的7.4%-11.4%，無明顯年齡分布特征，但成年人ETP-ALL在分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)及表觀遺傳學(xué)改變方面具有高度異質(zhì)性；ETP-ALL患者較非ETP的ALL患者預(yù)后更差，10年總生存率和無事件生存率分別僅為19%、22%。在發(fā)病率方面，T-ALL可發(fā)生于所有人群，不過兒童和青少年是高發(fā)群體，成人也有一定比例發(fā)病。在兒童ALL患者中，T-ALL所占比例約為10%-15%，在成人患者中，這一比例約為25%。T-ALL的危害不容小覷，它不僅會嚴(yán)重破壞正常造血功能，導(dǎo)致患者出現(xiàn)貧血、發(fā)熱、出血等癥狀，還會因白血病細(xì)胞的增殖浸潤，引發(fā)肝脾顯著腫大、縱隔占位等問題，其中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血?。–NSL）的發(fā)生率高于B-ALL，20%的T-ALL患者在初診時即已存在CNSL。從歷史數(shù)據(jù)來看，T-ALL的復(fù)發(fā)率較高，緩解率較差，遠(yuǎn)期生存率較低。在兒童ALL臨床分型中，T-ALL至少屬于中危類型，單純化療的治療效果欠佳，且容易復(fù)發(fā)。但隨著治療方案的不斷改進(jìn)，如優(yōu)化甲氨蝶呤（MTX）治療劑量，以及檢測水平的顯著提高，像監(jiān)測微小殘留?。∕RD）水平及手段的進(jìn)步等，兒童T-ALL的預(yù)后得到了顯著改善，5年無事件生存率已達(dá)到80%。成人T-ALL的治療后生存預(yù)后則比兒童更差，約50%的成人患者在治療緩解后一年左右復(fù)發(fā)，再次化療的緩解率僅為30%-45%，最終僅有40%的患者能夠?qū)崿F(xiàn)長期生存，而復(fù)發(fā)/難治型的T-ALL患者預(yù)后通常更為糟糕。目前，T-ALL的診斷主要依賴于多種檢測手段的綜合應(yīng)用。血象檢查中，初診外周血白細(xì)胞（WBC）計數(shù)明顯升高，有臨床統(tǒng)計顯示，在68例患者樣本中，68.2%的患者初診WBC計數(shù)≥50×109/L。MICM檢測是診斷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，形態(tài)學(xué)上，以骨髓中原始及幼稚淋巴細(xì)胞占20%以上作為診斷依據(jù)，同時需要對白血病細(xì)胞進(jìn)行表面抗原表達(dá)情況檢測，以明確細(xì)胞來源；免疫學(xué)方面，通過流式細(xì)胞儀檢測原始/前體細(xì)胞胞漿CD3陽性可診斷T-ALL，并依據(jù)其他T系標(biāo)志分子表達(dá)進(jìn)行亞型分類；細(xì)胞遺傳學(xué)檢測顯示，T-ALL染色體易位發(fā)生率低于B-ALL，異常核型發(fā)生率約為25%-50%，其中9p21區(qū)域小缺失所致p16抑癌基因失活最為常見，發(fā)生率可達(dá)70%，但此類染色體異常與預(yù)后的關(guān)系尚不明確；分子生物學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，T-ALL分子遺傳學(xué)異常涉及的信號傳導(dǎo)路徑主要有NOTCH、PI3K/Akt/mTOR、IL-7R/Jak/Stat等，約60%的兒童T-ALL具有Notch1基因激活突變。此外，由于T-ALL發(fā)生CNSL的幾率較高，當(dāng)懷疑患者存在CNSL時，常需檢測腦脊液壓力、白細(xì)胞數(shù)量，甚至查找腦脊液中的白血病細(xì)胞。在治療方面，當(dāng)前T-ALL的治療仍采用與B-ALL相同的化療方案，但鑒于T-ALL的特點(diǎn)，其治療原則存在一定差異。治療推薦采用強(qiáng)烈全身化療，并高度注重CNSL的防治。由于T-ALL在誘導(dǎo)緩解過程中對藥物的反應(yīng)不如B-ALL敏感，因此，強(qiáng)烈誘導(dǎo)化療、在短期內(nèi)顯著降低白血病負(fù)荷，對于提高誘導(dǎo)化療成功率和降低復(fù)發(fā)率至關(guān)重要。同時，需對患者的治療效果進(jìn)行及時評估，對于預(yù)計需要進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）的患者，應(yīng)提前做好移植準(zhǔn)備。盡管現(xiàn)有的治療手段在一定程度上改善了T-ALL患者的預(yù)后，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。化療藥物在殺傷白血病細(xì)胞的同時，也會對正常細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等，影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。部分患者會對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，使得治療效果大打折扣，復(fù)發(fā)風(fēng)險增加。對于復(fù)發(fā)/難治型T-ALL患者，目前缺乏有效的治療手段，患者的生存率極低。allo-HSCT雖然是一種有效的治療方法，但存在供體來源有限、移植后并發(fā)癥多、費(fèi)用高昂等問題，限制了其廣泛應(yīng)用。2.2FTO蛋白及其功能FTO基因在生物進(jìn)化過程中具有相當(dāng)古老的歷史，普遍存在于脊椎動物之中，然而在非脊椎生物里卻難覓其蹤。人類FTO基因定位于第16號染色體的16q12.2區(qū)域，基因長度達(dá)410.50kb，包含9個外顯子，其編碼的FTO蛋白由505個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為59kDa。FTO基因在人體組織的各個發(fā)育階段均有廣泛表達(dá)，尤其在下丘腦、骨骼肌、脂肪、肝臟、胰腺等組織中呈現(xiàn)高表達(dá)態(tài)勢。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，F(xiàn)TO的表達(dá)較為廣泛，且在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，這表明FTO在神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能維持中可能發(fā)揮著重要作用。FTO蛋白屬于α-酮戊二酸（α-KG）依賴的雙加氧酶家族，其催化結(jié)構(gòu)域與DNA修復(fù)酶AlkB高度相似，具備去甲基化酶活性。FTO可以利用α-KG作為輔助因子，在Fe2+和氧氣的參與下，催化m6A修飾的RNA發(fā)生去甲基化反應(yīng)，將m6A轉(zhuǎn)化為普通的腺苷（A）。這種去甲基化作用能夠改變RNA的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響基因表達(dá)。在細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)TO主要定位于細(xì)胞核中，這與其對核內(nèi)RNA的m6A修飾調(diào)控功能相契合，但在細(xì)胞質(zhì)中也能檢測到一定量的FTO，提示其可能在細(xì)胞質(zhì)中也參與RNA代謝過程。在正常生理過程中，F(xiàn)TO參與了多種重要的生物學(xué)調(diào)控。在能量代謝方面，F(xiàn)TO基因與肥胖密切相關(guān)，其單核苷酸多態(tài)性（SNP）與肥胖風(fēng)險顯著相關(guān)。攜帶特定FTO基因變異的個體，肥胖風(fēng)險大幅增加，這可能是因為FTO通過調(diào)控下丘腦相關(guān)基因的表達(dá)，影響食欲和能量平衡。FTO基因的rs9939609多態(tài)性位點(diǎn)與BMI顯著相關(guān)，攜帶風(fēng)險等位基因的個體，BMI更高，能量攝入增加，能量消耗減少。在胚胎發(fā)育過程中，F(xiàn)TO也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。敲除小鼠的FTO基因會導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，如胚胎致死、生長遲緩等，這表明FTO對于胚胎的正常發(fā)育不可或缺。在小鼠胚胎干細(xì)胞中，F(xiàn)TO通過調(diào)控m6A修飾水平，影響干細(xì)胞的自我更新和分化能力，維持胚胎干細(xì)胞的多能性。