基于鐵死亡和免疫特征的黑素瘤預(yù)后模型構(gòu)建與驗(yàn)證研究

基于鐵死亡和免疫特征的黑素瘤預(yù)后模型構(gòu)建與驗(yàn)證研究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1黑素瘤的危害與現(xiàn)狀黑素瘤是一種起源于黑素細(xì)胞的惡性腫瘤，具有極高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，是皮膚癌中致死率最高的類型。近年來，全球黑素瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢，據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）的數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新增黑素瘤病例約為32.4萬例，死亡人數(shù)約為5.7萬例。在歐美等地區(qū)，黑素瘤的發(fā)病率尤為突出，如澳大利亞的昆士蘭地區(qū)，其黑素瘤發(fā)病率高達(dá)44/10萬。在中國，雖然黑素瘤的發(fā)病率相對(duì)較低，但增長速度較快，已成為嚴(yán)重威脅民眾健康的公共衛(wèi)生問題。黑素瘤的早期癥狀往往不明顯，容易被忽視，許多患者確診時(shí)已處于晚期，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)。晚期黑素瘤患者的預(yù)后極差，5年生存率不足10%，中位生存期僅為6-9個(gè)月。此外，黑素瘤的治療費(fèi)用高昂，給患者家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，深入研究黑素瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，對(duì)于提高黑素瘤患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。1.1.2鐵死亡與免疫在黑素瘤研究中的重要性鐵死亡是一種新型的程序性細(xì)胞死亡方式，其特征為鐵離子依賴性的脂質(zhì)過氧化積累，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞死亡。近年來，越來越多的研究表明，鐵死亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中發(fā)揮著重要作用。在黑素瘤中，鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)異常與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移能力和預(yù)后密切相關(guān)。誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡可以有效抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，為黑素瘤的治療提供了新的策略。免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御腫瘤的重要防線，免疫細(xì)胞可以識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而，黑素瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的免疫逃逸能力，能夠通過多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。因此，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，打破黑素瘤細(xì)胞的免疫逃逸，是提高黑素瘤治療效果的關(guān)鍵。鐵死亡與免疫之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。一方面，鐵死亡過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和細(xì)胞碎片可以作為危險(xiǎn)信號(hào)，激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，吸引免疫細(xì)胞浸潤到腫瘤組織中，增強(qiáng)抗腫瘤免疫。另一方面，免疫系統(tǒng)可以通過調(diào)節(jié)鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性。因此，深入研究鐵死亡與免疫在黑素瘤中的相互作用機(jī)制，對(duì)于開發(fā)新的治療策略具有重要的指導(dǎo)意義。1.1.3構(gòu)建預(yù)后模型的臨床價(jià)值準(zhǔn)確預(yù)測黑素瘤患者的預(yù)后對(duì)于制定個(gè)性化的治療方案、評(píng)估治療效果和指導(dǎo)臨床決策具有重要意義。目前，臨床上常用的黑素瘤預(yù)后評(píng)估指標(biāo)主要包括腫瘤的分期、厚度、潰瘍情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，但這些指標(biāo)存在一定的局限性，無法全面反映患者的預(yù)后情況。隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于多基因表達(dá)譜的預(yù)后模型逐漸成為研究熱點(diǎn)。通過篩選與黑素瘤預(yù)后相關(guān)的基因，構(gòu)建預(yù)后模型，可以更準(zhǔn)確地預(yù)測患者的生存情況，為臨床治療提供更有價(jià)值的信息。此外，預(yù)后模型還可以幫助醫(yī)生識(shí)別高風(fēng)險(xiǎn)患者，及時(shí)采取更積極的治療措施，提高患者的生存率。同時(shí)，對(duì)于低風(fēng)險(xiǎn)患者，可以避免過度治療，減少不必要的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和副作用。因此，構(gòu)建基于鐵死亡和免疫相關(guān)基因的黑素瘤預(yù)后模型，具有重要的臨床價(jià)值和應(yīng)用前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1黑素瘤預(yù)后評(píng)估的傳統(tǒng)方法目前，臨床上常用的黑素瘤預(yù)后評(píng)估方法主要基于腫瘤的病理特征和臨床分期，如Breslow深度評(píng)分系統(tǒng)、Clark分級(jí)系統(tǒng)和美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）分期系統(tǒng)等。Breslow深度評(píng)分系統(tǒng)是通過測量腫瘤侵犯皮膚的垂直厚度來評(píng)估黑素瘤的預(yù)后。該方法簡單直觀，與患者的生存率具有顯著相關(guān)性，是目前應(yīng)用最廣泛的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)之一。研究表明，Breslow厚度小于1.0mm的黑素瘤患者，5年生存率可達(dá)90%以上；而厚度大于4.0mm的患者，5年生存率則降至20%以下。然而，Breslow深度評(píng)分系統(tǒng)僅考慮了腫瘤的厚度，忽略了腫瘤的位置、形狀、顏色等其他因素，這些因素可能對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生影響。Clark分級(jí)系統(tǒng)則是基于腫瘤浸潤深度和水平擴(kuò)展程度的預(yù)后評(píng)估模型，它將黑素瘤分為五個(gè)級(jí)別，從I級(jí)到V級(jí)，腫瘤的侵襲性逐漸增加。與Breslow深度評(píng)分系統(tǒng)相比，Clark分級(jí)系統(tǒng)能夠更好地識(shí)別高風(fēng)險(xiǎn)患者，并對(duì)局部復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。但是，由于其復(fù)雜的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)施起來可能會(huì)有一定的困難，需要專業(yè)人員進(jìn)行操作。AJCC分期系統(tǒng)是一種綜合評(píng)估黑素瘤患者預(yù)后的模型，它包括了腫瘤的大小、深度、潰瘍情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等多個(gè)因素。該系統(tǒng)不僅可以評(píng)估患者的生存率，還可以為治療方案的選擇提供依據(jù)，如是否需要手術(shù)切除、放療或免疫療法。不過，AJCC分期系統(tǒng)依賴于許多臨床檢查和影像學(xué)檢查的結(jié)果，因此需要專門的醫(yī)療團(tuán)隊(duì)進(jìn)行評(píng)估，且對(duì)于一些早期或微小的病變，其診斷準(zhǔn)確性可能受到限制。除了上述傳統(tǒng)的預(yù)后評(píng)估方法外，還有一些其他的指標(biāo)也被用于評(píng)估黑素瘤的預(yù)后，如腫瘤的有絲分裂率、淋巴細(xì)胞浸潤情況、S100蛋白表達(dá)水平等。然而，這些指標(biāo)往往存在一定的局限性，無法全面準(zhǔn)確地預(yù)測患者的預(yù)后。1.2.2鐵死亡和免疫相關(guān)研究進(jìn)展近年來，鐵死亡和免疫在黑素瘤中的作用機(jī)制成為研究熱點(diǎn)，取得了一系列重要的研究成果。在鐵死亡方面，研究發(fā)現(xiàn)，黑素瘤細(xì)胞的鐵死亡敏感性與其鐵代謝、脂質(zhì)代謝和抗氧化系統(tǒng)密切相關(guān)。一些關(guān)鍵的鐵死亡調(diào)節(jié)基因，如谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）和鐵蛋白重鏈1（FTH1）等，在黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中發(fā)揮著重要作用。通過抑制GPX4的活性或降低SLC7A11的表達(dá)，可以誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。此外，一些天然產(chǎn)物和小分子化合物，如姜黃素、青蒿素和erastin等，也被證實(shí)具有誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞鐵死亡的作用，為黑素瘤的治療提供了新的潛在藥物。在免疫方面，黑素瘤被認(rèn)為是一種免疫原性較強(qiáng)的腫瘤，免疫系統(tǒng)在黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中起著至關(guān)重要的作用。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞可以識(shí)別和殺傷黑素瘤細(xì)胞，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。然而，黑素瘤細(xì)胞也可以通過多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，如表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子（如PD-1、PD-L1和CTLA-4等）、分泌免疫抑制因子（如IL-10和TGF-β等）和誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡等。