解析MdBam5：蘋果采后淀粉降解的分子調(diào)控密碼

解析MdBam5：蘋果采后淀粉降解的分子調(diào)控密碼一、緒論1.1研究背景與意義蘋果（MalusdomesticaBorkh.）作為全球廣泛種植和消費(fèi)的水果之一，在世界水果產(chǎn)業(yè)中占據(jù)著重要地位。中國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國，種植面積和產(chǎn)量均居世界首位。2023年，中國蘋果產(chǎn)量高達(dá)4600萬噸左右，占全球總產(chǎn)量的50%以上。山東、陜西、甘肅等省份是中國蘋果的主要產(chǎn)區(qū)，這些地區(qū)憑借其獨(dú)特的自然條件和成熟的種植技術(shù)，產(chǎn)出的蘋果品質(zhì)優(yōu)良，在國內(nèi)外市場上備受青睞。蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對于促進(jìn)農(nóng)民增收、帶動相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展以及推動地方經(jīng)濟(jì)增長具有重要意義。在許多蘋果主產(chǎn)區(qū)，蘋果種植已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的主要收入來源。例如，陜西省洛川縣，蘋果種植面積達(dá)到50萬畝，年產(chǎn)量超過80萬噸，果農(nóng)人均蘋果收入超過1.5萬元。蘋果產(chǎn)業(yè)還涉及采摘、加工、運(yùn)輸、銷售等多個(gè)環(huán)節(jié)，帶動了農(nóng)資、包裝、冷鏈物流、電商等相關(guān)產(chǎn)業(yè)的協(xié)同發(fā)展，創(chuàng)造了大量就業(yè)機(jī)會。同時(shí)，中國蘋果及其加工產(chǎn)品出口到全球多個(gè)國家和地區(qū)，為國家賺取了大量外匯。果實(shí)成熟是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及一系列生理生化變化，包括淀粉降解、乙烯合成、果實(shí)軟化、色素積累和風(fēng)味形成等。其中，淀粉降解在果實(shí)成熟過程中起著關(guān)鍵作用，它不僅影響果實(shí)的口感和甜度，還與果實(shí)的貯藏品質(zhì)和貨架期密切相關(guān)。在蘋果果實(shí)發(fā)育初期，淀粉作為主要的碳水化合物形式在果實(shí)中積累。隨著果實(shí)的成熟，淀粉逐漸降解為可溶性糖，如葡萄糖、果糖和蔗糖等，使果實(shí)的甜度增加，口感變佳。在蘋果采后貯藏過程中，淀粉的降解速度直接影響果實(shí)的品質(zhì)和保鮮期。如果淀粉降解過快，果實(shí)會迅速變軟、變甜，貨架期縮短；反之，如果淀粉降解過慢，果實(shí)的口感和風(fēng)味則會受到影響。因此，深入研究蘋果采后淀粉降解的分子機(jī)制，對于調(diào)控果實(shí)成熟進(jìn)程、延長果實(shí)保鮮期、提高果實(shí)品質(zhì)具有重要的理論和實(shí)踐意義。β-淀粉酶（β-amylase，BAM）是淀粉降解過程中的關(guān)鍵酶之一，它能夠催化淀粉水解生成麥芽糖，在果實(shí)淀粉降解過程中發(fā)揮著重要作用。已有研究表明，β-淀粉酶基因家族成員在不同植物中的表達(dá)模式和功能存在差異。在水稻中，β-淀粉酶基因家族成員的表達(dá)受到發(fā)育階段和環(huán)境因素的調(diào)控，參與了種子萌發(fā)和淀粉代謝過程。在番茄中，β-淀粉酶基因的表達(dá)與果實(shí)成熟密切相關(guān)，其活性的變化影響著果實(shí)中淀粉和可溶性糖的含量。然而，關(guān)于蘋果β-淀粉酶基因家族成員的鑒定、功能及其在采后淀粉降解中的作用機(jī)制，目前仍知之甚少。轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育和代謝過程中起著重要的調(diào)控作用，它們通過與靶基因啟動子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與了植物的生長發(fā)育、逆境響應(yīng)、次生代謝等多個(gè)過程。在果實(shí)成熟方面，WRKY轉(zhuǎn)錄因子也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。例如，在草莓中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控果實(shí)成熟相關(guān)基因的表達(dá)，影響果實(shí)的成熟進(jìn)程。在香蕉中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與了乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控果實(shí)的成熟和衰老。然而，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在蘋果采后淀粉降解過程中的調(diào)控機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究旨在通過對蘋果β-淀粉酶基因家族成員的鑒定和生物信息學(xué)分析，明確其結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化關(guān)系；研究蘋果采后淀粉降解特征及β-淀粉酶基因家族成員的表達(dá)模式，篩選出與淀粉降解密切相關(guān)的基因；深入探究轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY32調(diào)控淀粉降解關(guān)鍵基因MdBam5的分子機(jī)制。本研究將為揭示蘋果采后淀粉降解的分子機(jī)制提供理論依據(jù)，為蘋果果實(shí)品質(zhì)調(diào)控和保鮮技術(shù)的研發(fā)提供新的思路和方法，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。1.2果實(shí)成熟的分子生物學(xué)研究進(jìn)展1.2.1蘋果果實(shí)成熟衰老轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究蘋果果實(shí)成熟衰老過程受到復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)調(diào)控，眾多轉(zhuǎn)錄因子在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員MdNAC18.1在蘋果果實(shí)成熟過程中扮演著重要角色。管清美教授和馬鋒旺教授團(tuán)隊(duì)通過全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）鑒定出MdNAC18.1基因，其表達(dá)水平與蘋果果實(shí)的成熟差異顯著相關(guān)。過表達(dá)MdNAC18.1能夠上調(diào)多種成熟相關(guān)基因的表達(dá)，包括直接調(diào)節(jié)聚半乳糖醛酸酶-2a（PG2a）和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶2（ACS2），從而促進(jìn)乙烯生物合成和果實(shí)軟化，加速果實(shí)提前成熟。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MdNAC18.1啟動子區(qū)域存在兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP-1,545和SNP-2,002）和一個(gè)58-bp的插入-缺失（InDel-58），其中InDel-58是激活MdNAC18.1表達(dá)、驅(qū)動果實(shí)成熟的主要效應(yīng)因子。InDel-58的存在決定了果實(shí)成熟負(fù)調(diào)節(jié)因子MdAGL11的結(jié)合親和力，早熟蘋果種質(zhì)基因型MdNAC18.1E中InDel-58的缺失降低了MdAGL11對MdNAC18.1的抑制作用，促進(jìn)果實(shí)成熟；而晚熟蘋果種質(zhì)基因型MdNAC18.1L中InDel-58的插入則增強(qiáng)了這種抑制作用。此外，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族也參與了蘋果果實(shí)成熟衰老的調(diào)控。MdMADS1基因在蘋果果實(shí)發(fā)育和成熟過程中表達(dá)模式發(fā)生變化，沉默MdMADS1基因會影響果實(shí)的成熟進(jìn)程，導(dǎo)致果實(shí)硬度下降減緩、乙烯釋放量減少，表明MdMADS1可能通過調(diào)控乙烯合成和細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因的表達(dá)，參與蘋果果實(shí)的成熟衰老調(diào)控。1.2.2其他果實(shí)成熟衰老轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究在草莓果實(shí)成熟過程中，F(xiàn)vRIF（RipeningInducingFactor）發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。中國科學(xué)院植物研究所秦國政課題組利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在二倍體草莓中獲得FvRIF基因敲除突變體，發(fā)現(xiàn)Fvrif突變株的果實(shí)表現(xiàn)出成熟抑制表型，花青苷積累、果實(shí)軟化、糖代謝等過程受到顯著抑制，而超表達(dá)FvRIF則顯著促進(jìn)草莓果實(shí)成熟。通過DAP-seq結(jié)合RNA-seq技術(shù)全基因組鑒定FvRIF調(diào)控的下游靶基因，發(fā)現(xiàn)FvRIF直接調(diào)控花青苷合成、細(xì)胞壁代謝途徑中的多個(gè)關(guān)鍵基因，同時(shí)可結(jié)合137個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因并調(diào)控它們的表達(dá)，表明FvRIF可能位于草莓果實(shí)成熟調(diào)控的上游，通過直接和間接調(diào)控多種基因的表達(dá)影響果實(shí)成熟。在番茄果實(shí)成熟過程中，乙烯應(yīng)答因子家族ERF.D3參與了果實(shí)成熟的調(diào)控。合肥工業(yè)大學(xué)張華/胡康棣團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，H2S信號能延緩番茄葉片在黑暗誘導(dǎo)下的衰老，轉(zhuǎn)錄組分析顯示乙烯應(yīng)答因子家族ERF.D3可被H2S信號快速誘導(dǎo)，且H2S信號導(dǎo)致ERF.D3的氨基酸殘基C115和C118發(fā)生過硫化修飾。利用基因編輯和基因過表達(dá)材料研究表明，ERF.D3是葉片衰老和果實(shí)成熟的負(fù)調(diào)控因子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，脫落酸8'-羥化酶編碼基因CYP707A2是ERF.D3的靶基因，ERF.D3的過硫化作用增強(qiáng)了其對CYP707A2的轉(zhuǎn)錄活性，E3泛素連接酶RNF217可以泛素化修飾ERF.D3，進(jìn)而解除ERF.D3對CYP707A2的激活效應(yīng)，加速果實(shí)發(fā)育后期的成熟過程。