在疾病方面，F(xiàn)TO與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展緊密相連。在腫瘤領(lǐng)域，F(xiàn)TO的作用較為復(fù)雜，在不同腫瘤中表現(xiàn)出不同的功能。在急性髓系白血?。ˋML）中，F(xiàn)TO高表達(dá)可促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖、存活，抑制細(xì)胞分化，通過降低ASB2和RARA等基因mRNA的m6A修飾水平，降低其穩(wěn)定性，進(jìn)而影響白血病的發(fā)展進(jìn)程。在乳腺癌中，F(xiàn)TO同樣高表達(dá)，通過調(diào)控m6A修飾，影響相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在胃癌中，F(xiàn)TO的表達(dá)與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)的FTO可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。除了腫瘤，F(xiàn)TO還與代謝性疾病密切相關(guān)。在2型糖尿病中，F(xiàn)TO基因變異與糖尿病的發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)，可能是通過影響胰島素分泌、胰島素敏感性以及能量代謝等多個環(huán)節(jié)，參與糖尿病的發(fā)病過程。FTO作為一種重要的m6A去甲基化酶，在正常生理和疾病狀態(tài)下都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其對基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，涉及多個生物學(xué)過程和信號通路，深入研究FTO的功能和作用機(jī)制，對于理解相關(guān)生理和病理過程具有重要意義。2.3m6A修飾與基因表達(dá)調(diào)控m6A修飾是指在真核生物RNA的腺嘌呤（A）殘基的第6位氮原子上添加甲基基團(tuán)的化學(xué)修飾過程，是真核生物mRNA中最常見的一種轉(zhuǎn)錄后修飾。這種修飾廣泛存在于各種RNA分子中，包括mRNA、非編碼RNA（如lncRNA、circRNA等）。m6A修飾在mRNA上的分布并非隨機(jī)，而是呈現(xiàn)出一定的偏好性。大量研究表明，m6A修飾主要富集于mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）、終止密碼子附近以及長外顯子區(qū)域。在3’UTR區(qū)域，m6A修飾可能與mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率以及mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)等過程密切相關(guān)；在終止密碼子附近，m6A修飾可能影響翻譯的終止和核糖體的解離；長外顯子區(qū)域的m6A修飾則可能參與mRNA的剪接過程。m6A修飾的形成是一個動態(tài)且可逆的過程，由多種酶共同參與調(diào)控。其中，負(fù)責(zé)添加m6A修飾的酶被稱為“writers”，主要包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶樣14（METTL14）、Wilms腫瘤1關(guān)聯(lián)蛋白（WTAP）等。METTL3和METTL14可形成穩(wěn)定的異源二聚體，其中METTL3具有催化活性，能夠?qū)⒓谆鶊F(tuán)從S-腺苷甲硫氨酸（SAM）轉(zhuǎn)移到RNA的腺嘌呤殘基上，實現(xiàn)m6A修飾的添加；METTL14則主要負(fù)責(zé)增強(qiáng)METTL3與RNA底物的結(jié)合能力，促進(jìn)m6A修飾的發(fā)生。WTAP作為一種輔助蛋白，能夠與METTL3-METTL14復(fù)合物相互作用，調(diào)節(jié)復(fù)合物在細(xì)胞核內(nèi)的定位和活性，進(jìn)而影響m6A修飾的效率和特異性。此外，還有一些其他的輔助因子，如VIRMA、ZC3H13、HAKAI和RBM15/RBM15B等，也參與到m6A修飾的過程中，它們與METTL3-METTL14-WTAP復(fù)合物共同構(gòu)成了m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，協(xié)同完成m6A修飾的添加。去除m6A修飾的酶被稱為“erasers”，主要包括脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白（FTO）和AlkB同源物5（ALKBH5）。FTO和ALKBH5都屬于α-酮戊二酸（α-KG）依賴的雙加氧酶家族，它們能夠利用α-KG作為輔助因子，在Fe2+和氧氣的參與下，催化m6A修飾的RNA發(fā)生去甲基化反應(yīng)，將m6A轉(zhuǎn)化為普通的腺苷（A）。FTO對不同類型的RNA底物具有一定的選擇性，除了mRNA外，還能夠?qū)σ恍┓蔷幋aRNA進(jìn)行去甲基化修飾；ALKBH5則主要作用于mRNA，其去甲基化活性在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮重要作用，對維持mRNA的m6A修飾平衡至關(guān)重要。通過“writers”和“erasers”的協(xié)同作用，細(xì)胞內(nèi)的m6A修飾水平得以動態(tài)調(diào)控，維持在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，以滿足細(xì)胞正常生理功能的需求。能夠識別并結(jié)合m6A修飾位點(diǎn)的蛋白被稱為“readers”，它們通過特異性識別m6A修飾，介導(dǎo)m6A修飾對RNA代謝和功能的調(diào)控作用。常見的“readers”蛋白包括YTH結(jié)構(gòu)域蛋白家族（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2）、胰島素樣生長因子2mRNA結(jié)合蛋白家族（IGF2BPs）、異質(zhì)核核糖核蛋白家族（hnRNPs）等。YTHDF1能夠與m6A修飾的mRNA結(jié)合，招募真核翻譯起始因子3（eIF3），促進(jìn)mRNA的翻譯過程，提高蛋白質(zhì)的合成效率；YTHDF2則主要通過與m6A修飾的mRNA結(jié)合，將其靶向到細(xì)胞內(nèi)的降解機(jī)制，促進(jìn)mRNA的降解，從而調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性和豐度；YTHDF3可以與YTHDF1和YTHDF2相互作用，協(xié)同調(diào)節(jié)mRNA的翻譯和降解過程。IGF2BPs能夠識別并結(jié)合m6A修飾的mRNA，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)其翻譯過程，在細(xì)胞增殖、分化等過程中發(fā)揮重要作用；hnRNPs家族中的一些成員，如hnRNPA2B1等，也能夠識別m6A修飾位點(diǎn)，參與mRNA的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯等過程。m6A修飾對基因表達(dá)的調(diào)控作用貫穿于RNA代謝的各個環(huán)節(jié)，包括轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和降解等過程。在轉(zhuǎn)錄水平，m6A修飾可以通過影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，間接調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸。研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾能夠改變?nèi)旧|(zhì)的可及性，使某些基因區(qū)域更容易被轉(zhuǎn)錄因子識別和結(jié)合，從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄；m6A修飾還可以通過與一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相互作用，影響轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組裝和活性，進(jìn)而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄效率。在剪接過程中，m6A修飾可以影響mRNA前體的剪接方式，導(dǎo)致不同的剪接異構(gòu)體產(chǎn)生。m6A修飾可能通過干擾剪接因子與mRNA前體的結(jié)合，或者作為某些RNA結(jié)合蛋白的對接位點(diǎn)，影響剪接體的組裝和功能，從而調(diào)控mRNA的選擇性剪接。在mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，m6A修飾也發(fā)揮著重要作用。研究表明，m6A修飾可以促進(jìn)mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，保證mRNA能夠及時到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯。具體機(jī)制可能是m6A修飾與一些參與mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白相互作用，形成特定的轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物，協(xié)助mRNA通過核孔復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在翻譯水平，m6A修飾對mRNA的翻譯效率有著顯著影響。如前文所述，YTHDF1等“readers”蛋白能夠與m6A修飾的mRNA結(jié)合，招募翻譯起始因子，促進(jìn)mRNA的翻譯過程，提高蛋白質(zhì)的合成效率；而在某些情況下，m6A修飾也可能抑制mRNA的翻譯，具體機(jī)制可能與m6A修飾位點(diǎn)的位置、周圍的核苷酸序列以及與之相互作用的“readers”蛋白等因素有關(guān)。在mRNA的降解過程中，m6A修飾同樣起著關(guān)鍵調(diào)控作用。YTHDF2等蛋白能夠識別并結(jié)合m6A修飾的mRNA，將其招募到細(xì)胞內(nèi)的降解機(jī)制，如CCR4-NOT去乙?；笍?fù)合物、HRSP12-RNaseP-MRP復(fù)合物等，促進(jìn)mRNA的降解，從而調(diào)節(jié)mRNA的半衰期和豐度。此外，m6A修飾還可以通過與microRNA（miRNA）的相互作用，間接影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯過程。研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾與miRNA結(jié)合位點(diǎn)之間存在著很強(qiáng)的相關(guān)性，m6A修飾可能影響miRNA與mRNA的互補(bǔ)配對，從而調(diào)控miRNA對mRNA的降解和翻譯抑制作用。m6A修飾作為一種重要的RNA表觀遺傳修飾，通過其動態(tài)可逆的修飾過程以及與“writers”“erasers”“readers”等蛋白的相互作用，廣泛參與基因表達(dá)的調(diào)控，對RNA代謝的各個環(huán)節(jié)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，在細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化以及疾病的發(fā)生、發(fā)展等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。三、FTO與急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞生長關(guān)系的研究3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料細(xì)胞系：選用人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat和Molt-4，這兩種細(xì)胞系在T-ALL研究中應(yīng)用廣泛，具有典型的T-ALL細(xì)胞特征。同時，選取正常T淋巴細(xì)胞作為對照，用于對比分析FTO在正常與病變T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)差異及對細(xì)胞生長的不同影響。正常T淋巴細(xì)胞取自健康志愿者的外周血，通過密度梯度離心法分離獲得，確保細(xì)胞的純度和活性。動物模型：選用6-8周齡的雌性NOD/SCID小鼠，購自[供應(yīng)商名稱]。該品系小鼠免疫缺陷，對人源細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)低，適合用于構(gòu)建人急性T淋巴細(xì)胞白血病的異種移植模型。小鼠飼養(yǎng)于特定病原體（SPF）級動物房，環(huán)境溫度控制在22±2℃，相對濕度為50%-60%，12小時光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水，以確保小鼠處于良好的生理狀態(tài)，減少環(huán)境因素對實驗結(jié)果的干擾。主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基購自[品牌名稱]，富含多種營養(yǎng)成分，適合T淋巴細(xì)胞的生長和增殖；胎牛血清（FBS）購自[品牌名稱]，為細(xì)胞提供生長所需的各種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)；青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自[品牌名稱]，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染；胰蛋白酶購自[品牌名稱]，用于細(xì)胞的消化傳代；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自[品牌名稱]，具有高效的轉(zhuǎn)染效率，可將外源基因?qū)爰?xì)胞；FTO過表達(dá)質(zhì)粒和shRNA干擾質(zhì)粒由[公司名稱]合成，序列經(jīng)過優(yōu)化設(shè)計，確保過表達(dá)和干擾效果的特異性；CCK-8試劑盒購自[品牌名稱]，用于檢測細(xì)胞增殖活性；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自[品牌名稱]，可準(zhǔn)確區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞；PI染色液購自[品牌名稱]，用于細(xì)胞周期分析；RNA提取試劑盒購自[品牌名稱]，能夠高效提取細(xì)胞中的總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自[品牌名稱]，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)的qRT-PCR檢測；qRT-PCR試劑購自[品牌名稱]，具有高靈敏度和特異性，用于檢測基因的mRNA表達(dá)水平；BCA蛋白定量試劑盒購自[品牌名稱]，用于測定細(xì)胞裂解液中的蛋白濃度；Westernblot相關(guān)試劑，包括SDS凝膠制備試劑盒、轉(zhuǎn)膜緩沖液、封閉液、一抗和二抗等，均購自[品牌名稱]，用于檢測蛋白的表達(dá)水平。一抗包括抗FTO抗體、抗增殖相關(guān)蛋白Ki-67抗體、抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax抗體等，二抗為相應(yīng)的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠抗體。