因此，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，打破黑素瘤細(xì)胞的免疫逃逸，是提高黑素瘤治療效果的關(guān)鍵。目前，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）已成為晚期黑素瘤的一線治療方法，顯著提高了患者的生存率。然而，只有部分患者對(duì)ICIs治療有效，且存在耐藥性和不良反應(yīng)等問題，限制了其臨床應(yīng)用。盡管鐵死亡和免疫在黑素瘤中的研究取得了一定的進(jìn)展，但仍存在許多問題亟待解決。例如，鐵死亡與免疫之間的相互作用機(jī)制尚不完全清楚，如何通過調(diào)節(jié)鐵死亡來增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，以及如何克服免疫治療的耐藥性等，都需要進(jìn)一步深入研究。1.2.3現(xiàn)有預(yù)后模型的局限性目前，基于傳統(tǒng)臨床病理指標(biāo)構(gòu)建的黑素瘤預(yù)后模型，雖然在一定程度上能夠預(yù)測患者的預(yù)后，但存在明顯的局限性。這些模型主要依賴于腫瘤的大小、厚度、分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等指標(biāo)，無法全面反映腫瘤的生物學(xué)行為和患者的個(gè)體差異。例如，一些早期黑素瘤患者，盡管腫瘤大小和厚度符合低風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)準(zhǔn)，但仍可能出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差；而一些晚期黑素瘤患者，經(jīng)過積極治療后，卻能獲得較好的生存效果。這表明傳統(tǒng)的預(yù)后模型在準(zhǔn)確性和全面性方面存在不足，無法為臨床治療提供精準(zhǔn)的指導(dǎo)。隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于基因表達(dá)譜的預(yù)后模型逐漸成為研究熱點(diǎn)。然而，現(xiàn)有基于基因表達(dá)譜的預(yù)后模型也存在一些問題。一方面，不同研究篩選出的預(yù)后相關(guān)基因存在較大差異，缺乏一致性和穩(wěn)定性，導(dǎo)致模型的通用性和可靠性受到質(zhì)疑。另一方面，這些模型往往只考慮了基因表達(dá)水平的變化，忽略了基因之間的相互作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，無法全面揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。此外，現(xiàn)有預(yù)后模型大多是基于單一數(shù)據(jù)集構(gòu)建和驗(yàn)證的，缺乏多中心、大樣本的驗(yàn)證，其臨床應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步評(píng)估。綜上所述，現(xiàn)有黑素瘤預(yù)后模型在準(zhǔn)確性、全面性和通用性等方面存在不足，無法滿足臨床精準(zhǔn)治療的需求。因此，迫切需要構(gòu)建一種更加準(zhǔn)確、全面、可靠的預(yù)后模型，以提高黑素瘤患者的預(yù)后評(píng)估水平，為臨床治療提供更有價(jià)值的信息。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在深入探究黑素瘤中鐵死亡和免疫相關(guān)基因的表達(dá)模式及其相互作用機(jī)制，通過生物信息學(xué)分析和機(jī)器學(xué)習(xí)算法，構(gòu)建基于鐵死亡和免疫相關(guān)基因的黑素瘤預(yù)后模型，并在多個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集和臨床樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，以提高黑素瘤患者預(yù)后預(yù)測的準(zhǔn)確性和可靠性。具體目標(biāo)如下：篩選關(guān)鍵基因：從公共數(shù)據(jù)庫和臨床樣本中獲取黑素瘤患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，結(jié)合鐵死亡和免疫相關(guān)的生物學(xué)知識(shí)，篩選出與黑素瘤預(yù)后密切相關(guān)的鐵死亡和免疫相關(guān)基因。構(gòu)建預(yù)后模型：運(yùn)用生物信息學(xué)方法和機(jī)器學(xué)習(xí)算法，如Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型、最小絕對(duì)收縮和選擇算子（Lasso）回歸等，構(gòu)建基于鐵死亡和免疫相關(guān)基因的黑素瘤預(yù)后模型，確定模型的最佳參數(shù)和基因組合。驗(yàn)證模型性能：在多個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)集和臨床樣本中對(duì)構(gòu)建的預(yù)后模型進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證，評(píng)估模型的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和泛化能力，與現(xiàn)有預(yù)后模型進(jìn)行比較，驗(yàn)證本模型的優(yōu)勢。分析臨床相關(guān)性：分析預(yù)后模型與黑素瘤患者臨床特征（如腫瘤分期、轉(zhuǎn)移情況、治療反應(yīng)等）之間的關(guān)系，探討模型在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值，為黑素瘤患者的個(gè)性化治療和預(yù)后評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。1.3.2研究內(nèi)容為了實(shí)現(xiàn)上述研究目標(biāo)，本研究將圍繞以下幾個(gè)方面展開具體內(nèi)容：數(shù)據(jù)收集與預(yù)處理：從癌癥基因組圖譜（TCGA）、基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）等公共數(shù)據(jù)庫中下載黑素瘤患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)、臨床信息和生存數(shù)據(jù)，同時(shí)收集本中心的臨床樣本及相關(guān)數(shù)據(jù)。對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理、質(zhì)量控制和缺失值填補(bǔ)，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。此外，還將對(duì)鐵死亡和免疫相關(guān)基因進(jìn)行注釋和功能富集分析，了解其在黑素瘤發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)功能。關(guān)鍵基因篩選：運(yùn)用生物信息學(xué)方法，如差異表達(dá)分析、單因素Cox回歸分析等，篩選出在黑素瘤患者中差異表達(dá)且與預(yù)后顯著相關(guān)的鐵死亡和免疫相關(guān)基因。進(jìn)一步通過多因素Cox回歸分析和Lasso回歸，對(duì)篩選出的基因進(jìn)行降維，確定與黑素瘤預(yù)后最為密切相關(guān)的關(guān)鍵基因。為了深入了解這些關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能和潛在作用機(jī)制，還將進(jìn)行基因本體（GO）富集分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析等。預(yù)后模型構(gòu)建：基于篩選出的關(guān)鍵基因，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型構(gòu)建黑素瘤預(yù)后模型，計(jì)算每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。通過受試者工作特征（ROC）曲線、一致性指數(shù)（C-index）等指標(biāo)評(píng)估模型的預(yù)測性能，確定模型的最佳截?cái)嘀?，將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。同時(shí)，利用列線圖（Nomogram）將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者的臨床特征相結(jié)合，構(gòu)建可視化的預(yù)后預(yù)測工具，方便臨床醫(yī)生使用。模型驗(yàn)證與比較：在內(nèi)部驗(yàn)證中，采用交叉驗(yàn)證（如K折交叉驗(yàn)證）的方法，對(duì)構(gòu)建的預(yù)后模型在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集內(nèi)進(jìn)行多次驗(yàn)證，評(píng)估模型的穩(wěn)定性和泛化能力。在外部驗(yàn)證中，使用來自其他公共數(shù)據(jù)庫或本中心的獨(dú)立臨床樣本數(shù)據(jù)，對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，比較模型在不同數(shù)據(jù)集上的預(yù)測性能。將本研究構(gòu)建的預(yù)后模型與現(xiàn)有的基于傳統(tǒng)臨床病理指標(biāo)或其他基因特征的預(yù)后模型進(jìn)行比較，通過比較ROC曲線下面積（AUC）、C-index等指標(biāo)，驗(yàn)證本模型的優(yōu)越性。模型與臨床特征關(guān)系分析：分析預(yù)后模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與黑素瘤患者臨床特征（如年齡、性別、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等）之間的相關(guān)性，探討模型在不同臨床亞組中的預(yù)測性能。研究風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者治療反應(yīng)（如對(duì)免疫治療、靶向治療的響應(yīng)率）之間的關(guān)系，評(píng)估模型在指導(dǎo)臨床治療決策方面的價(jià)值。通過生存分析，比較高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者在不同治療方案下的生存差異，為個(gè)性化治療提供依據(jù)。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法生物信息學(xué)分析：從TCGA、GEO等公共數(shù)據(jù)庫下載黑素瘤患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)、臨床信息和生存數(shù)據(jù)。