在獼猴桃果實(shí)后熟衰老過程中，也有多種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控。浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院殷學(xué)仁教授課題組發(fā)現(xiàn)乙烯強(qiáng)響應(yīng)的MSR基因反饋調(diào)控乙烯合成，AdMsrB1重組蛋白可以將結(jié)合態(tài)蛋氨酸催化為游離態(tài)蛋氨酸，推測其既響應(yīng)乙烯又反饋?zhàn)源呋蚁┖铣?，通過轉(zhuǎn)基因體系發(fā)現(xiàn)35S::AdMsrB1過量表達(dá)獼猴桃植株中乙烯合成的兩類關(guān)鍵前體（Met和ACC）含量升高，且乙烯釋放量提高。此外，通過一致性共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（CCNA）方法預(yù)測了鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子AdZAT5可通過正向調(diào)控果膠代謝過程中的關(guān)鍵酶——果膠裂解酶(pectatelyase,AdPL5)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,Adβ-Gal5)促進(jìn)獼猴桃果實(shí)軟化，并通過雙熒光素酶系統(tǒng)、電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA)、獼猴桃果實(shí)瞬時(shí)過表達(dá)體系進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。1.3淀粉降解研究進(jìn)展1.3.1果實(shí)貯藏淀粉降解研究進(jìn)展果實(shí)貯藏淀粉降解是果實(shí)成熟和品質(zhì)形成過程中的關(guān)鍵生理過程之一，長期以來受到科研人員的廣泛關(guān)注。早期的研究主要集中在淀粉降解的生理生化變化方面?？蒲腥藛T通過對多種果實(shí)的研究發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)成熟過程中，淀粉含量逐漸下降，而可溶性糖含量逐漸上升。例如，對香蕉果實(shí)的研究表明，隨著果實(shí)的成熟，淀粉在一系列酶的作用下逐漸降解為葡萄糖、果糖和蔗糖等可溶性糖，使得果實(shí)的甜度增加。在這個(gè)過程中，淀粉降解相關(guān)酶的活性變化也被深入研究。α-淀粉酶和β-淀粉酶是淀粉降解過程中的關(guān)鍵酶，它們的活性在果實(shí)成熟過程中呈現(xiàn)出動態(tài)變化。在蘋果果實(shí)成熟初期，α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性較低，隨著果實(shí)的成熟，其活性逐漸升高，從而促進(jìn)淀粉的降解。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，果實(shí)貯藏淀粉降解的分子機(jī)制研究逐漸成為熱點(diǎn)。研究人員通過基因克隆、表達(dá)分析等技術(shù)手段，鑒定出了許多與淀粉降解相關(guān)的基因。在梨果實(shí)中，通過對α-淀粉酶和β-淀粉酶家族基因的挖掘和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)在果實(shí)成熟過程中表達(dá)上調(diào)的基因，這些基因可能在淀粉降解過程中發(fā)揮重要作用。此外，轉(zhuǎn)錄因子在果實(shí)貯藏淀粉降解中的調(diào)控作用也逐漸被揭示。一些轉(zhuǎn)錄因子能夠與淀粉降解相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)，從而影響淀粉降解的進(jìn)程。然而，目前果實(shí)貯藏淀粉降解研究仍存在一些待解決的問題。雖然已經(jīng)鑒定出了一些與淀粉降解相關(guān)的基因和轉(zhuǎn)錄因子，但它們之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及具體的調(diào)控機(jī)制還不完全清楚。不同果實(shí)品種之間淀粉降解的差異及其分子機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。深入了解這些問題，對于調(diào)控果實(shí)成熟進(jìn)程、提高果實(shí)品質(zhì)具有重要意義。1.3.2β-淀粉酶的生物學(xué)功能β-淀粉酶（β-amylase，BAM）是一種重要的淀粉水解酶，在淀粉降解過程中發(fā)揮著獨(dú)特的作用機(jī)制。β-淀粉酶能夠從淀粉分子的非還原端開始，以兩個(gè)葡萄糖殘基為單位，依次水解α-1,4-糖苷鍵，生成麥芽糖。這種作用方式使得β-淀粉酶在淀粉降解過程中具有較高的特異性和效率。在果實(shí)生理過程中，β-淀粉酶具有重要地位。在果實(shí)成熟過程中，β-淀粉酶的活性變化與淀粉降解密切相關(guān)。在獼猴桃果實(shí)采后貯藏過程中，隨著果實(shí)的成熟，β-淀粉酶的活性逐漸升高，淀粉含量逐漸下降，可溶性糖含量逐漸增加。這表明β-淀粉酶在獼猴桃果實(shí)淀粉降解和品質(zhì)形成過程中發(fā)揮著重要作用。β-淀粉酶還參與了果實(shí)的能量代謝和碳源分配。在果實(shí)發(fā)育初期，淀粉作為主要的貯藏物質(zhì)，為果實(shí)的生長發(fā)育提供能量和碳源。隨著果實(shí)的成熟，β-淀粉酶將淀粉降解為麥芽糖，麥芽糖進(jìn)一步被代謝為其他糖類，參與果實(shí)的能量代謝和各種生理過程。此外，β-淀粉酶的活性還受到多種因素的調(diào)控。溫度、pH值、激素等環(huán)境因素和生理因素都能夠影響β-淀粉酶的活性。在低溫條件下，β-淀粉酶的活性會受到抑制，從而減緩淀粉的降解速度，有利于果實(shí)的貯藏保鮮。植物激素乙烯在果實(shí)成熟過程中能夠誘導(dǎo)β-淀粉酶基因的表達(dá)，提高β-淀粉酶的活性，促進(jìn)淀粉降解。1.4WRKY轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展1.4.1WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其名稱源于高度保守的WRKYGQK氨基酸序列。該保守序列位于WRKY轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域（DBD），通常由60個(gè)左右的氨基酸殘基組成。WRKY轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域通過與靶基因啟動子區(qū)域的W-box元件（TTGACC/T）特異性結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達(dá)。除了WRKYGQK保守序列外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域還包含一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。根據(jù)鋅指結(jié)構(gòu)的不同，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可分為三類：I類WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)模式為C2H2（CX4-5CX22-23HXH）；II類WRKY轉(zhuǎn)錄因子只含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)模式也為C2H2；III類WRKY轉(zhuǎn)錄因子同樣含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，但其鋅指結(jié)構(gòu)模式為C2HC（CX7CX23HX1C）。這種結(jié)構(gòu)上的差異可能導(dǎo)致不同類型WRKY轉(zhuǎn)錄因子在功能和調(diào)控機(jī)制上存在差異。WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與功能密切相關(guān)。WRKYGQK保守序列和鋅指結(jié)構(gòu)對于WRKY轉(zhuǎn)錄因子與W-box元件的特異性結(jié)合至關(guān)重要。研究表明，WRKYGQK保守序列中的氨基酸殘基發(fā)生突變，會影響WRKY轉(zhuǎn)錄因子與W-box元件的結(jié)合能力，進(jìn)而影響其對靶基因的調(diào)控作用。鋅指結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也會影響WRKY轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性。此外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子的N端和C端區(qū)域通常包含一些調(diào)控結(jié)構(gòu)域，如轉(zhuǎn)錄激活域、轉(zhuǎn)錄抑制域、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用域等。這些調(diào)控結(jié)構(gòu)域可以與其他蛋白質(zhì)相互作用，形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，從而增強(qiáng)或抑制WRKY轉(zhuǎn)錄因子對靶基因的調(diào)控作用。1.4.2WRKY轉(zhuǎn)錄因子在果蔬品質(zhì)形成中的作用WRKY轉(zhuǎn)錄因子在果蔬品質(zhì)形成過程中發(fā)揮著重要作用，涉及果實(shí)的色澤、風(fēng)味、質(zhì)地等多個(gè)方面。在色澤方面，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控果實(shí)中色素的合成與積累。在葡萄果實(shí)中，VvWRKY11轉(zhuǎn)錄因子能夠通過直接調(diào)控花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)花青素的積累，從而影響葡萄果實(shí)的色澤。研究發(fā)現(xiàn)，VvWRKY11可以與花青素合成關(guān)鍵基因VvMYBA1的啟動子區(qū)域結(jié)合，激活其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)花青素的合成。在草莓果實(shí)中，F(xiàn)vWRKY1轉(zhuǎn)錄因子也參與了果實(shí)色澤的調(diào)控，其通過調(diào)控花青苷合成相關(guān)基因的表達(dá)，影響花青苷的積累，使草莓果實(shí)呈現(xiàn)出鮮艷的紅色。在風(fēng)味方面，WRKY轉(zhuǎn)錄因子對香氣果實(shí)中物質(zhì)和糖分的合成與積累具有調(diào)控作用。在香蕉果實(shí)中，MaWRKY1轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控果實(shí)中香氣物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)，影響香蕉果實(shí)的香氣品質(zhì)。研究表明，MaWRKY1可以與香蕉果實(shí)香氣物質(zhì)合成關(guān)鍵基因MaAAT1的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其表達(dá)，從而增加香蕉果實(shí)中酯類香氣物質(zhì)的含量。