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱購自[品牌名稱]，能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境；超凈工作臺購自[品牌名稱]，通過過濾空氣，提供無菌的操作空間；倒置顯微鏡購自[品牌名稱]，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；流式細(xì)胞儀購自[品牌名稱]，可對細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等；實時熒光定量PCR儀購自[品牌名稱]，用于定量檢測基因的mRNA表達(dá)水平；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購自[品牌名稱]，用于Westernblot實驗中的蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜；酶標(biāo)儀購自[品牌名稱]，用于讀取CCK-8實驗中的吸光度值。3.1.2實驗方法細(xì)胞培養(yǎng)：將Jurkat和Molt-4細(xì)胞接種于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，加入適量的胰蛋白酶消化液，37℃孵育1-2分鐘，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后，按1:3-1:5的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。正常T淋巴細(xì)胞在相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，但培養(yǎng)基中需添加適量的白細(xì)胞介素-2（IL-2），以促進(jìn)其生長和維持活性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將處于對數(shù)生長期的Jurkat和Molt-4細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞密度為1×10?個，培養(yǎng)24小時，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將FTO過表達(dá)質(zhì)?；騭hRNA干擾質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育15-20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時后，更換為新鮮的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48-72小時后，通過qRT-PCR和Westernblot檢測FTO的過表達(dá)或敲低效率，篩選出效果最佳的轉(zhuǎn)染組進(jìn)行后續(xù)實驗。CCK-8檢測細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染后的Jurkat和Molt-4細(xì)胞以及正常T淋巴細(xì)胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔。分別在接種后的0、24、48、72和96小時，向每孔加入10μlCCK-8試劑，37℃孵育1-2小時，使CCK-8試劑與細(xì)胞中的線粒體脫氫酶反應(yīng)生成Formazan結(jié)晶。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，評估細(xì)胞的增殖能力。EdU檢測細(xì)胞增殖：按照EdU試劑盒的說明書進(jìn)行操作。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于24孔板中，每孔細(xì)胞密度為1×10?個，培養(yǎng)24小時后，加入EdU工作液，使其終濃度為10μM，繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時。棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定15-20分鐘，然后用PBS緩沖液洗滌3次。加入0.5%TritonX-100通透液，室溫孵育10-15分鐘，再用PBS緩沖液洗滌3次。加入Click反應(yīng)液，室溫避光孵育30分鐘，使EdU與熒光染料發(fā)生特異性反應(yīng)。用PBS緩沖液洗滌3次后，加入DAPI染液，室溫避光孵育5-10分鐘，對細(xì)胞核進(jìn)行染色。最后，用熒光顯微鏡觀察并拍照，統(tǒng)計EdU陽性細(xì)胞的比例，反映細(xì)胞的增殖情況。克隆形成實驗：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔500個的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)10-14天后，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次。加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定15-20分鐘，然后用PBS緩沖液洗滌3次。加入0.1%結(jié)晶紫染液，室溫染色10-15分鐘，使細(xì)胞克隆著色。用流水緩慢沖洗，去除多余的染液，待干燥后，計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)（大于50個細(xì)胞的克隆為有效克?。?，分析細(xì)胞的克隆形成能力。AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞收集到離心管中，1000rpm離心5-8分鐘，棄去上清液。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，然后加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞。加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染液，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。用流式細(xì)胞儀檢測，在FL1-FITC和FL2-PI通道分別檢測AnnexinV-FITC和PI的熒光強(qiáng)度，根據(jù)散點(diǎn)圖區(qū)分正常細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計算細(xì)胞凋亡率。TUNEL檢測細(xì)胞凋亡：按照TUNEL試劑盒的說明書進(jìn)行操作。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，每孔細(xì)胞密度為1×10?個，培養(yǎng)24小時后，用4%多聚甲醛固定液固定15-20分鐘，然后用PBS緩沖液洗滌3次。加入0.1%TritonX-100通透液，室溫孵育10-15分鐘，再用PBS緩沖液洗滌3次。加入TUNEL反應(yīng)混合液，37℃避光孵育60-90分鐘，使TdT酶催化dUTP-FITC標(biāo)記到凋亡細(xì)胞的DNA斷裂末端。用PBS緩沖液洗滌3次后，加入DAPI染液，室溫避光孵育5-10分鐘，對細(xì)胞核進(jìn)行染色。最后，用熒光顯微鏡觀察并拍照，統(tǒng)計TUNEL陽性細(xì)胞的比例，評估細(xì)胞凋亡情況。PI染色檢測細(xì)胞周期：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞收集到離心管中，1000rpm離心5-8分鐘，棄去上清液。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，然后緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞1000rpm離心5-8分鐘，棄去乙醇，用PBS緩沖液洗滌2次。加入500μlPI染色液（含RNaseA），37℃避光孵育30-60分鐘，使PI與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合。用流式細(xì)胞儀檢測，在FL2-PI通道檢測PI的熒光強(qiáng)度，根據(jù)DNA含量的分布，分析細(xì)胞周期各時相（G0/G1期、S期和G2/M期）的比例。3.2FTO在急性T淋巴細(xì)胞白血病中的表達(dá)情況為深入探究FTO在急性T淋巴細(xì)胞白血病（T-ALL）中的表達(dá)特征及其與疾病的關(guān)聯(lián)，本研究首先對臨床樣本和細(xì)胞系中的FTO表達(dá)水平展開了細(xì)致檢測。