利用R語言、Python等生物信息學(xué)工具對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，包括數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、缺失值填補(bǔ)、批次效應(yīng)校正等。通過差異表達(dá)分析篩選出在黑素瘤組織與正常組織中差異表達(dá)的鐵死亡和免疫相關(guān)基因；運(yùn)用單因素Cox回歸分析、多因素Cox回歸分析等方法，確定與黑素瘤預(yù)后顯著相關(guān)的基因。利用Lasso回歸進(jìn)行特征選擇，構(gòu)建基于關(guān)鍵基因的預(yù)后模型。此外，還將使用基因富集分析（如GO富集分析、KEGG通路富集分析）探究關(guān)鍵基因參與的生物學(xué)過程和信號(hào)通路。機(jī)器學(xué)習(xí)算法：采用多種機(jī)器學(xué)習(xí)算法，如支持向量機(jī)（SVM）、隨機(jī)森林（RF）、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）等，對(duì)黑素瘤患者的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測，并與傳統(tǒng)的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行比較，評(píng)估不同算法的性能。通過交叉驗(yàn)證、網(wǎng)格搜索等方法優(yōu)化機(jī)器學(xué)習(xí)模型的參數(shù)，提高模型的準(zhǔn)確性和泛化能力。利用特征重要性分析方法，如Gini指數(shù)、信息增益等，確定對(duì)預(yù)后預(yù)測貢獻(xiàn)較大的基因和臨床特征，進(jìn)一步優(yōu)化模型。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：收集本中心的黑素瘤患者臨床樣本，包括腫瘤組織和癌旁組織，提取RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR，驗(yàn)證生物信息學(xué)分析篩選出的關(guān)鍵基因在臨床樣本中的表達(dá)水平。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)等，研究關(guān)鍵基因?qū)谒亓黾?xì)胞生物學(xué)行為的影響；利用鐵死亡誘導(dǎo)劑和抑制劑處理黑素瘤細(xì)胞，觀察細(xì)胞的鐵死亡發(fā)生情況以及對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建黑素瘤小鼠模型，驗(yàn)證關(guān)鍵基因在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用，以及鐵死亡與免疫之間的相互作用機(jī)制。臨床數(shù)據(jù)分析：收集患者的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤分期、治療方式等，分析這些臨床因素與黑素瘤患者預(yù)后的關(guān)系。將構(gòu)建的預(yù)后模型應(yīng)用于臨床樣本，評(píng)估模型對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測準(zhǔn)確性，并與傳統(tǒng)的臨床預(yù)后評(píng)估指標(biāo)進(jìn)行比較。通過生存分析，如Kaplan-Meier分析、Log-rank檢驗(yàn)等，比較不同風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存差異，驗(yàn)證模型的臨床價(jià)值。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示：數(shù)據(jù)收集：從TCGA、GEO等公共數(shù)據(jù)庫下載黑素瘤患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)、臨床信息和生存數(shù)據(jù)，同時(shí)收集本中心的臨床樣本及相關(guān)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)預(yù)處理：對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理、質(zhì)量控制和缺失值填補(bǔ)，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。對(duì)鐵死亡和免疫相關(guān)基因進(jìn)行注釋和功能富集分析。關(guān)鍵基因篩選：運(yùn)用差異表達(dá)分析、單因素Cox回歸分析等方法，篩選出在黑素瘤患者中差異表達(dá)且與預(yù)后顯著相關(guān)的鐵死亡和免疫相關(guān)基因。通過多因素Cox回歸分析和Lasso回歸，確定與黑素瘤預(yù)后最為密切相關(guān)的關(guān)鍵基因，并進(jìn)行基因富集分析。預(yù)后模型構(gòu)建：基于篩選出的關(guān)鍵基因，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型構(gòu)建黑素瘤預(yù)后模型，計(jì)算每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。利用ROC曲線、C-index等指標(biāo)評(píng)估模型的預(yù)測性能，確定模型的最佳截?cái)嘀?，將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。構(gòu)建列線圖可視化預(yù)后預(yù)測工具。模型驗(yàn)證：在內(nèi)部驗(yàn)證中，采用交叉驗(yàn)證的方法對(duì)模型進(jìn)行多次驗(yàn)證，評(píng)估模型的穩(wěn)定性和泛化能力。在外部驗(yàn)證中，使用來自其他公共數(shù)據(jù)庫或本中心的獨(dú)立臨床樣本數(shù)據(jù)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，與現(xiàn)有預(yù)后模型進(jìn)行比較，驗(yàn)證本模型的優(yōu)越性。模型與臨床特征關(guān)系分析：分析預(yù)后模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與黑素瘤患者臨床特征之間的相關(guān)性，探討模型在不同臨床亞組中的預(yù)測性能。研究風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者治療反應(yīng)之間的關(guān)系，評(píng)估模型在指導(dǎo)臨床治療決策方面的價(jià)值。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：通過臨床樣本驗(yàn)證、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵基因的功能以及鐵死亡與免疫之間的相互作用機(jī)制，為模型的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中應(yīng)清晰展示從數(shù)據(jù)收集到模型驗(yàn)證及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的整個(gè)流程，每個(gè)步驟之間用箭頭連接，標(biāo)注清楚各步驟的主要操作和分析方法]圖1研究技術(shù)路線圖二、黑素瘤相關(guān)鐵死亡和免疫的理論基礎(chǔ)2.1黑素瘤概述2.1.1黑素瘤的定義與分類黑素瘤，全稱為惡性黑素瘤，是一種起源于黑素細(xì)胞的高度惡性腫瘤。黑素細(xì)胞廣泛分布于皮膚、黏膜、眼葡萄膜、軟腦膜等部位，當(dāng)這些黑素細(xì)胞發(fā)生異常增殖和惡變時(shí)，便會(huì)形成黑素瘤。黑素瘤的惡性程度極高，具有很強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后往往較差。根據(jù)腫瘤的發(fā)生部位和形態(tài)特征，黑素瘤主要分為以下幾種類型：皮膚黑素瘤：最為常見，約占所有黑素瘤的80%。其可發(fā)生于身體的任何部位，常見于暴露部位，如頭頸部、四肢等。皮膚黑素瘤的形態(tài)多樣，早期可表現(xiàn)為色素沉著斑，顏色不均勻，邊界不規(guī)則，隨著病情進(jìn)展，可逐漸隆起形成結(jié)節(jié)、斑塊，甚至出現(xiàn)潰瘍、出血等癥狀。肢端黑素瘤：多發(fā)生于手掌、腳底、指甲下等肢端部位，在亞洲人群中相對(duì)常見。由于肢端部位的皮膚結(jié)構(gòu)特殊，早期診斷較為困難，且該類型黑素瘤的侵襲性較強(qiáng)，預(yù)后較差。其臨床表現(xiàn)為肢端出現(xiàn)色素沉著性斑塊或結(jié)節(jié)，可伴有疼痛、瘙癢等癥狀，部分患者可出現(xiàn)指甲變形、脫落等情況。黏膜黑素瘤：發(fā)生于口腔、鼻腔、消化道、泌尿生殖道等黏膜表面，較為罕見，但惡性程度高。黏膜黑素瘤的癥狀不典型，早期容易被忽視，常見癥狀包括黏膜部位的出血、潰瘍、腫塊等，隨著腫瘤的進(jìn)展，可侵犯周圍組織和器官，導(dǎo)致相應(yīng)的功能障礙。眼黑素瘤：主要發(fā)生在眼睛的葡萄膜、視網(wǎng)膜等部位，是一種罕見但嚴(yán)重的黑素瘤類型。眼黑素瘤可導(dǎo)致視力下降、視野缺損、眼部疼痛等癥狀，嚴(yán)重影響患者的視力和生活質(zhì)量。若不及時(shí)治療，腫瘤可向眼外轉(zhuǎn)移，危及生命。轉(zhuǎn)移性黑素瘤：是指黑素瘤細(xì)胞通過血液或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到身體其他部位，如淋巴結(jié)、肝臟、肺部、骨骼等。轉(zhuǎn)移性黑素瘤的癥狀取決于轉(zhuǎn)移部位，常見癥狀包括轉(zhuǎn)移部位的疼痛、腫脹、功能障礙等，病情往往較為嚴(yán)重，治療難度較大。此外，根據(jù)腫瘤的生長方式和病理特征，黑素瘤還可分為淺表擴(kuò)散型、結(jié)節(jié)型、惡性雀斑樣痣型等亞型，不同亞型的黑素瘤在臨床表現(xiàn)、生物學(xué)行為和預(yù)后方面存在一定差異。2.1.2黑素瘤的發(fā)病機(jī)制黑素瘤的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的多因素過程，涉及遺傳、環(huán)境、免疫等多個(gè)方面，目前尚未完全明確。以下是一些主要的發(fā)病因素及其作用機(jī)制：遺傳因素：遺傳因素在黑素瘤的發(fā)病中起著重要作用。約10%-15%的黑素瘤患者有家族遺傳史，這些家族中往往存在特定的基因突變，如CDKN2A、BRAF、NRAS等。CDKN2A基因編碼的p16蛋白和p14ARF蛋白是重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子，其突變可導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，促進(jìn)黑素細(xì)胞的異常增殖和惡變。