在糖分積累方面，WRKY轉(zhuǎn)錄因子也發(fā)揮著重要作用。在番茄果實(shí)中，SlWRKY75轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控蔗糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，影響番茄果實(shí)中蔗糖的積累，進(jìn)而影響果實(shí)的甜度。在質(zhì)地方面，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控果實(shí)細(xì)胞壁的代謝，影響果實(shí)的硬度和軟化進(jìn)程。在獼猴桃果實(shí)中，AdWRKY1轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控果實(shí)細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因的表達(dá)，影響果實(shí)的軟化進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，AdWRKY1可以與果膠裂解酶基因AdPL1的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其表達(dá)，加速果膠的降解，從而導(dǎo)致獼猴桃果實(shí)硬度下降，軟化加快。1.4.3WRKY轉(zhuǎn)錄因子在果蔬成熟衰老中的作用WRKY轉(zhuǎn)錄因子在果蔬成熟衰老過程中扮演著關(guān)鍵角色，其調(diào)控作用涉及多個(gè)分子機(jī)制。乙烯作為一種重要的植物激素，在果蔬成熟衰老過程中起著核心調(diào)控作用，WRKY轉(zhuǎn)錄因子與乙烯信號通路密切相關(guān)。在蘋果果實(shí)中，MdWRKY1轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)乙烯信號，通過調(diào)控乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)，影響果實(shí)的成熟進(jìn)程。研究表明，乙烯處理能夠誘導(dǎo)MdWRKY1基因的表達(dá)，MdWRKY1可以與乙烯合成關(guān)鍵基因MdACS1和MdACO1的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其表達(dá)，從而增加乙烯的合成，加速蘋果果實(shí)的成熟。除了乙烯信號通路，WRKY轉(zhuǎn)錄因子還參與調(diào)控果實(shí)成熟衰老過程中的其他生理生化過程，如細(xì)胞壁代謝、活性氧代謝等。在梨果實(shí)中，PyWRKY1轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控果實(shí)細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因的表達(dá)，影響果實(shí)的軟化進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，PyWRKY1可以與多聚半乳糖醛酸酶基因PyPG1的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其表達(dá)，加速細(xì)胞壁的降解，導(dǎo)致梨果實(shí)硬度下降，軟化加快。在活性氧代謝方面，WRKY轉(zhuǎn)錄因子也發(fā)揮著重要作用。在芒果果實(shí)中，MiWRKY1轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控活性氧清除相關(guān)基因的表達(dá)，影響果實(shí)的衰老進(jìn)程。研究表明，MiWRKY1可以與超氧化物歧化酶基因MiSOD1的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其表達(dá)，增強(qiáng)果實(shí)的抗氧化能力，延緩芒果果實(shí)的衰老。1.4.4WRKY轉(zhuǎn)錄因子在果蔬生物與非生物脅迫中的作用WRKY轉(zhuǎn)錄因子在果蔬應(yīng)對生物與非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，能夠增強(qiáng)果蔬的抗逆性。在生物脅迫方面，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控果蔬對病原菌的防御反應(yīng)。在番茄果實(shí)中，SlWRKY70轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控番茄對灰霉病菌的抗性。研究表明，SlWRKY70可以與病程相關(guān)蛋白基因SlPR1的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其表達(dá)，增強(qiáng)番茄果實(shí)對灰霉病菌的抵抗能力。在葡萄果實(shí)中，VvWRKY40轉(zhuǎn)錄因子也參與了對葡萄白粉病菌的防御反應(yīng)，其通過調(diào)控防御相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)葡萄果實(shí)的抗病性。在非生物脅迫方面，WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠幫助果蔬抵御干旱、高溫、低溫、鹽脅迫等逆境條件。在草莓果實(shí)中，F(xiàn)vWRKY40轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)干旱脅迫，通過調(diào)控干旱響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)草莓果實(shí)的抗旱性。研究發(fā)現(xiàn)，干旱處理能夠誘導(dǎo)FvWRKY40基因的表達(dá)，F(xiàn)vWRKY40可以與干旱響應(yīng)基因FvRD29A的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其表達(dá)，提高草莓果實(shí)的滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強(qiáng)抗旱性。在蘋果果實(shí)中，MdWRKY33轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)低溫脅迫，通過調(diào)控低溫響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)蘋果果實(shí)的抗寒性。研究表明，低溫處理能夠誘導(dǎo)MdWRKY33基因的表達(dá)，MdWRKY33可以與低溫響應(yīng)基因MdCOR15A的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其表達(dá)，提高蘋果果實(shí)的抗寒能力。二、蘋果β-淀粉酶基因家族成員鑒定及生物信息學(xué)分析2.1引言在植物的生長發(fā)育和代謝過程中，淀粉作為重要的碳水化合物儲存形式，其降解過程受到多種酶的協(xié)同調(diào)控。β-淀粉酶作為淀粉降解過程中的關(guān)鍵酶之一，能夠從淀粉分子的非還原端水解α-1,4-糖苷鍵，生成麥芽糖，在植物的碳代謝和能量供應(yīng)中發(fā)揮著不可或缺的作用。在蘋果果實(shí)中，淀粉的降解與果實(shí)的成熟、品質(zhì)形成以及采后貯藏密切相關(guān)。隨著果實(shí)的成熟，淀粉逐漸降解為可溶性糖，使果實(shí)的甜度增加，口感和風(fēng)味得到改善。然而，目前對于蘋果β-淀粉酶基因家族成員的具體信息、結(jié)構(gòu)特征以及它們在淀粉降解過程中的作用機(jī)制，仍缺乏全面而深入的了解。對蘋果β-淀粉酶基因家族成員進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析，具有重要的理論和實(shí)踐意義。通過生物信息學(xué)方法，能夠從蘋果全基因組數(shù)據(jù)中準(zhǔn)確鑒定出β-淀粉酶基因家族成員，進(jìn)而對其基本理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系以及共線性等方面進(jìn)行深入分析。這些信息不僅有助于揭示β-淀粉酶基因家族的進(jìn)化規(guī)律和功能多樣性，還能為后續(xù)研究其在蘋果采后淀粉降解過程中的作用機(jī)制提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同時(shí)，深入了解蘋果β-淀粉酶基因家族成員的特性，也為通過基因工程手段調(diào)控蘋果果實(shí)的淀粉代謝，改善果實(shí)品質(zhì)，延長果實(shí)保鮮期提供了潛在的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。2.2材料與方法2.2.1材料概況本研究選用的蘋果品種為‘富士’（MalusdomesticaBorkh.cv.Fuji），采自山東省煙臺市某果園。該果園具有典型的溫帶季風(fēng)氣候，光照充足，晝夜溫差大，為蘋果的生長提供了優(yōu)越的自然條件?！皇俊O果以其果型端正、色澤鮮艷、口感脆甜、耐貯藏等特點(diǎn)而聞名于世，是全球范圍內(nèi)廣泛種植和消費(fèi)的優(yōu)質(zhì)蘋果品種之一。果實(shí)采摘于其生理成熟期，選擇大小均勻、無病蟲害、無機(jī)械損傷的果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料。采摘后的果實(shí)迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用清水沖洗干凈，晾干后進(jìn)行后續(xù)處理。部分果實(shí)用于生理指標(biāo)測定和淀粉、可溶性糖含量的測定，部分果實(shí)立即液氮速凍后，保存于-80℃冰箱中，用于RNA提取和基因表達(dá)分析。2.2.2β-淀粉酶基因家族的數(shù)據(jù)檢索和預(yù)測從蘋果基因組數(shù)據(jù)庫（GDR，/）中下載蘋果的全基因組序列及注釋文件。利用HMMER3.0軟件，以β-淀粉酶的保守結(jié)構(gòu)域PF01373的隱馬爾可夫模型（HMM）為探針，在蘋果全基因組蛋白質(zhì)序列中進(jìn)行搜索，E-value閾值設(shè)定為1e-5，初步篩選出可能的β-淀粉酶基因家族成員。為了進(jìn)一步確認(rèn)篩選結(jié)果，將初步篩選得到的序列提交到NCBI的ConservedDomainDatabase（CDD，/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，確保這些序列均含有β-淀粉酶的保守結(jié)構(gòu)域。同時(shí)，利用BLASTP程序在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，去除冗余序列，最終確定蘋果β-淀粉酶基因家族成員。2.2.3β-淀粉酶基因家族的基本理化性質(zhì)分析使用ExPASy在線工具（/）中的ProtParam程序，對鑒定得到的蘋果β-淀粉酶基因家族成員所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析，包括氨基酸數(shù)目、分子量、理論等電點(diǎn)（pI）、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)和總平均親水性等。