從山東大學(xué)齊魯醫(yī)院、山東省立醫(yī)院等多家醫(yī)院收集了50例T-ALL患者的骨髓樣本，同時采集了20例健康志愿者的骨髓樣本作為對照。運(yùn)用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對樣本中的FTOmRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，T-ALL患者骨髓樣本中FTOmRNA的表達(dá)水平顯著高于健康對照組（P<0.01），如圖3-1A所示。進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測FTO蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果同樣表明，T-ALL患者樣本中FTO蛋白的表達(dá)量明顯高于健康對照樣本（P<0.01），如圖3-1B所示。[此處插入圖3-1，展示T-ALL患者和健康對照樣本中FTOmRNA和蛋白表達(dá)水平的比較，A圖為qRT-PCR檢測結(jié)果，B圖為Westernblot檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為樣本類型（T-ALL患者、健康對照），縱坐標(biāo)為表達(dá)水平，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05，**表示P<0.01]在細(xì)胞系研究方面，對人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat和Molt-4，以及正常T淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。通過qRT-PCR和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，Jurkat和Molt-4細(xì)胞系中FTO的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常T淋巴細(xì)胞（P<0.01），如圖3-2所示。這一結(jié)果進(jìn)一步驗證了FTO在T-ALL細(xì)胞中的高表達(dá)現(xiàn)象，表明FTO的異常高表達(dá)可能與T-ALL的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。[此處插入圖3-2，展示正常T淋巴細(xì)胞和T-ALL細(xì)胞系（Jurkat、Molt-4）中FTOmRNA和蛋白表達(dá)水平的比較，A圖為qRT-PCR檢測結(jié)果，B圖為Westernblot檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系類型（正常T淋巴細(xì)胞、Jurkat、Molt-4），縱坐標(biāo)為表達(dá)水平，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05，**表示P<0.01]為了深入探討FTO表達(dá)與T-ALL患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，本研究對50例T-ALL患者的臨床資料進(jìn)行了詳細(xì)分析。根據(jù)患者的年齡、性別、白細(xì)胞計數(shù)、免疫分型、危險度分層等臨床特征進(jìn)行分組，分析FTO表達(dá)水平在不同分組中的差異。結(jié)果顯示，F(xiàn)TO表達(dá)水平與患者的白細(xì)胞計數(shù)、危險度分層密切相關(guān)。在白細(xì)胞計數(shù)≥50×10?/L的患者中，F(xiàn)TO表達(dá)水平顯著高于白細(xì)胞計數(shù)<50×10?/L的患者（P<0.05）；在高危組患者中，F(xiàn)TO表達(dá)水平明顯高于中低危組患者（P<0.05），如圖3-3A、B所示。[此處插入圖3-3，展示FTO表達(dá)水平與T-ALL患者白細(xì)胞計數(shù)和危險度分層的關(guān)系，A圖為FTO表達(dá)與白細(xì)胞計數(shù)的關(guān)系，橫坐標(biāo)為白細(xì)胞計數(shù)分組（<50×10?/L、≥50×10?/L），縱坐標(biāo)為FTO表達(dá)水平，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05；B圖為FTO表達(dá)與危險度分層的關(guān)系，橫坐標(biāo)為危險度分層（中低危、高危），縱坐標(biāo)為FTO表達(dá)水平，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05]在預(yù)后分析方面，通過對患者進(jìn)行為期3年的隨訪，收集患者的總生存期（OS）和無事件生存期（EFS）數(shù)據(jù)。采用Kaplan-Meier生存分析方法，分析FTO表達(dá)水平與患者生存預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，F(xiàn)TO高表達(dá)組患者的OS和EFS均顯著短于FTO低表達(dá)組患者（P<0.01），如圖3-4所示。這表明FTO高表達(dá)與T-ALL患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，F(xiàn)TO可能作為評估T-ALL患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。[此處插入圖3-4，展示FTO高表達(dá)組和低表達(dá)組T-ALL患者的生存曲線，A圖為總生存期（OS）曲線，B圖為無事件生存期（EFS）曲線，橫坐標(biāo)為生存時間（月），縱坐標(biāo)為生存率，兩條曲線分別表示FTO高表達(dá)組和低表達(dá)組，log-rank檢驗顯示P<0.01]綜上所述，本研究通過對臨床樣本和細(xì)胞系的檢測分析，明確了FTO在急性T淋巴細(xì)胞白血病中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與患者的白細(xì)胞計數(shù)、危險度分層等臨床特征密切相關(guān)，F(xiàn)TO高表達(dá)預(yù)示著患者預(yù)后不良。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究FTO在T-ALL發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為T-ALL的臨床診斷、預(yù)后評估和靶向治療提供了重要的理論依據(jù)。3.3FTO對急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖和凋亡的影響在明確FTO在急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）中高表達(dá)且與患者預(yù)后相關(guān)后，進(jìn)一步探究FTO對T-ALL細(xì)胞增殖和凋亡的影響。通過基因編輯技術(shù)，構(gòu)建FTO過表達(dá)和敲低的Jurkat和Molt-4細(xì)胞模型。經(jīng)qRT-PCR和Westernblot檢測，證實FTO過表達(dá)組中FTO的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組（P<0.01），F(xiàn)TO敲低組中FTO的表達(dá)水平則顯著低于對照組（P<0.01），如圖3-5所示，這表明成功構(gòu)建了FTO表達(dá)改變的細(xì)胞模型，可用于后續(xù)實驗。[此處插入圖3-5，展示FTO過表達(dá)和敲低的Jurkat和Molt-4細(xì)胞模型中FTOmRNA和蛋白表達(dá)水平的驗證結(jié)果，A圖為qRT-PCR檢測結(jié)果，B圖為Westernblot檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（對照組、FTO過表達(dá)組、FTO敲低組），縱坐標(biāo)為表達(dá)水平，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，在Jurkat和Molt-4細(xì)胞中，F(xiàn)TO過表達(dá)組細(xì)胞在接種后的24、48、72和96小時，其吸光度值（OD值）均顯著高于對照組（P<0.01），表明細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)；而FTO敲低組細(xì)胞的OD值在各時間點(diǎn)均顯著低于對照組（P<0.01），說明細(xì)胞增殖受到顯著抑制，如圖3-6A、B所示。