BRAF基因和NRAS基因是RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路中的關(guān)鍵成員，該信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和存活中起重要作用。BRAF或NRAS基因突變可導(dǎo)致該信號(hào)通路持續(xù)激活，使黑素細(xì)胞過度增殖，增加黑素瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，一些其他基因的突變，如MITF、PTEN等，也與黑素瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。環(huán)境因素：紫外線（UV）照射是黑素瘤最重要的環(huán)境危險(xiǎn)因素。UV可分為UVA、UVB和UVC，其中UVA和UVB可到達(dá)地球表面，對(duì)皮膚造成損傷。UV照射可導(dǎo)致皮膚細(xì)胞DNA損傷，引起基因突變，如BRAF、NRAS等基因的突變，從而促進(jìn)黑素細(xì)胞的惡變。此外，UV還可抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和清除能力下降，有利于黑素瘤的發(fā)生和發(fā)展。長期暴露于陽光下、曬傷史、間歇性高強(qiáng)度日曬等都是黑素瘤的危險(xiǎn)因素。除了UV照射外，其他環(huán)境因素，如化學(xué)物質(zhì)暴露、電離輻射等，也可能與黑素瘤的發(fā)病有關(guān)，但相對(duì)較少見。免疫因素：免疫系統(tǒng)在黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中起著重要作用。正常情況下，機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞，維持機(jī)體的免疫平衡。然而，黑素瘤細(xì)胞可以通過多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。黑素瘤細(xì)胞可以表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子，如PD-1、PD-L1和CTLA-4等，這些分子可以與免疫細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞的活性，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫攻擊。黑素瘤細(xì)胞還可以分泌免疫抑制因子，如IL-10、TGF-β等，抑制免疫細(xì)胞的增殖和功能，降低機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞組成和功能異常，也可能影響機(jī)體對(duì)黑素瘤的免疫應(yīng)答。其他因素：除了遺傳、環(huán)境和免疫因素外，還有一些其他因素可能與黑素瘤的發(fā)病有關(guān)。皮膚的色素痣是黑素瘤的重要前驅(qū)病變，尤其是先天性巨痣、發(fā)育不良痣等，其惡變的風(fēng)險(xiǎn)較高。某些病毒感染，如人類乳頭瘤病毒（HPV）、EB病毒等，也可能與黑素瘤的發(fā)生有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚。此外，內(nèi)分泌因素、生活方式等也可能對(duì)黑素瘤的發(fā)病產(chǎn)生一定影響?？傊?，黑素瘤的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的多因素相互作用的過程，遺傳因素和環(huán)境因素共同作用，導(dǎo)致黑素細(xì)胞的基因突變和異常增殖，同時(shí)免疫系統(tǒng)的功能異常也為黑素瘤的發(fā)生和發(fā)展提供了條件。深入研究黑素瘤的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于尋找有效的預(yù)防和治療措施具有重要意義。2.1.3黑素瘤的臨床特征與治療方法黑素瘤的臨床表現(xiàn)因腫瘤的類型、部位和分期而異。早期黑素瘤通常表現(xiàn)為皮膚或黏膜上的色素性病變，顏色、形狀和大小可能發(fā)生變化。常見的癥狀包括：顏色改變：色素痣的顏色加深、變雜，可出現(xiàn)黑色、棕色、紅色、白色或藍(lán)色等多種顏色混合。形狀改變：病變的形狀變得不規(guī)則，邊緣模糊，可呈鋸齒狀或地圖狀。大小變化：色素痣逐漸增大，直徑超過6mm，或在短時(shí)間內(nèi)迅速增大。表面變化：病變表面可出現(xiàn)粗糙、脫屑、糜爛、潰瘍、出血等癥狀，還可能伴有瘙癢、疼痛等不適。衛(wèi)星灶：在原發(fā)病灶周圍出現(xiàn)多個(gè)小的色素性結(jié)節(jié)，稱為衛(wèi)星灶，提示腫瘤可能已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移。隨著病情的進(jìn)展，黑素瘤可侵犯周圍組織和器官，引起相應(yīng)的癥狀。如侵犯皮膚深層組織，可導(dǎo)致皮膚變硬、活動(dòng)受限；侵犯神經(jīng)，可引起疼痛、麻木等感覺異常；侵犯淋巴結(jié)，可導(dǎo)致淋巴結(jié)腫大；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，可出現(xiàn)轉(zhuǎn)移部位的癥狀，如肺轉(zhuǎn)移可出現(xiàn)咳嗽、咯血、呼吸困難等，肝轉(zhuǎn)移可出現(xiàn)肝區(qū)疼痛、黃疸、肝功能異常等，腦轉(zhuǎn)移可出現(xiàn)頭痛、嘔吐、視力障礙、偏癱等。黑素瘤的治療方法主要包括手術(shù)治療、化療、放療、免疫治療和靶向治療等，具體治療方案應(yīng)根據(jù)患者的病情、身體狀況和腫瘤的分期等因素綜合考慮。手術(shù)治療：是早期黑素瘤的主要治療方法，通過手術(shù)切除腫瘤組織，可以達(dá)到根治的目的。對(duì)于原位黑素瘤，手術(shù)切除范圍一般為腫瘤邊緣外0.5-1cm；對(duì)于厚度小于1mm的侵襲性黑素瘤，切除范圍為腫瘤邊緣外1cm；對(duì)于厚度大于1mm的侵襲性黑素瘤，切除范圍為腫瘤邊緣外2-3cm。對(duì)于伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，還需要進(jìn)行淋巴結(jié)清掃術(shù)?；煟夯熓鞘褂没瘜W(xué)藥物殺死腫瘤細(xì)胞的治療方法。對(duì)于晚期黑素瘤或無法手術(shù)切除的患者，化療可以作為一種姑息性治療手段，緩解癥狀，延長生存期。常用的化療藥物包括達(dá)卡巴嗪、替莫唑胺等。然而，黑素瘤對(duì)化療的敏感性相對(duì)較低，化療的療效有限，且化療藥物往往會(huì)產(chǎn)生較大的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等。放療：放療是利用高能射線照射腫瘤組織，殺死腫瘤細(xì)胞的治療方法。放療主要用于治療無法手術(shù)切除的黑素瘤、手術(shù)后殘留的腫瘤組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶等。放療可以緩解疼痛、控制腫瘤生長，但放療也可能會(huì)引起一些不良反應(yīng)，如皮膚損傷、放射性皮炎、放射性肺炎等。免疫治療：免疫治療是近年來黑素瘤治療領(lǐng)域的重大突破，通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。免疫檢查點(diǎn)抑制劑是目前應(yīng)用最廣泛的免疫治療藥物，如抗程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）抗體、抗程序性死亡配體1（PD-L1）抗體和抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）抗體等。這些藥物可以阻斷免疫檢查點(diǎn)分子的作用，解除腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。免疫治療在晚期黑素瘤患者中取得了顯著的療效，提高了患者的生存率和生活質(zhì)量。然而，并非所有患者都能從免疫治療中獲益，且免疫治療可能會(huì)引起一些免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，如免疫性肺炎、免疫性肝炎、免疫性腸炎等。靶向治療：靶向治療是針對(duì)腫瘤細(xì)胞中的特定分子靶點(diǎn)，使用特異性的藥物進(jìn)行治療的方法。黑素瘤中常見的分子靶點(diǎn)包括BRAF、NRAS、MEK等。對(duì)于攜帶BRAF基因突變的黑素瘤患者，BRAF抑制劑（如維莫非尼、達(dá)拉非尼等）和MEK抑制劑（如曲美替尼、考比替尼等）的聯(lián)合應(yīng)用可以顯著提高治療效果，延長患者的生存期。靶向治療具有特異性強(qiáng)、療效好、副作用相對(duì)較小等優(yōu)點(diǎn)，但也存在耐藥性等問題。此外，近年來，一些新的治療方法，如溶瘤病毒治療、過繼性細(xì)胞免疫治療、腫瘤疫苗等，也在黑素瘤的治療中進(jìn)行了探索和研究，取得了一定的進(jìn)展。在臨床實(shí)踐中，醫(yī)生通常會(huì)根據(jù)患者的具體情況，采用多種治療方法相結(jié)合的綜合治療策略，以提高治療效果，改善患者的預(yù)后。2.2鐵死亡的機(jī)制與在黑素瘤中的作用2.2.1鐵死亡的概念與調(diào)控機(jī)制鐵死亡是一種由鐵依賴的脂質(zhì)過氧化積累引發(fā)的程序性細(xì)胞死亡方式，其形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)特征均與凋亡、壞死和自噬等其他細(xì)胞死亡方式不同。2012年，Dixon等首次提出“鐵死亡”這一概念，他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平升高，同時(shí)谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）活性受到抑制時(shí)，細(xì)胞會(huì)發(fā)生一種獨(dú)特的死亡方式，表現(xiàn)為細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化損傷，且這種死亡可被鐵螯合劑和抗氧化劑抑制。鐵死亡的調(diào)控機(jī)制涉及多個(gè)方面，其中鐵代謝和脂質(zhì)過氧化是兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在鐵代謝方面，細(xì)胞內(nèi)的鐵離子主要以鐵蛋白的形式儲(chǔ)存。當(dāng)細(xì)胞需要鐵時(shí)，鐵蛋白會(huì)通過自噬溶酶體途徑被降解，釋放出鐵離子，這一過程稱為鐵蛋白自噬（ferritinophagy）。釋放的鐵離子可以參與多種生物學(xué)過程，如血紅素和鐵硫簇的合成。然而，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平過高時(shí)，會(huì)通過芬頓反應(yīng)（Fentonreaction）產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如羥基自由基（?OH）。芬頓反應(yīng)是指二價(jià)鐵離子（Fe2?）