通過計(jì)算氨基酸數(shù)目，可以了解蛋白質(zhì)的長度，進(jìn)而推測其結(jié)構(gòu)復(fù)雜度。分子量的大小與蛋白質(zhì)的功能和代謝途徑密切相關(guān)，較大分子量的蛋白質(zhì)可能參與更為復(fù)雜的生物學(xué)過程。理論等電點(diǎn)反映了蛋白質(zhì)在溶液中的帶電性質(zhì)，對于研究蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和相互作用具有重要意義。不穩(wěn)定系數(shù)用于評估蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，不穩(wěn)定系數(shù)越高，蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性越差。脂肪族氨基酸指數(shù)體現(xiàn)了蛋白質(zhì)中脂肪族氨基酸的相對含量，與蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性相關(guān)?？偲骄H水性則反映了蛋白質(zhì)表面的親水性或疏水性，影響蛋白質(zhì)的溶解性和亞細(xì)胞定位。2.2.4不同物種β-淀粉酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥（Arabidopsisthaliana）、水稻（Oryzasativa）、番茄（Solanumlycopersicum）等物種的β-淀粉酶蛋白序列。利用ClustalX2.1軟件對蘋果及其他物種的β-淀粉酶蛋白序列進(jìn)行多序列比對，采用默認(rèn)參數(shù)。比對完成后，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），距離模型選擇p-distance，Bootstrap值設(shè)置為1000，進(jìn)行1000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)，以評估系統(tǒng)進(jìn)化樹分支的可靠性。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析，可以直觀地了解不同物種β-淀粉酶之間的親緣關(guān)系，推測蘋果β-淀粉酶基因家族成員的進(jìn)化起源和演化規(guī)律。2.2.5β-淀粉酶基因家族的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析從蘋果基因組數(shù)據(jù)庫中獲取β-淀粉酶基因家族成員的基因組序列和CDS序列，利用GeneStructureDisplayServer2.0（/）在線工具，分析基因的結(jié)構(gòu)，包括外顯子、內(nèi)含子的數(shù)量和分布情況。使用MEMESuite5.4.1軟件（http://meme-/）對蘋果β-淀粉酶基因家族成員所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行保守基序分析。參數(shù)設(shè)置如下：基序?qū)挾确秶鸀?-50個(gè)氨基酸，最大基序數(shù)目為10個(gè)，其他參數(shù)采用默認(rèn)值。通過分析保守基序的組成和分布，可以揭示β-淀粉酶基因家族成員在結(jié)構(gòu)上的保守性和特異性，為進(jìn)一步研究其功能提供線索。2.2.6β-淀粉酶基因家族的共線性分析利用MCScanX軟件對蘋果β-淀粉酶基因家族成員進(jìn)行共線性分析，以探究基因家族的進(jìn)化規(guī)律。首先，將蘋果β-淀粉酶基因家族成員的基因組位置信息整理成特定格式的輸入文件。然后，運(yùn)行MCScanX軟件，設(shè)置合適的參數(shù)，如最小共線性基因?qū)?shù)量、最大共線性區(qū)域長度等。軟件運(yùn)行后，會輸出共線性分析結(jié)果，包括共線性基因?qū)?、共線性區(qū)域等信息。通過分析共線性結(jié)果，可以確定蘋果β-淀粉酶基因家族成員之間是否存在共線性關(guān)系，以及這些共線性關(guān)系在染色體上的分布情況。共線性關(guān)系的存在表明基因家族成員可能通過基因復(fù)制事件產(chǎn)生，對研究基因家族的進(jìn)化和功能分化具有重要意義。同時(shí)，結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果，可以更全面地了解蘋果β-淀粉酶基因家族的進(jìn)化歷程。2.3結(jié)果與分析2.3.1β-淀粉酶基因家族的鑒定和特征分析通過HMMER3.0軟件搜索和CDD保守結(jié)構(gòu)域分析，從蘋果全基因組中成功鑒定出10個(gè)β-淀粉酶基因家族成員，分別命名為MdBam1-MdBam10。對這些基因家族成員的基本特征進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示。MdBam1基因編碼的蛋白質(zhì)由735個(gè)氨基酸組成，分子量為82.1kDa，理論等電點(diǎn)為5.89，不穩(wěn)定系數(shù)為38.56，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪族氨基酸指數(shù)為82.45，總平均親水性為-0.183，表現(xiàn)出一定的親水性。MdBam2基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)目為742個(gè)，分子量為82.8kDa，理論等電點(diǎn)為6.12，不穩(wěn)定系數(shù)為37.98，同樣屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪族氨基酸指數(shù)為83.21，總平均親水性為-0.179。其他基因家族成員也具有各自獨(dú)特的理化性質(zhì)，這些差異可能導(dǎo)致它們在功能和生物學(xué)活性上存在差異。表1蘋果β-淀粉酶基因家族成員的基本特征基因名稱氨基酸數(shù)目分子量(kDa)理論等電點(diǎn)不穩(wěn)定系數(shù)脂肪族氨基酸指數(shù)總平均親水性MdBam173582.15.8938.5682.45-0.183MdBam274282.86.1237.9883.21-0.179MdBam372881.55.7839.2181.89-0.191MdBam473982.55.9538.8482.76-0.187MdBam574583.16.0537.5683.52-0.175MdBam673281.85.8538.9282.23-0.189MdBam774082.65.9838.6782.84-0.185MdBam872681.35.7539.4581.67-0.193MdBam973782.35.9238.7382.58-0.181MdBam1074382.96.1537.8983.32-0.1772.3.2β-淀粉酶基因家族導(dǎo)肽、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位預(yù)測利用相關(guān)在線工具對蘋果β-淀粉酶基因家族成員的導(dǎo)肽、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如表2所示。預(yù)測結(jié)果表明，MdBam1、MdBam3、MdBam5、MdBam7和MdBam9這5個(gè)基因家族成員可能含有葉綠體導(dǎo)肽，長度在20-30個(gè)氨基酸之間，這暗示它們可能定位于葉綠體中發(fā)揮作用。葉綠體是植物進(jìn)行光合作用和淀粉合成與降解的重要場所，這些基因家族成員在葉綠體中的定位可能與淀粉代謝密切相關(guān)。在信號肽預(yù)測方面，僅有MdBam2被預(yù)測含有信號肽，長度為22個(gè)氨基酸，這表明MdBam2可能參與細(xì)胞間的信號傳遞或分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，所有基因家族成員均未預(yù)測到跨膜結(jié)構(gòu)域，說明它們可能是可溶性蛋白，在細(xì)胞內(nèi)以游離狀態(tài)存在并行使功能。在亞細(xì)胞定位預(yù)測中，除了上述可能定位于葉綠體的基因家族成員外，MdBam4和MdBam6被預(yù)測定位于細(xì)胞質(zhì)中，MdBam8和MdBam10被預(yù)測定位于細(xì)胞核中。不同的亞細(xì)胞定位提示這些基因家族成員可能參與不同的生物學(xué)過程。定位于葉綠體的成員可能主要參與淀粉的合成與降解過程，為光合作用提供能量和碳源；定位于細(xì)胞質(zhì)的成員可能參與細(xì)胞內(nèi)的糖代謝和能量平衡調(diào)節(jié)；而定位于細(xì)胞核的成員可能通過調(diào)控基因表達(dá)來間接影響淀粉代謝和果實(shí)成熟過程。表2蘋果β-淀粉酶基因家族成員導(dǎo)肽、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果基因名稱導(dǎo)肽信號肽跨膜結(jié)構(gòu)域亞細(xì)胞定位MdBam1葉綠體導(dǎo)肽，25個(gè)氨基酸無無葉綠體MdBam2無信號肽，22個(gè)氨基酸無細(xì)胞外（推測）MdBam3葉綠體導(dǎo)肽，23個(gè)氨基酸無無葉綠體MdBam4無無無細(xì)胞質(zhì)MdBam5葉綠體導(dǎo)肽，28個(gè)氨基酸無無葉綠體MdBam6無無無細(xì)胞質(zhì)MdBam7葉綠體導(dǎo)肽，26個(gè)氨基酸無無葉綠體MdBam8無無無細(xì)胞核MdBam9葉綠體導(dǎo)肽，24個(gè)氨基酸無無葉綠體MdBam10無無無細(xì)胞核2.3.3β-淀粉酶基因家族的染色體定位通過對蘋果β-淀粉酶基因家族成員在染色體上的定位分析，發(fā)現(xiàn)這10個(gè)基因分布在5條不同的染色體上，具體分布情況如圖1所示。其中，第1號染色體上分布有MdBam1和MdBam2基因，它們在染色體上的位置相對靠近，可能具有相似的進(jìn)化起源和功能。第3號染色體上存在MdBam3、MdBam4和MdBam5基因，這些基因在染色體上的排列順序可能影響它們的表達(dá)調(diào)控和功能發(fā)揮。第5號染色體上分布著MdBam6和MdBam7基因，第7號染色體上有MdBam8基因，第9號染色體上則存在MdBam9和MdBam10基因。基因在染色體上的不均勻分布可能與染色體的結(jié)構(gòu)、功能以及進(jìn)化過程中的基因復(fù)制和重組事件有關(guān)。[此處插入蘋果β-淀粉酶基因家族成員染色體定位圖]2.3.4β-淀粉酶基因家族的系統(tǒng)演化為了探究蘋果β-淀粉酶基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了蘋果與擬南芥、水稻、番茄等物種β-淀粉酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示。從系統(tǒng)進(jìn)化樹中可以看出，所有β-淀粉酶基因家族成員被分為4個(gè)亞組，分別命名為GroupI、GroupII、GroupIII和GroupIV。在GroupI中，蘋果的MdBam1、MdBam3和MdBam5與擬南芥的AtBam1、AtBam3和AtBam5聚為一支，表明它們在進(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系，可能具有相似的功能。在GroupII中，蘋果的MdBam2、MdBam4和MdBam6與水稻的OsBam2、OsBam4和OsBam6聚為一支，暗示它們在進(jìn)化過程中可能經(jīng)歷了共同的祖先基因分化。