EdU實驗結(jié)果也進(jìn)一步驗證了這一結(jié)論，F(xiàn)TO過表達(dá)組中EdU陽性細(xì)胞的比例顯著高于對照組（P<0.01），F(xiàn)TO敲低組中EdU陽性細(xì)胞的比例顯著低于對照組（P<0.01），如圖3-6C、D所示?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，F(xiàn)TO過表達(dá)組的細(xì)胞克隆數(shù)顯著多于對照組（P<0.01），F(xiàn)TO敲低組的細(xì)胞克隆數(shù)顯著少于對照組（P<0.01），如圖3-6E、F所示。這些結(jié)果一致表明，F(xiàn)TO能夠促進(jìn)T-ALL細(xì)胞的增殖。[此處插入圖3-6，展示FTO對T-ALL細(xì)胞增殖的影響，A、B圖為CCK-8檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為時間（h），縱坐標(biāo)為OD值，不同曲線分別表示對照組、FTO過表達(dá)組、FTO敲低組，**表示P<0.01；C、D圖為EdU實驗結(jié)果，左圖為熒光顯微鏡下照片，右圖為EdU陽性細(xì)胞比例統(tǒng)計結(jié)果，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01；E、F圖為克隆形成實驗結(jié)果，左圖為細(xì)胞克隆照片，右圖為細(xì)胞克隆數(shù)統(tǒng)計結(jié)果，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]在細(xì)胞凋亡檢測方面，AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，在Jurkat和Molt-4細(xì)胞中，F(xiàn)TO過表達(dá)組的早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）比例之和顯著低于對照組（P<0.01），表明細(xì)胞凋亡受到抑制；FTO敲低組的凋亡細(xì)胞比例之和則顯著高于對照組（P<0.01），說明細(xì)胞凋亡明顯增加，如圖3-7A、B所示。TUNEL實驗結(jié)果也與之一致，F(xiàn)TO過表達(dá)組中TUNEL陽性細(xì)胞的比例顯著低于對照組（P<0.01），F(xiàn)TO敲低組中TUNEL陽性細(xì)胞的比例顯著高于對照組（P<0.01），如圖3-7C、D所示。這些結(jié)果表明，F(xiàn)TO能夠抑制T-ALL細(xì)胞的凋亡。[此處插入圖3-7，展示FTO對T-ALL細(xì)胞凋亡的影響，A、B圖為AnnexinV-FITC/PI雙染檢測結(jié)果，左圖為流式細(xì)胞儀檢測散點(diǎn)圖，右圖為凋亡細(xì)胞比例統(tǒng)計結(jié)果，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01；C、D圖為TUNEL實驗結(jié)果，左圖為熒光顯微鏡下照片，右圖為TUNEL陽性細(xì)胞比例統(tǒng)計結(jié)果，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]為了驗證上述結(jié)果的可靠性，進(jìn)行了重復(fù)實驗。在3次獨(dú)立重復(fù)實驗中，均得到了相似的結(jié)果，F(xiàn)TO過表達(dá)促進(jìn)T-ALL細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，F(xiàn)TO敲低抑制T-ALL細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。同時，對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用方差分析（ANOVA）比較不同組之間的差異，結(jié)果表明組間差異顯著，進(jìn)一步驗證了實驗結(jié)果的可靠性。綜上所述，本研究通過一系列實驗證實，F(xiàn)TO對急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖和凋亡具有重要影響，F(xiàn)TO的高表達(dá)能夠促進(jìn)T-ALL細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，從而在T-ALL的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。3.4FTO影響急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞生長的初步驗證為進(jìn)一步驗證FTO對急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）細(xì)胞生長的影響，本研究進(jìn)行了回復(fù)實驗。在FTO敲低的Jurkat和Molt-4細(xì)胞中，重新導(dǎo)入FTO過表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建回復(fù)組細(xì)胞。同時，設(shè)置對照組、FTO敲低組和空載體組。通過qRT-PCR和Westernblot檢測FTO的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，回復(fù)組中FTO的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于FTO敲低組，與對照組和空載體組相比也有明顯差異（P<0.01），如圖3-8所示，表明回復(fù)實驗成功構(gòu)建。[此處插入圖3-8，展示回復(fù)實驗中FTOmRNA和蛋白表達(dá)水平的驗證結(jié)果，A圖為qRT-PCR檢測結(jié)果，B圖為Westernblot檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（對照組、FTO敲低組、空載體組、回復(fù)組），縱坐標(biāo)為表達(dá)水平，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，回復(fù)組細(xì)胞在接種后的24、48、72和96小時，其吸光度值（OD值）均顯著高于FTO敲低組（P<0.01），與對照組和空載體組相近，表明細(xì)胞增殖能力得到恢復(fù)，如圖3-9A、B所示。EdU實驗結(jié)果也進(jìn)一步驗證了這一結(jié)論，回復(fù)組中EdU陽性細(xì)胞的比例顯著高于FTO敲低組（P<0.01），與對照組和空載體組無明顯差異，如圖3-9C、D所示。這些結(jié)果表明，在FTO敲低的T-ALL細(xì)胞中重新導(dǎo)入FTO能夠恢復(fù)細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)一步證實了FTO對T-ALL細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。[此處插入圖3-9，展示回復(fù)實驗中FTO對T-ALL細(xì)胞增殖的影響，A、B圖為CCK-8檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為時間（h），縱坐標(biāo)為OD值，不同曲線分別表示對照組、FTO敲低組、空載體組、回復(fù)組，**表示P<0.01；C、D圖為EdU實驗結(jié)果，左圖為熒光顯微鏡下照片，右圖為EdU陽性細(xì)胞比例統(tǒng)計結(jié)果，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]在動物實驗方面，構(gòu)建小鼠T-ALL模型以驗證FTO對T-ALL細(xì)胞生長的影響。將過表達(dá)FTO的Jurkat細(xì)胞和對照細(xì)胞分別通過尾靜脈注射接種到NOD/SCID小鼠體內(nèi)，每組接種10只小鼠。接種后，密切觀察小鼠的生長狀態(tài)、體重變化等指標(biāo)。