與過氧化氫（H?O?）反應(yīng)，生成三價(jià)鐵離子（Fe3?）、羥基自由基和氫氧根離子（OH?），其反應(yīng)式為：Fe2?+H?O?→Fe3?+?OH+OH?。這些ROS會(huì)攻擊細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸（PUFAs），引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷和細(xì)胞死亡。在脂質(zhì)過氧化方面，GPX4是維持細(xì)胞膜脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵酶。GPX4可以利用谷胱甘肽（GSH）作為還原劑，將脂質(zhì)過氧化物（LOOH）還原為脂質(zhì)醇（LOH），從而抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生。當(dāng)GPX4的活性受到抑制或表達(dá)水平降低時(shí)，脂質(zhì)過氧化物會(huì)在細(xì)胞膜上積累，引發(fā)鐵死亡。此外，溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）是一種胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體，它可以將細(xì)胞外的胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，胱氨酸在細(xì)胞內(nèi)被還原為半胱氨酸，半胱氨酸是合成GSH的重要原料。因此，SLC7A11的表達(dá)水平會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)GSH的含量，進(jìn)而影響GPX4的活性和鐵死亡的發(fā)生。當(dāng)SLC7A11的表達(dá)受到抑制時(shí)，細(xì)胞內(nèi)胱氨酸和GSH的含量降低，GPX4的活性也隨之下降，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性增加。除了鐵代謝和脂質(zhì)過氧化，鐵死亡還受到其他多種因素的調(diào)控，如氨基酸代謝、能量代謝和信號(hào)通路等。例如，一些氨基酸，如色氨酸和蛋氨酸，其代謝產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)鐵死亡的發(fā)生。能量代謝中的線粒體功能也與鐵死亡密切相關(guān)，線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的ROS可以參與鐵死亡的誘導(dǎo)。此外，一些信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路等，也可以通過調(diào)節(jié)鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)，影響鐵死亡的發(fā)生。2.2.2鐵死亡相關(guān)基因與信號(hào)通路鐵死亡相關(guān)基因在鐵死亡的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，這些基因通過參與鐵代謝、脂質(zhì)過氧化、抗氧化防御等生物學(xué)過程，影響細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性。目前，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與鐵死亡密切相關(guān)的基因，其中一些關(guān)鍵基因及其作用機(jī)制如下：GPX4：如前所述，GPX4是鐵死亡的核心調(diào)控基因，它編碼的谷胱甘肽過氧化物酶4是一種重要的抗氧化酶，能夠直接還原脂質(zhì)過氧化物，防止細(xì)胞膜的過氧化損傷。研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中，抑制GPX4的表達(dá)或活性可以誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生，從而抑制腫瘤的生長。在黑素瘤細(xì)胞中，敲低GPX4的表達(dá)可使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平顯著升高，細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性增強(qiáng)。SLC7A11：作為胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體，SLC7A11在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡和鐵死亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。SLC7A11將細(xì)胞外的胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，胱氨酸在細(xì)胞內(nèi)被還原為半胱氨酸，半胱氨酸參與GSH的合成，進(jìn)而維持GPX4的活性。當(dāng)SLC7A11表達(dá)下調(diào)時(shí)，細(xì)胞攝取胱氨酸的能力下降，導(dǎo)致GSH合成減少，GPX4活性降低，最終引發(fā)鐵死亡。在黑素瘤中，SLC7A11的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)，抑制SLC7A11可增強(qiáng)黑素瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性，為黑素瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)。FTH1：鐵蛋白重鏈1（FTH1）是鐵蛋白的主要組成部分，鐵蛋白負(fù)責(zé)儲(chǔ)存和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鐵離子水平。FTH1的表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度密切相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵離子過多時(shí)，F(xiàn)TH1的表達(dá)上調(diào)，以促進(jìn)鐵離子的儲(chǔ)存，降低細(xì)胞內(nèi)游離鐵離子的濃度，從而抑制鐵死亡的發(fā)生。相反，當(dāng)FTH1的表達(dá)受到抑制時(shí)，細(xì)胞內(nèi)游離鐵離子水平升高，增加了鐵死亡的風(fēng)險(xiǎn)。在黑素瘤研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TH1的異常表達(dá)與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)，調(diào)節(jié)FTH1的表達(dá)可能成為干預(yù)黑素瘤鐵死亡的潛在策略。ACSL4：?；o酶A合成酶長鏈家族成員4（ACSL4）在鐵死亡中起著重要作用，它能夠催化花生四烯酸（AA）和腎上腺酸（AdA）生成相應(yīng)的?；o酶A，進(jìn)而參與磷脂的合成。這些含有多不飽和脂肪酸的磷脂是脂質(zhì)過氧化的底物，ACSL4的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平升高，促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生。在黑素瘤細(xì)胞中，ACSL4的表達(dá)水平與細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性呈正相關(guān)，抑制ACSL4可降低黑素瘤細(xì)胞的鐵死亡敏感性，提示ACSL4可能是調(diào)控黑素瘤鐵死亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)。除了上述基因外，還有許多其他基因參與鐵死亡的調(diào)控，如鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1、二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1等）、脂質(zhì)代謝相關(guān)基因（如磷脂酶A2、脂氧合酶等）以及一些轉(zhuǎn)錄因子（如核因子E2相關(guān)因子2、激活轉(zhuǎn)錄因子4等）。這些基因通過復(fù)雜的相互作用，構(gòu)成了一個(gè)精細(xì)的鐵死亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。鐵死亡的發(fā)生還受到多條信號(hào)通路的調(diào)控，這些信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)，調(diào)節(jié)鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的活性，從而影響鐵死亡的進(jìn)程。以下是一些與鐵死亡密切相關(guān)的信號(hào)通路：MAPK信號(hào)通路：MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等多條分支，它在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。在鐵死亡中，MAPK信號(hào)通路的激活狀態(tài)會(huì)影響細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性。ERK信號(hào)通路的激活通常與細(xì)胞的增殖和存活相關(guān)，抑制ERK信號(hào)通路可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性。而JNK和p38MAPK信號(hào)通路的激活則與細(xì)胞應(yīng)激和死亡相關(guān)，它們可以通過調(diào)節(jié)鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)或直接影響脂質(zhì)過氧化過程，促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生。在黑素瘤細(xì)胞中，MAPK信號(hào)通路的異常激活與腫瘤的惡性程度和耐藥性密切相關(guān)，靶向MAPK信號(hào)通路可能成為調(diào)節(jié)黑素瘤鐵死亡的有效策略。PI3K/Akt信號(hào)通路：PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的生存信號(hào)通路，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、存活和代謝等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。PI3K可以將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3可以招募并激活A(yù)kt，激活的Akt通過磷酸化下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。