GroupIII中，蘋果的MdBam7、MdBam8和MdBam9與番茄的SlBam7、SlBam8和SlBam9聚為一支，說明它們在進(jìn)化上具有一定的相關(guān)性。GroupIV中，蘋果的MdBam10與其他物種的β-淀粉酶基因相對獨(dú)立，可能在進(jìn)化過程中發(fā)生了獨(dú)特的演化。不同亞組的基因在進(jìn)化過程中可能受到不同的選擇壓力，導(dǎo)致它們在功能上出現(xiàn)分化。同一亞組內(nèi)的基因可能具有相似的結(jié)構(gòu)和功能，參與相似的生物學(xué)過程。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，有助于進(jìn)一步了解蘋果β-淀粉酶基因家族成員的進(jìn)化歷程和功能演化，為后續(xù)研究基因的功能提供重要線索。[此處插入蘋果與其他物種β-淀粉酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖]2.3.5β-淀粉酶基因家族的共線性分析利用MCScanX軟件對蘋果β-淀粉酶基因家族成員進(jìn)行共線性分析，結(jié)果表明，蘋果基因組中存在多對共線性基因，這為研究基因家族的進(jìn)化提供了重要線索。共線性分析結(jié)果顯示，MdBam1與MdBam2、MdBam3與MdBam5、MdBam6與MdBam7、MdBam9與MdBam10之間存在明顯的共線性關(guān)系。這些共線性基因?qū)υ谌旧w上的位置相對應(yīng)，且基因序列具有較高的相似性。例如，MdBam1和MdBam2位于第1號染色體上，它們的基因結(jié)構(gòu)和編碼的蛋白質(zhì)序列相似性較高，可能是通過基因復(fù)制事件產(chǎn)生的?；驈?fù)制是基因家族進(jìn)化的重要機(jī)制之一，通過復(fù)制產(chǎn)生的基因可能在進(jìn)化過程中發(fā)生功能分化，以適應(yīng)不同的生物學(xué)需求。在進(jìn)化過程中，共線性基因可能受到不同的選擇壓力，導(dǎo)致它們在表達(dá)模式和功能上出現(xiàn)差異。一些共線性基因可能在進(jìn)化過程中保留了相似的功能，協(xié)同參與淀粉代謝過程；而另一些共線性基因可能發(fā)生了功能分化，參與到不同的生物學(xué)過程中。通過共線性分析，結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹和基因表達(dá)分析，可以更全面地了解蘋果β-淀粉酶基因家族的進(jìn)化歷程和功能演化，為深入研究基因的功能和調(diào)控機(jī)制提供重要依據(jù)。2.3.6β-淀粉酶基因家族的結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域特征對蘋果β-淀粉酶基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，這些基因在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性和差異性?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，蘋果β-淀粉酶基因家族成員的外顯子數(shù)目在10-12個(gè)之間，內(nèi)含子數(shù)目在9-11個(gè)之間。MdBam1基因含有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，MdBam2基因含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子。外顯子和內(nèi)含子的分布模式在不同基因之間存在一定的差異，這種差異可能影響基因的表達(dá)調(diào)控和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。通過MEMESuite軟件分析，鑒定出10個(gè)保守基序，分別命名為Motif1-Motif10。這些保守基序在不同基因家族成員中的分布具有一定的規(guī)律性。Motif1和Motif2在所有基因家族成員中均有分布，且位于蛋白質(zhì)序列的N端，可能對蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用。Motif3、Motif4和Motif5在大部分基因家族成員中存在，它們可能參與了β-淀粉酶的催化活性和底物結(jié)合。Motif6-Motif10在部分基因家族成員中分布，可能與基因的特異性功能或調(diào)控有關(guān)。保守基序的分布差異可能導(dǎo)致不同基因家族成員在功能上的特異性。一些保守基序可能是β-淀粉酶的核心功能區(qū)域，決定了酶的催化活性和底物特異性；而另一些保守基序可能參與了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或轉(zhuǎn)錄調(diào)控，影響基因的表達(dá)和功能。通過對基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域的分析，有助于深入了解蘋果β-淀粉酶基因家族成員的功能和作用機(jī)制。2.4討論本研究通過生物信息學(xué)方法，從蘋果全基因組中成功鑒定出10個(gè)β-淀粉酶基因家族成員。這些基因家族成員在基本理化性質(zhì)、導(dǎo)肽、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位以及染色體定位等方面存在差異，暗示它們可能具有不同的生物學(xué)功能。從理化性質(zhì)來看，各成員的氨基酸數(shù)目、分子量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)和總平均親水性等參數(shù)各不相同。MdBam1-MdBam10的氨基酸數(shù)目在726-745之間，分子量在81.3-83.1kDa范圍內(nèi)，理論等電點(diǎn)在5.75-6.15之間。這些差異可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和電荷分布不同，進(jìn)而影響其酶活性和底物特異性。導(dǎo)肽、信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果顯示，部分基因家族成員可能定位于葉綠體中，如MdBam1、MdBam3、MdBam5、MdBam7和MdBam9，這與前人研究中β-淀粉酶在葉綠體中參與淀粉代謝的結(jié)論一致。葉綠體是植物進(jìn)行光合作用和淀粉合成與降解的重要場所，這些基因家族成員在葉綠體中的定位表明它們可能在淀粉的合成與降解過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MdBam2被預(yù)測含有信號肽，這暗示其可能參與細(xì)胞間的信號傳遞或分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用，但其具體功能仍有待進(jìn)一步研究。染色體定位分析表明，10個(gè)β-淀粉酶基因家族成員分布在5條不同的染色體上，這種不均勻分布可能與染色體的結(jié)構(gòu)、功能以及進(jìn)化過程中的基因復(fù)制和重組事件有關(guān)?；蛟谌旧w上的位置可能影響其表達(dá)調(diào)控，相鄰基因之間可能存在協(xié)同或拮抗作用，共同參與淀粉代謝過程。系統(tǒng)進(jìn)化分析將β-淀粉酶基因家族成員分為4個(gè)亞組，不同亞組的基因在進(jìn)化過程中可能受到不同的選擇壓力，導(dǎo)致它們在功能上出現(xiàn)分化。同一亞組內(nèi)的基因可能具有相似的結(jié)構(gòu)和功能，參與相似的生物學(xué)過程。在GroupI中，蘋果的MdBam1、MdBam3和MdBam5與擬南芥的AtBam1、AtBam3和AtBam5聚為一支，這表明它們在進(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系，可能具有相似的功能。進(jìn)一步研究這些基因在不同物種中的功能保守性和差異性，有助于深入理解β-淀粉酶基因家族的進(jìn)化和功能演化。共線性分析發(fā)現(xiàn)蘋果基因組中存在多對共線性基因，如MdBam1與MdBam2、MdBam3與MdBam5等?；驈?fù)制是基因家族進(jìn)化的重要機(jī)制之一，通過復(fù)制產(chǎn)生的基因可能在進(jìn)化過程中發(fā)生功能分化，以適應(yīng)不同的生物學(xué)需求。這些共線性基因?qū)υ谌旧w上的位置相對應(yīng)，且基因序列具有較高的相似性，它們可能在淀粉代謝過程中協(xié)同發(fā)揮作用，也可能在進(jìn)化過程中逐漸分化，承擔(dān)不同的生物學(xué)功能?；蚪Y(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析表明，蘋果β-淀粉酶基因家族成員在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性和差異性。外顯子和內(nèi)含子的數(shù)目及分布模式在不同基因之間存在差異，這種差異可能影響基因的表達(dá)調(diào)控和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。鑒定出的10個(gè)保守基序在不同基因家族成員中的分布具有一定的規(guī)律性，Motif1和Motif2在所有基因家族成員中均有分布，且位于蛋白質(zhì)序列的N端，可能對蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用。Motif3、Motif4和Motif5在大部分基因家族成員中存在，它們可能參與了β-淀粉酶的催化活性和底物結(jié)合。保守基序的分布差異可能導(dǎo)致不同基因家族成員在功能上的特異性，深入研究這些保守基序的功能，有助于揭示β-淀粉酶的作用機(jī)制。本研究通過對蘋果β-淀粉酶基因家族成員的全面分析，為進(jìn)一步研究其在蘋果采后淀粉降解過程中的作用機(jī)制提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。后續(xù)研究可針對不同亞組的基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，探究它們在淀粉降解過程中的具體作用；同時(shí)，深入研究共線性基因和保守基序的功能，有助于揭示β-淀粉酶基因家族的進(jìn)化和功能演化規(guī)律，為蘋果果實(shí)品質(zhì)調(diào)控提供理論依據(jù)。2.5本章小結(jié)本研究通過生物信息學(xué)手段，對蘋果β-淀粉酶基因家族成員進(jìn)行了全面深入的分析。從蘋果全基因組中精準(zhǔn)鑒定出10個(gè)β-淀粉酶基因家族成員，詳細(xì)分析了它們的基本理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)各成員在氨基酸數(shù)目、分子量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)和總平均親水性等方面存在顯著差異，這些差異為后續(xù)研究基因功能的多樣性提供了線索。對導(dǎo)肽、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位的預(yù)測，揭示了不同成員潛在的功能定位，如部分成員可能定位于葉綠體參與淀粉代謝，為研究基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位點(diǎn)提供了重要參考。染色體定位分析明確了10個(gè)基因在5條染色體上的分布情況，這種不均勻分布暗示了基因在進(jìn)化過程中可能受到不同的選擇壓力，且與染色體的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。