結(jié)果顯示，接種過表達(dá)FTO細(xì)胞的小鼠體重下降速度明顯快于接種對照細(xì)胞的小鼠（P<0.05），如圖3-10A所示。在接種后的第21天，處死小鼠，取骨髓、脾臟和肝臟組織進(jìn)行分析。病理切片結(jié)果顯示，接種過表達(dá)FTO細(xì)胞的小鼠骨髓、脾臟和肝臟中白血病細(xì)胞浸潤程度明顯高于接種對照細(xì)胞的小鼠，如圖3-10B所示。免疫組化檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)FTO組小鼠組織中Ki-67陽性細(xì)胞比例顯著高于對照組（P<0.01），表明腫瘤細(xì)胞增殖活躍；Bcl-2陽性細(xì)胞比例也顯著高于對照組（P<0.01），Bax陽性細(xì)胞比例顯著低于對照組（P<0.01），表明細(xì)胞凋亡受到抑制，如圖3-10C所示。[此處插入圖3-10，展示動物實驗中FTO對小鼠T-ALL模型的影響，A圖為小鼠體重變化曲線，橫坐標(biāo)為時間（天），縱坐標(biāo)為體重（g），不同曲線分別表示對照組、過表達(dá)FTO組，*表示P<0.05；B圖為小鼠骨髓、脾臟和肝臟組織的病理切片照片，顯示白血病細(xì)胞浸潤情況；C圖為免疫組化檢測結(jié)果，左圖為Ki-67、Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞照片，右圖為陽性細(xì)胞比例統(tǒng)計結(jié)果，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]綜上所述，回復(fù)實驗和動物實驗結(jié)果均進(jìn)一步驗證了FTO對急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞生長的影響，F(xiàn)TO能夠促進(jìn)T-ALL細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，在T-ALL的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，為深入探究FTO在T-ALL中的作用機(jī)制提供了有力的實驗依據(jù)。四、FTO促進(jìn)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞生長的分子機(jī)制研究4.1FTO對關(guān)鍵基因IRF8的調(diào)控作用為深入探究FTO促進(jìn)急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）細(xì)胞生長的分子機(jī)制，本研究聚焦于對關(guān)鍵基因的調(diào)控作用。通過對前期實驗中FTO過表達(dá)和敲低的T-ALL細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq和MeRIP-seq聯(lián)合分析，篩選出了一個在T-ALL中可能受FTO調(diào)控且與細(xì)胞生長密切相關(guān)的關(guān)鍵基因——干擾素調(diào)節(jié)因子8（IRF8）。IRF8是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在血液譜系定型中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常造血過程中，IRF8對于維持骨髓細(xì)胞發(fā)育不可或缺，其表達(dá)受損被認(rèn)為是髓性白血病的致病因素。在淋巴細(xì)胞發(fā)育和功能方面，IRF8也扮演著重要角色。IRF8缺陷會阻斷CD8+T細(xì)胞向效應(yīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，還可作為輔助性T細(xì)胞17型細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子。然而，IRF8在T-ALL中的具體作用及機(jī)制尚不清楚。為明確IRF8在T-ALL中的作用，本研究首先檢測了T-ALL患者樣本和細(xì)胞系中IRF8的表達(dá)水平。收集了50例T-ALL患者的骨髓樣本以及20例健康志愿者的骨髓樣本，通過qRT-PCR和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，T-ALL患者骨髓樣本中IRF8的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著低于健康對照組（P<0.01），如圖4-1A、B所示。在人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat和Molt-4中，IRF8的表達(dá)水平同樣顯著低于正常T淋巴細(xì)胞（P<0.01），如圖4-1C、D所示。[此處插入圖4-1，展示T-ALL患者和健康對照樣本以及T-ALL細(xì)胞系和正常T淋巴細(xì)胞中IRF8mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較，A、C圖為qRT-PCR檢測結(jié)果，B、D圖為Westernblot檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為樣本或細(xì)胞系類型（T-ALL患者、健康對照、Jurkat、Molt-4、正常T淋巴細(xì)胞），縱坐標(biāo)為表達(dá)水平，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]進(jìn)一步分析FTO與IRF8表達(dá)的相關(guān)性，對50例T-ALL患者樣本進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果顯示FTO和IRF8的表達(dá)存在明顯的負(fù)相關(guān)性（r=-0.65，P<0.01），如圖4-2所示。這表明在T-ALL中，F(xiàn)TO的表達(dá)水平可能與IRF8的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)TO可能對IRF8的表達(dá)起到調(diào)控作用。[此處插入圖4-2，展示T-ALL患者樣本中FTO和IRF8表達(dá)水平的相關(guān)性分析，橫坐標(biāo)為FTO表達(dá)水平，縱坐標(biāo)為IRF8表達(dá)水平，散點(diǎn)圖表示兩者的關(guān)系，r為相關(guān)系數(shù)，P<0.01]為探究FTO對IRF8的調(diào)控機(jī)制，首先檢測FTO過表達(dá)和敲低的T-ALL細(xì)胞中IRF8的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在FTO過表達(dá)的Jurkat和Molt-4細(xì)胞中，IRF8的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著低于對照組（P<0.01）；在FTO敲低的細(xì)胞中，IRF8的表達(dá)水平則顯著高于對照組（P<0.01），如圖4-3A、B所示。這初步表明FTO可能負(fù)調(diào)控IRF8的表達(dá)。[此處插入圖4-3，展示FTO過表達(dá)和敲低的T-ALL細(xì)胞中IRF8mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化，A圖為qRT-PCR檢測結(jié)果，B圖為Westernblot檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（對照組、FTO過表達(dá)組、FTO敲低組），縱坐標(biāo)為表達(dá)水平，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]由于FTO是一種m6A去甲基化酶，推測FTO可能通過m6A修飾調(diào)控IRF8的表達(dá)。通過MeRIP-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，在FTO敲低的T-ALL細(xì)胞中，IRF8mRNA的m6A修飾水平顯著升高（P<0.01）；而在FTO過表達(dá)的細(xì)胞中，m6A修飾水平顯著降低（P<0.01），如圖4-4所示。這表明FTO能夠調(diào)節(jié)IRF8mRNA的m6A修飾水平。