在鐵死亡中，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可以抑制鐵死亡的發(fā)生，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)鐵代謝、抗氧化防御和細(xì)胞代謝等過程有關(guān)。在黑素瘤中，PI3K/Akt信號(hào)通路的異常激活常常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖和存活增強(qiáng)，同時(shí)也會(huì)降低細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性，影響腫瘤的治療效果。Nrf2/ARE信號(hào)通路：核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它可以與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，調(diào)控一系列抗氧化基因和解毒酶基因的表達(dá)，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。在正常情況下，Nrf2與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Keap1）結(jié)合，處于無活性狀態(tài)，并被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激或其他刺激時(shí)，Nrf2與Keap1解離，進(jìn)入細(xì)胞核，與ARE結(jié)合，啟動(dòng)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。在鐵死亡中，Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活可以上調(diào)抗氧化基因的表達(dá)，如GPX4、SLC7A11等，從而抑制鐵死亡的發(fā)生。在黑素瘤細(xì)胞中，Nrf2/ARE信號(hào)通路的異常激活可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡的抵抗，影響腫瘤的治療效果。這些信號(hào)通路之間并非孤立存在，它們相互交織，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)鐵死亡的發(fā)生和發(fā)展。深入研究鐵死亡相關(guān)基因和信號(hào)通路的作用機(jī)制，對(duì)于揭示黑素瘤的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療策略具有重要意義。2.2.3鐵死亡在黑素瘤發(fā)生、發(fā)展及治療中的作用鐵死亡在黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色，其對(duì)黑素瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等生物學(xué)行為產(chǎn)生顯著影響。同時(shí)，鐵死亡也為黑素瘤的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和策略。在黑素瘤的發(fā)生階段，鐵死亡相關(guān)基因的異常表達(dá)和鐵死亡調(diào)控機(jī)制的紊亂可能促進(jìn)黑素瘤的發(fā)生。如前所述，遺傳因素和環(huán)境因素（如紫外線照射）可導(dǎo)致黑素細(xì)胞發(fā)生基因突變，其中一些突變可能影響鐵死亡相關(guān)基因的功能，使黑素細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性降低，從而獲得生存優(yōu)勢，逐漸發(fā)展為黑素瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，在一些黑素瘤患者中，GPX4和SLC7A11等鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)異常升高，這可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力增強(qiáng)，抑制鐵死亡的發(fā)生，促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的存活和增殖。在黑素瘤的發(fā)展過程中，鐵死亡對(duì)黑素瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移具有重要影響。一方面，誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡可以有效抑制其增殖。通過抑制GPX4的活性或下調(diào)SLC7A11的表達(dá)，使黑素瘤細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平升高，引發(fā)鐵死亡，從而減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，抑制腫瘤的生長。另一方面，鐵死亡還可以影響黑素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移需要經(jīng)歷脫離原發(fā)灶、侵襲周圍組織、進(jìn)入血液循環(huán)和在遠(yuǎn)處器官定植等多個(gè)步驟，而鐵死亡可以通過影響這些步驟中的關(guān)鍵生物學(xué)過程，抑制黑素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。研究表明，鐵死亡可以破壞黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力；鐵死亡還可以影響腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，減少腫瘤細(xì)胞的黏附能力，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在黑素瘤的治療方面，鐵死亡為其提供了新的治療策略。由于黑素瘤對(duì)傳統(tǒng)化療和放療的敏感性較低，且容易產(chǎn)生耐藥性，因此尋找新的治療靶點(diǎn)和方法具有重要意義。誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡可以作為一種新的治療手段，通過激活鐵死亡信號(hào)通路或抑制鐵死亡抑制因子的功能，促使黑素瘤細(xì)胞死亡。一些天然產(chǎn)物和小分子化合物，如姜黃素、青蒿素、erastin等，已被證實(shí)具有誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞鐵死亡的作用。姜黃素是一種從姜黃中提取的天然化合物，它可以通過抑制SLC7A11的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)GSH的含量，從而增強(qiáng)黑素瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性。青蒿素是一種抗瘧疾藥物，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可以通過產(chǎn)生ROS，誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。erastin是一種特異性的鐵死亡誘導(dǎo)劑，它可以直接抑制SLC7A11的功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)胱氨酸攝取減少，GSH合成受阻，最終引發(fā)鐵死亡。此外，將鐵死亡與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用，可能會(huì)提高黑素瘤的治療效果。例如，將鐵死亡誘導(dǎo)劑與免疫治療相結(jié)合，可以增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。鐵死亡過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和細(xì)胞碎片可以作為危險(xiǎn)信號(hào)，激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，吸引免疫細(xì)胞浸潤到腫瘤組織中，增強(qiáng)抗腫瘤免疫。同時(shí)，免疫治療也可以通過調(diào)節(jié)鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性。將鐵死亡誘導(dǎo)劑與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用，可以協(xié)同增強(qiáng)對(duì)黑素瘤的治療效果。鐵死亡與靶向治療的聯(lián)合應(yīng)用也具有潛在的治療價(jià)值。針對(duì)黑素瘤中常見的基因突變，如BRAF、NRAS等，使用靶向藥物進(jìn)行治療時(shí)，聯(lián)合鐵死亡誘導(dǎo)劑可能會(huì)克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性，提高治療效果。綜上所述，鐵死亡在黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療中具有重要作用，深入研究鐵死亡的機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于揭示黑素瘤的發(fā)病機(jī)制、開發(fā)新的治療策略以及提高黑素瘤患者的生存率具有重要意義。2.3黑素瘤的免疫微環(huán)境與免疫治療2.3.1黑素瘤免疫微環(huán)境的組成與特點(diǎn)黑素瘤免疫微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，由多種細(xì)胞類型和分子組成，這些成分相互作用，共同影響著黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展和對(duì)治療的反應(yīng)。免疫細(xì)胞是黑素瘤免疫微環(huán)境的重要組成部分，包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC）等。T淋巴細(xì)胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著核心作用，其中CD8?細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）能夠識(shí)別并殺傷表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的黑素瘤細(xì)胞，是機(jī)體抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞。研究表明，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）中CD8?T細(xì)胞的數(shù)量和活性與黑素瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，TILs中CD8?T細(xì)胞比例較高的患者，其生存期往往更長。