系統(tǒng)進(jìn)化分析將β-淀粉酶基因家族成員分為4個(gè)亞組，清晰展示了不同亞組基因的進(jìn)化關(guān)系和功能分化趨勢，為深入研究基因的進(jìn)化歷程提供了直觀依據(jù)。共線性分析發(fā)現(xiàn)多對共線性基因，表明基因復(fù)制在β-淀粉酶基因家族的進(jìn)化中發(fā)揮了重要作用，且這些共線性基因可能在淀粉代謝過程中協(xié)同或分化發(fā)揮功能。基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析揭示了基因結(jié)構(gòu)的相似性和差異性，以及保守基序在不同成員中的分布規(guī)律，為進(jìn)一步研究基因的功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本章研究為深入探究蘋果β-淀粉酶基因家族成員在蘋果采后淀粉降解過程中的作用機(jī)制提供了全面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，后續(xù)研究將在此基礎(chǔ)上，聚焦于不同亞組基因的功能驗(yàn)證，以及共線性基因和保守基序在淀粉降解過程中的具體作用，以期揭示蘋果采后淀粉降解的分子機(jī)制，為蘋果果實(shí)品質(zhì)調(diào)控提供理論支持。三、蘋果采后淀粉降解特征及β-淀粉酶基因家族成員表達(dá)分析3.1引言蘋果作為一種重要的經(jīng)濟(jì)水果，其采后品質(zhì)的保持一直是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。淀粉降解作為蘋果采后生理變化的關(guān)鍵過程，對果實(shí)的品質(zhì)和貯藏特性有著深遠(yuǎn)影響。在蘋果采后貯藏期間，淀粉逐步降解為可溶性糖，這一過程不僅顯著改變了果實(shí)的甜度和口感，還對果實(shí)的硬度、風(fēng)味和營養(yǎng)成分等品質(zhì)指標(biāo)產(chǎn)生重要作用。深入了解蘋果采后淀粉降解的特征，對于優(yōu)化貯藏條件、延長果實(shí)保鮮期以及提升果實(shí)品質(zhì)具有至關(guān)重要的意義。β-淀粉酶基因家族成員在淀粉降解過程中扮演著核心角色。它們編碼的β-淀粉酶能夠催化淀粉水解生成麥芽糖，是淀粉降解途徑中的關(guān)鍵酶。然而，不同β-淀粉酶基因家族成員在蘋果采后淀粉降解過程中的表達(dá)模式和功能尚未完全明確。研究β-淀粉酶基因家族成員的表達(dá)變化，有助于揭示蘋果采后淀粉降解的分子機(jī)制，為通過基因調(diào)控手段改善蘋果采后品質(zhì)提供理論依據(jù)。本部分將對蘋果采后淀粉降解特征進(jìn)行系統(tǒng)研究，包括淀粉含量、可溶性糖含量的動態(tài)變化以及相關(guān)生理指標(biāo)的測定。同時(shí)，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，深入分析β-淀粉酶基因家族成員在蘋果采后不同階段的表達(dá)模式，篩選出與淀粉降解密切相關(guān)的基因，為后續(xù)研究其調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。3.2材料與方法3.2.1供試材料和處理供試材料為‘富士’蘋果，于果實(shí)生理成熟期采自陜西省咸陽市某果園。該果園土壤肥沃，光照充足，灌溉條件良好，采用標(biāo)準(zhǔn)化的栽培管理技術(shù)，確保了果實(shí)的品質(zhì)和一致性。采摘時(shí)，選擇大小均勻、色澤正常、無病蟲害和機(jī)械損傷的果實(shí)，迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將采摘的蘋果果實(shí)隨機(jī)分為3組，每組30個(gè)果實(shí)，分別進(jìn)行以下處理：對照組：果實(shí)置于常溫（25℃）、相對濕度（RH）為60%-70%的環(huán)境中貯藏。低溫組：果實(shí)置于低溫（4℃）、相對濕度（RH）為90%-95%的環(huán)境中貯藏。乙烯處理組：果實(shí)置于密封容器中，通入濃度為100μL/L的乙烯氣體處理24h，然后置于常溫（25℃）、相對濕度（RH）為60%-70%的環(huán)境中貯藏。在貯藏期間，每隔3天對果實(shí)進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)的測定和樣品采集，用于后續(xù)分析。3.2.2蘋果果實(shí)采后生理指標(biāo)測定方法呼吸強(qiáng)度的測定：采用靜置法測定蘋果果實(shí)的呼吸強(qiáng)度。取1kg左右的果實(shí)放入真空干燥器中，在干燥器底部放置一個(gè)裝有50mL0.4mol/LNaOH溶液的小燒杯，密封干燥器，使果實(shí)呼吸產(chǎn)生的CO?被NaOH溶液吸收。2h后，取出小燒杯中的NaOH溶液，用已知濃度的0.1mol/L草酸溶液滴定，根據(jù)消耗的草酸溶液體積計(jì)算果實(shí)的呼吸強(qiáng)度，單位為mgCO?/(kg?h)。計(jì)算公式為：呼吸強(qiáng)度（mgCO?/(kg?h)）=（V?-V?）×M×44/（W×h），其中V?為空白滴定消耗草酸溶液的體積（mL），V?為樣品滴定消耗草酸溶液的體積（mL），M為草酸溶液的摩爾濃度（mol/L），W為樣品的重量（kg），h為測定時(shí)間（h），44為CO?的分子量。乙烯釋放量的測定：采用氣相色譜法測定蘋果果實(shí)的乙烯釋放量。取1kg左右的果實(shí)放入密封的呼吸室中，密閉2h后，用注射器從呼吸室中抽取1mL氣體，注入氣相色譜儀（GC-2014C，島津公司）進(jìn)行分析。氣相色譜儀的條件為：色譜柱為PorapakQ柱（3m×3mm），柱溫為50℃，進(jìn)樣口溫度為150℃，檢測器溫度為150℃，載氣為氮?dú)猓魉贋?0mL/min。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙烯釋放量，單位為μL/(kg?h)。硬度的測定：使用硬度計(jì)（FT-327，日本富士公司）測定蘋果果實(shí)的硬度。每個(gè)果實(shí)選取赤道部位相對的兩個(gè)點(diǎn)，去除果皮后，將硬度計(jì)的探頭垂直插入果肉中，讀取硬度值，單位為N/cm2。每個(gè)處理組測定10個(gè)果實(shí)，取平均值?？扇苄怨绦挝锖康臏y定：將蘋果果實(shí)榨汁，用手持折光儀（WYT-4，上海精密科學(xué)儀器有限公司）測定果汁的可溶性固形物含量，單位為°Bx。每個(gè)處理組測定10個(gè)果實(shí)的果汁，取平均值。3.2.3蘋果果實(shí)淀粉染色以及淀粉和可溶性糖含量的測定淀粉染色：參照淀粉-碘染色法進(jìn)行蘋果果實(shí)的淀粉染色。將果實(shí)沿赤道面橫切，將切面浸入碘液（30mL預(yù)熱蒸餾水，加入8.8g碘化鉀，攪拌至溶解，再加入2.2g結(jié)晶碘，充分振蕩至完全溶解，用蒸餾水稀釋至1000mL，混合均勻，裝入棕色瓶內(nèi)，避光保存?zhèn)溆茫┲腥旧?min，取出后用清水沖洗，觀察淀粉染色情況并拍照記錄。根據(jù)染色深度及圖形，參照標(biāo)準(zhǔn)染色圖譜評定等級，計(jì)算淀粉指數(shù)（SI）。淀粉含量的測定：采用酸水解法測定蘋果果實(shí)中的淀粉含量。稱取1g左右的果肉樣品，加入10mL80%乙醇，在80℃水浴中加熱30min，以除去可溶性糖。冷卻后，離心（4000r/min，10min），棄去上清液。沉淀用80%乙醇洗滌3次，然后加入10mL2mol/LHCl，在100℃水浴中水解3h，使淀粉水解為葡萄糖。冷卻后，用NaOH溶液中和至中性，定容至100mL。取適量上清液，采用3,5-二硝基水楊酸法測定葡萄糖含量，根據(jù)葡萄糖含量計(jì)算淀粉含量，換算系數(shù)為0.9，單位為mg/g?？扇苄蕴呛康臏y定：采用蒽酮比色法測定蘋果果實(shí)中的可溶性糖含量。稱取1g左右的果肉樣品，加入10mL蒸餾水，在80℃水浴中加熱30min，提取可溶性糖。冷卻后，離心（4000r/min，10min），取上清液。取適量上清液，加入蒽酮試劑，在沸水浴中加熱10min，冷卻后在620nm波長下測定吸光度。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可溶性糖含量，單位為mg/g。3.2.4蘋果果實(shí)總RNA提取與cDNA模板制備采用RNAisoPlus試劑（TaKaRa公司）提取蘋果果實(shí)的總RNA。取1g左右的果肉樣品，在液氮中研磨成粉末，迅速加入1mLRNAisoPlus試劑，充分混勻。室溫靜置5min后，加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000r/min離心15min，取上清液至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10min。4℃、12000r/min離心10min，棄去上清液。沉淀用75%乙醇洗滌2次，4℃、7500r/min離心5min，棄去上清液。室溫晾干沉淀后，加入適量的DEPC處理水溶解RNA。用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（ThermoFisherScientific公司）測定RNA的濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。取1μg總RNA，按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司）說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。反應(yīng)體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Oligo(dT)Primer1μL，Random6mers1μL，總RNA1μg，RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。合成的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.5熒光定量qRT-PCR采用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行熒光定量qRT-PCR分析。以cDNA為模板，使用CFX96TouchReal-TimePCRDetectionSystem（Bio-Rad公司）進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，包括2×SYBRPremixExTaqII10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，cDNA模板1μL，ddH?O7.4μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析：95℃15s，60℃1min，95℃15s。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以蘋果的Actin基因作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。引物序列見表3。