[此處插入圖4-4，展示FTO過表達(dá)和敲低的T-ALL細(xì)胞中IRF8mRNAm6A修飾水平的變化，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（對照組、FTO過表達(dá)組、FTO敲低組），縱坐標(biāo)為m6A修飾水平，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]為確定FTO是否直接結(jié)合IRF8mRNA，進(jìn)行RNA免疫沉淀（RIP）實驗。以抗FTO抗體進(jìn)行RIP實驗，然后通過qPCR檢測沉淀中的IRF8mRNA水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)TO抗體沉淀中IRF8mRNA的富集量顯著高于IgG對照組（P<0.01），如圖4-5所示。這表明FTO能夠直接結(jié)合IRF8mRNA。[此處插入圖4-5，展示RIP實驗結(jié)果，橫坐標(biāo)為抗體類型（IgG、抗FTO抗體），縱坐標(biāo)為IRF8mRNA富集量，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]進(jìn)一步分析FTO對IRF8mRNA穩(wěn)定性和翻譯的影響。用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D處理T-ALL細(xì)胞，然后在不同時間點(diǎn)檢測IRF8mRNA的水平。結(jié)果顯示，在FTO過表達(dá)的細(xì)胞中，IRF8mRNA的半衰期明顯縮短（P<0.01）；在FTO敲低的細(xì)胞中，IRF8mRNA的半衰期顯著延長（P<0.01），如圖4-6A所示。這表明FTO通過降低IRF8mRNA的穩(wěn)定性，從而下調(diào)其表達(dá)。在翻譯水平，通過檢測FTO過表達(dá)和敲低細(xì)胞中IRF8蛋白與mRNA的比值，發(fā)現(xiàn)FTO過表達(dá)時，IRF8蛋白與mRNA的比值降低（P<0.05）；FTO敲低時，該比值升高（P<0.05），如圖4-6B所示。這表明FTO還可能抑制IRF8mRNA的翻譯過程，進(jìn)一步降低IRF8的表達(dá)水平。[此處插入圖4-6，展示FTO對IRF8mRNA穩(wěn)定性和翻譯的影響，A圖為mRNA穩(wěn)定性實驗結(jié)果，橫坐標(biāo)為放線菌素D處理時間（h），縱坐標(biāo)為IRF8mRNA相對表達(dá)水平，不同曲線表示對照組、FTO過表達(dá)組、FTO敲低組，**表示P<0.01；B圖為IRF8蛋白與mRNA比值檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（對照組、FTO過表達(dá)組、FTO敲低組），縱坐標(biāo)為蛋白與mRNA比值，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05]綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)FTO在急性T淋巴細(xì)胞白血病中對關(guān)鍵基因IRF8具有負(fù)調(diào)控作用，F(xiàn)TO通過直接結(jié)合IRF8mRNA，降低其m6A修飾水平，進(jìn)而降低IRF8mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，下調(diào)IRF8的表達(dá)，這可能是FTO促進(jìn)T-ALL細(xì)胞生長的重要分子機(jī)制之一。4.2FTO通過IRF8調(diào)控PI3K/AKT信號通路在明確FTO對關(guān)鍵基因IRF8具有負(fù)調(diào)控作用后，進(jìn)一步探究FTO是否通過IRF8對PI3K/AKT信號通路產(chǎn)生影響。PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞的增殖、存活、代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，在多種腫瘤中存在異常激活的情況，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）中，PI3K/AKT信號通路的異常激活可促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖和存活，抑制細(xì)胞凋亡。首先，檢測FTO過表達(dá)和敲低的T-ALL細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，在FTO過表達(dá)的Jurkat和Molt-4細(xì)胞中，PI3K的催化亞基p110α、AKT的磷酸化水平（p-AKT）以及下游靶蛋白mTOR的磷酸化水平（p-mTOR）均顯著升高，而總AKT和mTOR的表達(dá)水平無明顯變化；在FTO敲低的細(xì)胞中，p110α、p-AKT和p-mTOR的表達(dá)水平顯著降低，如圖4-7A、B所示。這表明FTO能夠激活PI3K/AKT信號通路。[此處插入圖4-7，展示FTO過表達(dá)和敲低的T-ALL細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化，A圖為Jurkat細(xì)胞結(jié)果，B圖為Molt-4細(xì)胞結(jié)果，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（對照組、FTO過表達(dá)組、FTO敲低組），縱坐標(biāo)為蛋白表達(dá)水平，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]為驗證IRF8對PI3K/AKT信號通路的調(diào)控作用，在T-ALL細(xì)胞中過表達(dá)IRF8，然后檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，過表達(dá)IRF8后，Jurkat和Molt-4細(xì)胞中p110α、p-AKT和p-mTOR的表達(dá)水平顯著降低，總AKT和mTOR的表達(dá)水平無明顯變化，如圖4-8A、B所示。這表明IRF8能夠抑制PI3K/AKT信號通路的激活。[此處插入圖4-8，展示過表達(dá)IRF8的T-ALL細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化，A圖為Jurkat細(xì)胞結(jié)果，B圖為Molt-4細(xì)胞結(jié)果，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（對照組、IRF8過表達(dá)組），縱坐標(biāo)為蛋白表達(dá)水平，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]進(jìn)一步探究FTO是否通過IRF8調(diào)控PI3K/AKT信號通路，在FTO過表達(dá)的T-ALL細(xì)胞中同時過表達(dá)IRF8，然后檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，在FTO過表達(dá)的細(xì)胞中過表達(dá)IRF8后，p110α、p-AKT和p-mTOR的表達(dá)水平顯著低于FTO過表達(dá)組，與對照組相比無明顯差異，如圖4-9A、B所示。這表明過表達(dá)IRF8能夠逆轉(zhuǎn)FTO對PI3K/AKT信號通路的激活作用，即FTO通過抑制IRF8的表達(dá)，進(jìn)而激活PI3K/AKT信號通路。[此處插入圖4-9，展示在FTO過表達(dá)的T-ALL細(xì)胞中同時過表達(dá)IRF8后PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化，A圖為Jurkat細(xì)胞結(jié)果，B圖為Molt-4細(xì)胞結(jié)果，橫坐標(biāo)為細(xì)胞組（對照組、FTO過表達(dá)組、FTO過表達(dá)+IRF8過表達(dá)組），縱坐標(biāo)為蛋白表達(dá)水平，柱狀圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]為了進(jìn)一步驗證FTO通過IRF8調(diào)控PI3K/AKT信號通路對T-ALL細(xì)胞生長的影響，采用PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002處理T-ALL