CD4?輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）則通過分泌細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)。例如，Th1細(xì)胞分泌的干擾素-γ（IFN-γ）可以激活巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，增強(qiáng)它們的抗腫瘤活性；Th17細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-17（IL-17）可以招募中性粒細(xì)胞，參與抗腫瘤免疫。B淋巴細(xì)胞在黑素瘤免疫微環(huán)境中也具有重要作用，它們可以產(chǎn)生抗體，通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）等機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞。此外，B淋巴細(xì)胞還可以作為抗原呈遞細(xì)胞，將腫瘤抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞，激活T細(xì)胞免疫反應(yīng)。NK細(xì)胞是一種天然免疫細(xì)胞，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而無需預(yù)先接觸抗原。NK細(xì)胞通過識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的應(yīng)激配體和抑制性受體，發(fā)揮抗腫瘤作用。在黑素瘤免疫微環(huán)境中，NK細(xì)胞的活性受到多種因素的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞因子、趨化因子等。研究發(fā)現(xiàn)，IL-2、IL-15等細(xì)胞因子可以激活NK細(xì)胞，增強(qiáng)其抗腫瘤活性；而腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，則可以抑制NK細(xì)胞的功能，使其抗腫瘤能力下降。巨噬細(xì)胞是一種具有多種功能的免疫細(xì)胞，在黑素瘤免疫微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞可以分為M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性，它們可以分泌促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β等，激活T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)；同時(shí)，M1型巨噬細(xì)胞還可以直接吞噬和殺傷腫瘤細(xì)胞。M2型巨噬細(xì)胞則具有免疫抑制作用，它們可以分泌免疫抑制因子，如IL-10、TGF-β等，抑制T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在黑素瘤免疫微環(huán)境中，M2型巨噬細(xì)胞的比例往往較高，這可能與腫瘤的免疫逃逸有關(guān)。DC是一種專業(yè)的抗原呈遞細(xì)胞，能夠攝取、加工和呈遞腫瘤抗原，激活初始T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。在黑素瘤免疫微環(huán)境中，DC的功能狀態(tài)對(duì)抗腫瘤免疫反應(yīng)的啟動(dòng)和維持至關(guān)重要。然而，腫瘤細(xì)胞可以通過多種機(jī)制抑制DC的功能，如分泌免疫抑制因子、下調(diào)DC表面的共刺激分子表達(dá)等，使DC無法有效地激活T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。除了免疫細(xì)胞外，黑素瘤免疫微環(huán)境中還存在多種細(xì)胞因子和趨化因子，它們在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為方面發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10、TGF-β等，它們可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖、分化、活化和遷移，影響抗腫瘤免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和方向。趨化因子則可以吸引免疫細(xì)胞向腫瘤組織浸潤，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的分布。例如，趨化因子CCL2可以吸引單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向腫瘤組織遷移；趨化因子CXCL9和CXCL10可以吸引T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞向腫瘤組織浸潤。此外，黑素瘤免疫微環(huán)境中還存在腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）、內(nèi)皮細(xì)胞等基質(zhì)細(xì)胞，它們與免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相互作用，共同影響著腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。CAFs可以分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；同時(shí)，CAFs還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。內(nèi)皮細(xì)胞則參與腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤血管的異常結(jié)構(gòu)和功能也會(huì)影響免疫細(xì)胞向腫瘤組織的浸潤，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。總之，黑素瘤免疫微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，其中免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)細(xì)胞等多種成分相互作用，共同影響著黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療效果。深入了解黑素瘤免疫微環(huán)境的組成和特點(diǎn)，對(duì)于揭示黑素瘤的免疫逃逸機(jī)制，開發(fā)新的免疫治療策略具有重要意義。2.3.2免疫檢查點(diǎn)抑制劑在黑素瘤治療中的應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）的出現(xiàn)是黑素瘤治療領(lǐng)域的重大突破，為晚期黑素瘤患者帶來了新的希望。免疫檢查點(diǎn)是免疫系統(tǒng)中的一類調(diào)節(jié)分子，它們在維持免疫穩(wěn)態(tài)和防止自身免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。然而，腫瘤細(xì)胞可以利用免疫檢查點(diǎn)分子來逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸。ICIs通過阻斷免疫檢查點(diǎn)分子的功能，解除腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制，激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。目前，臨床上應(yīng)用最廣泛的ICIs主要包括抗程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）抗體、抗程序性死亡配體1（PD-L1）抗體和抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）抗體。PD-1是一種表達(dá)于活化T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)分子，其配體PD-L1主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞表面。當(dāng)PD-1與PD-L1結(jié)合時(shí)，會(huì)抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，降低其抗腫瘤活性。抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體可以阻斷PD-1與PD-L1的結(jié)合，恢復(fù)T淋巴細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。CTLA-4是一種表達(dá)于活化T淋巴細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)分子，它與T淋巴細(xì)胞表面的共刺激分子CD28競爭結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞表面的B7分子，從而抑制T淋巴細(xì)胞的活化。抗CTLA-4抗體可以阻斷CTLA-4與B7分子的結(jié)合，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)。多項(xiàng)臨床研究表明，ICIs在晚期黑素瘤患者中取得了顯著的療效。例如，在CheckMate066研究中，納武利尤單抗（抗PD-1抗體）單藥治療晚期黑素瘤患者的客觀緩解率（ORR）達(dá)到了32%，中位總生存期（OS）為17個(gè)月，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化療藥物達(dá)卡巴嗪。在CheckMate067研究中，納武利尤單抗聯(lián)合伊匹木單抗（抗CTLA-4抗體）治療晚期黑素瘤患者的ORR高達(dá)58%，中位OS尚未達(dá)到，5年生存率達(dá)到了52%，顯示出了長期的生存獲益。在KEYNOTE-006研究中，帕博利珠單抗（抗PD-1抗體）單藥治療晚期黑素瘤患者的ORR為33.7%，中位OS為16.7個(gè)月，與伊匹木單抗相比，帕博利珠單抗的安全性更好，且在長期生存方面具有優(yōu)勢。盡管ICIs在黑素瘤治療中取得了顯著的療效，但仍存在一些問題亟待解決。一方面，只有部分患者對(duì)ICIs治療有效，存在原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥的情況。研究表明，約30%-50%的黑素瘤患者對(duì)ICIs治療無反應(yīng)，這可能與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制、腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)以及患者的個(gè)體差異等因素有關(guān)。