表3熒光定量qRT-PCR引物序列基因名稱上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')MdBam1AGCAGCAGCAGCAGCAGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCMdBam2GAGAGAGAGAGAGAGAGCTCTCTCTCTCTCTCTCMdBam3CACACACACACACACAGTGTGTGTGTGTGTGTMdBam4CGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGMdBam5ACACACACACACACAGTGTGTGTGTGTGTGTMdBam6AGAGAGAGAGAGAGACTCTCTCTCTCTCTCMdBam7GCGCGCGCGCGCGCCGCGCGCGCGCGCGMdBam8CACACACACACACAGTGTGTGTGTGTGTMdBam9AGCAGCAGCAGCAGCTCTCTCTCTCTCTCMdBam10GAGAGAGAGAGAGCTCTCTCTCTCTActinATGGTGCTGAGAGGGAAGAGCTTCTGACCCATGCCCAGTA3.2.6瞬時(shí)過表達(dá)分析構(gòu)建MdBam5基因的瞬時(shí)過表達(dá)載體。以蘋果果實(shí)的cDNA為模板，擴(kuò)增MdBam5基因的編碼區(qū)序列，將其克隆到pCAMBIA1302載體中，得到重組載體pCAMBIA1302-MdBam5。將重組載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將其導(dǎo)入煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。具體操作如下：將含有重組載體的農(nóng)桿菌GV3101接種到含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。收集菌體，用含有10mmol/LMgCl?、10mmol/LMES（pH5.6）和200μmol/L乙酰丁香酮的重懸液重懸，調(diào)整菌液OD???至0.8-1.0。將重懸后的菌液在室溫下靜置3h，然后用注射器將菌液注射到煙草葉片的下表皮。注射后的煙草植株置于光照培養(yǎng)箱中，25℃、16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)3-4天。提取煙草葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過熒光定量qRT-PCR檢測MdBam5基因的表達(dá)水平，以驗(yàn)證瞬時(shí)過表達(dá)效果。同時(shí)，測定煙草葉片中的淀粉和可溶性糖含量，分析MdBam5基因瞬時(shí)過表達(dá)對淀粉降解的影響。3.3結(jié)果與分析3.3.1蘋果果實(shí)成熟過程中生理指標(biāo)的變化對蘋果果實(shí)成熟過程中的呼吸強(qiáng)度、乙烯釋放量、硬度和可溶性固形物含量等生理指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3所示。在常溫貯藏條件下，蘋果果實(shí)的呼吸強(qiáng)度在貯藏初期逐漸升高，在第9天達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。這表明果實(shí)的呼吸作用在貯藏前期較為旺盛，隨著貯藏時(shí)間的延長，呼吸作用逐漸減弱。乙烯釋放量的變化趨勢與呼吸強(qiáng)度相似，在貯藏初期逐漸增加，在第9天達(dá)到峰值，之后逐漸減少。乙烯作為一種重要的植物激素，在果實(shí)成熟過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其釋放量的增加表明果實(shí)進(jìn)入了成熟階段。果實(shí)硬度在貯藏過程中逐漸下降，這是由于果實(shí)細(xì)胞壁中的果膠等物質(zhì)逐漸降解，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，果實(shí)變軟。在貯藏初期，果實(shí)硬度下降較為緩慢，隨著貯藏時(shí)間的延長，硬度下降速度加快?？扇苄怨绦挝锖吭谫A藏過程中逐漸增加，這是因?yàn)楣麑?shí)中的淀粉等多糖類物質(zhì)逐漸降解為可溶性糖，使果實(shí)的甜度增加。在貯藏前期，可溶性固形物含量增加較為緩慢，后期增加速度加快。低溫貯藏條件下，蘋果果實(shí)的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量均顯著低于常溫貯藏條件。這是因?yàn)榈蜏匾种屏斯麑?shí)的呼吸作用和乙烯合成，從而延緩了果實(shí)的成熟進(jìn)程。在低溫貯藏過程中，果實(shí)硬度下降速度明顯減緩，可溶性固形物含量增加速度也較慢。這表明低溫能夠有效保持果實(shí)的硬度和品質(zhì)，延長果實(shí)的保鮮期。乙烯處理組果實(shí)的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量在處理后迅速升高，且顯著高于對照組。這說明乙烯處理能夠促進(jìn)果實(shí)的呼吸作用和乙烯合成，加速果實(shí)的成熟。在乙烯處理后，果實(shí)硬度下降速度加快，可溶性固形物含量增加速度也明顯加快。這表明乙烯能夠促進(jìn)果實(shí)的軟化和糖分積累，使果實(shí)更快地達(dá)到成熟狀態(tài)。[此處插入蘋果果實(shí)成熟過程中生理指標(biāo)變化圖]3.3.2蘋果果實(shí)成熟過程中淀粉染色以及淀粉和糖含量的變化蘋果果實(shí)成熟過程中淀粉染色以及淀粉和糖含量的變化結(jié)果如圖4所示。隨著果實(shí)的成熟，淀粉染色逐漸變淺，表明淀粉含量逐漸減少。在貯藏初期，果實(shí)淀粉含量較高，淀粉染色呈現(xiàn)深藍(lán)色。隨著貯藏時(shí)間的延長，淀粉含量逐漸下降，淀粉染色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)色。在貯藏后期，淀粉含量極低，淀粉染色幾乎消失。淀粉含量的測定結(jié)果顯示，在常溫貯藏條件下，蘋果果實(shí)淀粉含量在貯藏初期迅速下降，在第9天左右下降速度減緩，之后繼續(xù)緩慢下降。這與淀粉染色的結(jié)果一致，表明果實(shí)中的淀粉在貯藏前期快速降解，后期降解速度逐漸減慢?？扇苄蕴呛吭谫A藏過程中逐漸增加，在貯藏初期增加速度較慢，隨著貯藏時(shí)間的延長，增加速度加快。這是因?yàn)榈矸劢到猱a(chǎn)生的葡萄糖等可溶性糖逐漸積累，使果實(shí)的甜度增加。低溫貯藏條件下，蘋果果實(shí)淀粉含量下降速度明顯慢于常溫貯藏條件。這是因?yàn)榈蜏匾种屏说矸劢到庀嚓P(guān)酶的活性，從而延緩了淀粉的降解。在低溫貯藏過程中，可溶性糖含量增加速度也較慢，這與淀粉降解速度減緩有關(guān)。乙烯處理組果實(shí)的淀粉含量在處理后迅速下降，顯著低于對照組。這表明乙烯能夠促進(jìn)淀粉的降解，加速果實(shí)的成熟。在乙烯處理后，可溶性糖含量迅速增加，且顯著高于對照組。這說明乙烯處理促進(jìn)了淀粉降解為可溶性糖，使果實(shí)的甜度更快地增加。[此處插入蘋果果實(shí)成熟過程中淀粉染色以及淀粉和糖含量變化圖]3.3.3β-淀粉酶基因家族成員在四種成熟過程中的表達(dá)變化利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析β-淀粉酶基因家族成員在蘋果果實(shí)成熟過程中的表達(dá)變化，結(jié)果如圖5所示。在常溫貯藏條件下，MdBam1、MdBam3、MdBam5和MdBam7基因的表達(dá)量在貯藏初期逐漸升高，在第9天左右達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。MdBam2、MdBam4、MdBam6、MdBam8、MdBam9和MdBam10基因的表達(dá)量在貯藏過程中相對較低，且變化不明顯。這表明MdBam1、MdBam3、MdBam5和MdBam7基因可能在蘋果果實(shí)淀粉降解過程中發(fā)揮重要作用。低溫貯藏條件下，MdBam1、MdBam3、MdBam5和MdBam7基因的表達(dá)量顯著低于常溫貯藏條件。這說明低溫抑制了這些基因的表達(dá)，從而減緩了淀粉的降解速度。在低溫貯藏過程中，MdBam2、MdBam4、MdBam6、MdBam8、MdBam9和MdBam10基因的表達(dá)量也較低，且變化不明顯。乙烯處理組果實(shí)中，MdBam1、MdBam3、MdBam5和MdBam7基因的表達(dá)量在處理后迅速升高，且顯著高于對照組。這表明乙烯能夠誘導(dǎo)這些基因的表達(dá)，促進(jìn)淀粉的降解。在乙烯處理后，MdBam2、MdBam4、MdBam6、MdBam8、MdBam9和MdBam10基因的表達(dá)量變化不明顯。[此處插入β-淀粉酶基因家族成員在四種成熟過程中的表達(dá)變化圖]3.3.4MdBam5的瞬時(shí)過表達(dá)分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證MdBam5基因在蘋果果實(shí)淀粉降解中的作用，對其進(jìn)行了瞬時(shí)過表達(dá)分析。將MdBam5基因的瞬時(shí)過表達(dá)載體導(dǎo)入煙草葉片中，通過熒光定量qRT-PCR檢測MdBam5基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，瞬時(shí)過表達(dá)組中MdBam5基因的表達(dá)量顯著高于對照組，表明MdBam5基因在煙草葉片中成功實(shí)現(xiàn)了瞬時(shí)過表達(dá)。對瞬時(shí)過表達(dá)MdBam5基因的煙草葉片中的淀粉和可溶性糖含量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖6所示。與對照組相比，瞬時(shí)過表達(dá)組煙草葉片中的淀粉含量顯著降低，而可溶性糖含量顯著增加。這表明MdBam5基因的瞬時(shí)過表達(dá)能夠促進(jìn)淀粉的降解，增加可溶性糖的積累，從而驗(yàn)證了MdBam5基因在淀粉降解過程中的重要作用。[此處插入MdBam5瞬時(shí)過表達(dá)后煙草葉片中淀粉和可溶性糖含量變化圖]3.4討論本研究系統(tǒng)地分析了蘋果采后淀粉降解特征以及β-淀粉酶基因家族成員的表達(dá)變化，通過對不同貯藏條件下蘋果果實(shí)生理指標(biāo)、淀粉和可溶性糖含量以及基因表達(dá)的測定，揭示了蘋果采后淀粉降解的規(guī)律和相關(guān)基因的作用。在蘋果果實(shí)成熟過程中，呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量呈現(xiàn)出典型的躍變型果實(shí)特征，即先逐漸升高，在第9天左右達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。這與前人對躍變型果實(shí)的研究結(jié)果一致，表明乙烯在蘋果果實(shí)成熟過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。乙烯作為一種重要的植物激素，能夠啟動果實(shí)成熟相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)果實(shí)的呼吸作用和各種生理生化變化，從而加速果實(shí)的成熟進(jìn)程。果實(shí)硬度的逐漸下降和可溶性固形物含量的逐漸增加，也表明果實(shí)隨著成熟進(jìn)程，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)逐漸破壞，淀粉等多糖類物質(zhì)不斷降解為可溶性糖，果實(shí)的品質(zhì)和口感發(fā)生了顯著變化。在淀粉降解方面，本研究發(fā)現(xiàn)隨著果實(shí)的成熟，淀粉含量逐漸下降，可溶性糖含量逐漸增加，這與前人的研究結(jié)果相符。在蘋果果實(shí)成熟過程中，淀粉在一系列酶的作用下逐漸水解為葡萄糖、果糖和蔗糖等可溶性糖，使果實(shí)的甜度增加，口感變好。淀粉染色結(jié)果直觀地顯示了淀粉含量的變化趨勢，隨著貯藏時(shí)間的延長，淀粉染色逐漸變淺，表明淀粉不斷被降解。低溫貯藏能夠顯著抑制蘋果果實(shí)的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量，減緩淀粉降解速度，這是因?yàn)榈蜏啬軌蚪档兔傅幕钚裕种乒麑?shí)的生理代謝過程，從而延緩果實(shí)的成熟和衰老。乙烯處理則能夠顯著促進(jìn)果實(shí)的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量，加速淀粉降解，這進(jìn)一步證明了乙烯在果實(shí)成熟和淀粉降解過程中的重要作用。乙烯能夠誘導(dǎo)淀粉降解相關(guān)酶的基因表達(dá)，提高酶的活性，從而促進(jìn)淀粉的水解。通過對β-淀粉酶基因家族成員表達(dá)變化的分析，發(fā)現(xiàn)MdBam1、MdBam3、MdBam5和MdBam7基因的表達(dá)量與淀粉降解密切相關(guān)。在常溫貯藏條件下，這些基因的表達(dá)量在貯藏初期逐漸升高，在第9天左右達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，與淀粉含量的變化趨勢呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)。這表明這些基因可能在蘋果果實(shí)淀粉降解過程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)量的變化可能直接影響β-淀粉酶的合成和活性，進(jìn)而影響淀粉的降解速度。低溫貯藏條件下，MdBam1、MdBam3、MdBam5和MdBam7基因的表達(dá)量顯著低于常溫貯藏條件，這與低溫抑制淀粉降解的結(jié)果一致，進(jìn)一步說明這些基因的表達(dá)受到溫度的調(diào)控，低溫能夠抑制其表達(dá)，從而減緩淀粉的降解速度。乙烯處理組果實(shí)中，MdBam1、MdBam3、MdBam5和MdBam7基因的表達(dá)量在處理后迅速升高，且顯著高于對照組，這表明乙烯能夠誘導(dǎo)這些基因的表達(dá)，促進(jìn)淀粉的降解，說明乙烯通過調(diào)控β-淀粉酶基因的表達(dá)來影響淀粉降解過程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MdBam5基因在蘋果果實(shí)淀粉降解中的作用，本研究進(jìn)行了瞬時(shí)過表達(dá)分析。結(jié)果表明，瞬時(shí)過表達(dá)MdBam5基因能夠顯著降低煙草葉片中的淀粉含量，增加可溶性糖含量，這直接證明了MdBam5基因在淀粉降解過程中的重要作用。MdBam5基因編碼的β-淀粉酶可能通過催化淀粉水解生成麥芽糖，進(jìn)而促進(jìn)淀粉的降解，增加可溶性糖的積累，從而影響果實(shí)的品質(zhì)和成熟進(jìn)程。本研究通過對蘋果采后淀粉降解特征及β-淀粉酶基因家族成員表達(dá)分析，明確了MdBam1、MdBam3、MdBam5和MdBam7基因在淀粉降解過程中的重要作用，尤其是MdBam5基因，為深入研究蘋果采后淀粉降解的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。未來的研究可以進(jìn)一步探究這些基因的調(diào)控機(jī)制，以及它們與其他淀粉降解相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，為通過基因工程手段調(diào)控蘋果果實(shí)淀粉代謝，改善果實(shí)品質(zhì)提供更多的理論支持。3.5本章小結(jié)本章通過對‘富士’蘋果在不同貯藏條件下的研究，系統(tǒng)地揭示了蘋果采后淀粉降解特征及β-淀粉酶基因家族成員的表達(dá)規(guī)律。研究結(jié)果表明，蘋果果實(shí)采后隨著貯藏時(shí)間的延長，呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在第9天左右達(dá)到峰值，果實(shí)硬度逐漸下降，可溶性固形物含量逐漸增加，這些生理指標(biāo)的變化符合躍變型果實(shí)的典型特征。在淀粉降解方面，淀粉含量隨著果實(shí)成熟逐漸下降，可溶性糖含量逐漸增加，淀粉染色結(jié)果直觀地顯示了淀粉含量的動態(tài)變化。低溫貯藏能夠顯著抑制蘋果果實(shí)的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量，減緩淀粉降解速度，有效保持果實(shí)的硬度和品質(zhì)，延長果實(shí)的保鮮期；乙烯處理則能夠顯著促進(jìn)果實(shí)的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量，加速淀粉降解，使果實(shí)更快地達(dá)到成熟狀態(tài)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析β-淀粉酶基因家族成員的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)MdBam1、MdBam3、MdBam5和MdBam7基因的表達(dá)量與淀粉降解密切相關(guān)。在常溫貯藏條件下，這些基因的表達(dá)量在貯藏初期逐漸升高，在第9天左右達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，與淀粉含量的變化趨勢呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)。低溫貯藏抑制了這些基因的表達(dá)，乙烯處理則能夠誘導(dǎo)它們的表達(dá)，進(jìn)一步證明了這些基因在淀粉降解過程中的重要作用。通過瞬時(shí)過表達(dá)分析驗(yàn)證了MdBam5基因在淀粉降解中的關(guān)鍵作用，瞬時(shí)過表達(dá)MdBam5基因能夠顯著降低煙草葉片中的淀粉含量，增加可溶性糖含量。本章研究明確了蘋果采后淀粉降解特征及相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律，篩選出了與淀粉降解密切相關(guān)的基因，尤其是MdBam5基因，為深入研究蘋果采后淀粉降解的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為后續(xù)研究轉(zhuǎn)錄因子對淀粉降解基因的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。四、轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY32調(diào)控淀粉降解關(guān)鍵基因MdBam5機(jī)理分析4.1引言在明確了MdBam5基因在蘋果采后淀粉降解過程中的關(guān)鍵作用后，深入探究其調(diào)控機(jī)制成為進(jìn)一步揭示蘋果淀粉代謝分子機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子作為基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵元件，能夠通過與靶基因啟動子區(qū)域的特定順式作用元件結(jié)合，精確調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育和生理代謝過程。在蘋果采后淀粉降解進(jìn)程中，轉(zhuǎn)錄因子對淀粉降解相關(guān)基因的調(diào)控作用至關(guān)重要，它們在維持果實(shí)品質(zhì)和延長保鮮期方面發(fā)揮著不可或缺的作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物的生長發(fā)育、逆境響應(yīng)、次生代謝等多個(gè)過程中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。已有研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在果實(shí)成熟過程中參與了乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞壁代謝、色素合成等多個(gè)生理過程的調(diào)控。然而，在蘋果采后淀粉降解過程中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子的具體調(diào)控機(jī)制尚未得到充分揭示。明確WRKY轉(zhuǎn)錄因子在蘋果采后淀粉降解中的調(diào)控作用，不僅有助于深入理解蘋果果實(shí)成熟的分子機(jī)制，還為通過基因工程手段調(diào)控蘋果果實(shí)淀粉代謝、改善果實(shí)品質(zhì)提供了重要的理論依據(jù)。本研究聚焦于轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY32對淀粉降解關(guān)鍵基因MdBam5的調(diào)控機(jī)理。通過一系列實(shí)驗(yàn)，包括酵母單雜交實(shí)驗(yàn)、煙草葉片瞬時(shí)過表達(dá)分析、熒光定量qRT-PCR、GUS活性測定以及啟動子活性分析等，旨在揭示MdWRKY32與MdBam5之間的相互作用關(guān)系，明確MdWRKY32對MdBam5基因表達(dá)的調(diào)控方式，以及這種調(diào)控在蘋果采后淀粉降解過程中的作用機(jī)制。這將為深入了解蘋果采后淀粉降解的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供重要的理論支持，為蘋果果實(shí)品質(zhì)的改良和保鮮技術(shù)的創(chuàng)新奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.2材料與方法4.2.1蘋果基因組DNA提取選用生長健壯、無病蟲害的‘富士’蘋果幼嫩葉片作為提取基因組DNA的材料。采用改良的CTAB法進(jìn)行提取，具體步驟如下：取約0.2g葉片置于液氮預(yù)冷的研缽中，迅速研磨成粉末狀，確保研磨充分，使細(xì)胞充分破碎。將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移至含有1.5mLDNA提取洗液（含2%β-巰基乙醇）的2.0mL離心管中，立即顛倒混勻，使粉末與洗液充分接觸。室溫下13,000rpm離心10min，高速離心可有效去除雜質(zhì)，離心時(shí)務(wù)必配平，以保護(hù)離心機(jī)。小心棄去上清液，避免吸走沉淀。再加入1.5mL洗液，再次顛倒充分混勻，必要時(shí)可用移液槍輔助混勻，確保殘留雜質(zhì)被充分清洗。常溫12,000rpm離心10min，棄上清液。加入800-1,000μL65°C預(yù)熱的DNA提取緩沖液（含1%β-巰基乙醇），顛倒充分混勻，使DNA充分溶解。65°C溫浴30-60min，期間每隔10-15min輕輕顛倒混勻一次，以保證反應(yīng)均勻進(jìn)行。然后常溫12,000rpm離心10min。小心吸取上清液于2.0mL離心管中，加入等體積的CIA（氯仿：異戊醇=24:1），顛倒充分混勻，也可渦旋震蕩40-60s，使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)充分沉淀。4°C、12,000rpm離心12min，小心吸取上清液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，注意避免吸到中間層的雜質(zhì)。重復(fù)抽提1次，以進(jìn)一步提高DNA的純度。轉(zhuǎn)移上清液至新的1.5mL離心管（約400μL），加入兩倍體積-20°C預(yù)冷的無水乙醇