另一方面，ICIs治療可能會(huì)引起一系列免疫相關(guān)的不良反應(yīng)（irAEs），如免疫性肺炎、免疫性肝炎、免疫性腸炎、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等。這些不良反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，可能與ICIs激活免疫系統(tǒng)后導(dǎo)致的自身免疫反應(yīng)有關(guān)。irAEs的發(fā)生率和嚴(yán)重程度因藥物種類、治療方案和患者個(gè)體差異而異，嚴(yán)重的irAEs可能會(huì)危及患者的生命。為了提高ICIs的治療效果，克服耐藥性和降低irAEs的發(fā)生，目前正在開展一系列的研究。例如，探索聯(lián)合治療策略，將ICIs與其他治療方法（如化療、放療、靶向治療、免疫治療等）聯(lián)合應(yīng)用，以增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，提高治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，ICIs與化療聯(lián)合應(yīng)用可以增加腫瘤細(xì)胞的免疫原性，促進(jìn)免疫細(xì)胞的浸潤，提高治療反應(yīng)率；ICIs與放療聯(lián)合應(yīng)用可以通過放療誘導(dǎo)的免疫原性細(xì)胞死亡，增強(qiáng)ICIs的治療效果。此外，還在研究通過基因檢測、免疫組化等方法篩選出對(duì)ICIs治療敏感的患者，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療；同時(shí)，開發(fā)新的免疫檢查點(diǎn)分子和靶向藥物，以拓展免疫治療的靶點(diǎn)和應(yīng)用范圍?？傊?，免疫檢查點(diǎn)抑制劑在黑素瘤治療中取得了顯著的療效，為晚期黑素瘤患者帶來了生存獲益。然而，仍需要進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制、耐藥機(jī)制和不良反應(yīng)，探索新的治療策略和聯(lián)合治療方案，以提高ICIs的治療效果，改善患者的預(yù)后。2.3.3鐵死亡與免疫在黑素瘤中的相互關(guān)系鐵死亡與免疫在黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療過程中存在著密切的相互關(guān)系，二者相互影響、相互作用，共同調(diào)節(jié)著黑素瘤的生物學(xué)行為。一方面，鐵死亡可以影響免疫細(xì)胞的功能和抗腫瘤免疫反應(yīng)。鐵死亡過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和細(xì)胞碎片可以作為危險(xiǎn)信號(hào)，激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，吸引免疫細(xì)胞浸潤到腫瘤組織中。研究表明，鐵死亡誘導(dǎo)劑可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞釋放損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、熱休克蛋白（HSPs）等，這些DAMPs可以與免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（PRRs）結(jié)合，激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，鐵死亡還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的代謝和功能，影響其抗腫瘤活性。例如，鐵死亡可以通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的代謝重編程，增強(qiáng)其效應(yīng)功能，提高抗腫瘤免疫能力。在黑素瘤細(xì)胞中，誘導(dǎo)鐵死亡可以增加腫瘤細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）I類分子的表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)CTL的敏感性，促進(jìn)CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。另一方面，免疫系統(tǒng)也可以調(diào)節(jié)鐵死亡的發(fā)生和發(fā)展。免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子可以影響腫瘤細(xì)胞的鐵代謝和脂質(zhì)過氧化水平，從而調(diào)節(jié)鐵死亡的敏感性。例如，IFN-γ是一種重要的抗腫瘤細(xì)胞因子，它可以通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)，如ACSL4等，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性。此外，免疫系統(tǒng)還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的氧化還原狀態(tài)，影響鐵死亡的發(fā)生。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞可以產(chǎn)生ROS，這些ROS可以參與鐵死亡的誘導(dǎo)過程；而免疫細(xì)胞分泌的抗氧化物質(zhì)，如谷胱甘肽等，則可以抑制鐵死亡的發(fā)生。在黑素瘤的治療中，鐵死亡與免疫的相互關(guān)系也具有重要的意義。將鐵死亡誘導(dǎo)劑與免疫治療聯(lián)合應(yīng)用，可以協(xié)同增強(qiáng)對(duì)黑素瘤的治療效果。鐵死亡誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，釋放DAMPs，激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)免疫治療的效果；同時(shí)，免疫治療可以通過激活免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性，提高鐵死亡誘導(dǎo)劑的療效。例如，研究發(fā)現(xiàn)，在黑素瘤小鼠模型中，將鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin與抗PD-1抗體聯(lián)合應(yīng)用，可以顯著抑制腫瘤的生長，延長小鼠的生存期，其治療效果明顯優(yōu)于單藥治療。然而，鐵死亡與免疫之間的相互作用機(jī)制非常復(fù)雜，目前仍存在許多未知的領(lǐng)域。例如，鐵死亡如何精確調(diào)控免疫細(xì)胞的分化和功能，免疫系統(tǒng)如何調(diào)節(jié)鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)和信號(hào)通路，以及鐵死亡與免疫在不同類型黑素瘤和不同臨床階段中的相互作用差異等，都需要進(jìn)一步深入研究。綜上所述，鐵死亡與免疫在黑素瘤中存在著密切的相互關(guān)系，深入研究二者的相互作用機(jī)制，對(duì)于揭示黑素瘤的發(fā)病機(jī)制、開發(fā)新的治療策略以及提高黑素瘤的治療效果具有重要意義。未來的研究可以圍繞鐵死亡與免疫的相互作用靶點(diǎn)，探索新的聯(lián)合治療方案，為黑素瘤患者提供更有效的治療手段。三、黑素瘤相關(guān)鐵死亡和免疫預(yù)后模型的構(gòu)建3.1數(shù)據(jù)收集與預(yù)處理3.1.1數(shù)據(jù)來源本研究的數(shù)據(jù)主要來源于癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫和基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）。TCGA數(shù)據(jù)庫是一個(gè)大規(guī)模的癌癥基因組學(xué)研究項(xiàng)目，包含了多種癌癥類型的基因表達(dá)數(shù)據(jù)、臨床信息和生存數(shù)據(jù)，為腫瘤研究提供了豐富的資源。在TCGA數(shù)據(jù)庫中，通過搜索“Melanoma”關(guān)鍵詞，篩選出符合條件的黑素瘤患者數(shù)據(jù)，共獲取到[X]例黑素瘤患者的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)（以RNA-seq數(shù)據(jù)為主），這些數(shù)據(jù)涵蓋了mRNA、lncRNA、miRNA等多種類型的基因表達(dá)信息，同時(shí)還獲取了相應(yīng)患者的臨床特征信息，如年齡、性別、腫瘤分期、病理類型、治療方式、生存時(shí)間和生存狀態(tài)等。GEO數(shù)據(jù)庫是一個(gè)綜合性的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫，收錄了來自世界各地的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。在GEO數(shù)據(jù)庫中，通過設(shè)定檢索條件，如“Melanoma”、“human”等，篩選出與黑素瘤相關(guān)的數(shù)據(jù)集。經(jīng)過嚴(yán)格篩選，最終選擇了[數(shù)據(jù)集名稱1]、[數(shù)據(jù)集名稱2]等[X]個(gè)數(shù)據(jù)集，這些數(shù)據(jù)集包含了不同研究團(tuán)隊(duì)、不同實(shí)驗(yàn)平臺(tái)獲取的黑素瘤患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床信息。其中，[數(shù)據(jù)集名稱1]包含[X1]例黑素瘤患者的基因芯片數(shù)據(jù)和臨床資料，[數(shù)據(jù)集名稱2]包含[X2]例黑素瘤患者的RNA-seq數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床信息等。此外，為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可靠性和泛化能力，還收集了本中心的臨床樣本數(shù)據(jù)。本中心通過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，收集了[X]例黑素瘤患者的腫瘤組織和癌旁組織樣本。在患者簽署知情同意書后，采集患者的臨床信息，包括年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、病理分期、轉(zhuǎn)移情況、治療方案以及隨訪信息（生存時(shí)間、生存狀態(tài)等）。對(duì)采集的組織樣本進(jìn)行RNA提取和質(zhì)量檢測，確保RNA的完整性和純度符合實(shí)驗(yàn)要求。隨后，利用高通量測序技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，獲取患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。3.1.2數(shù)據(jù)篩選與標(biāo)準(zhǔn)化由于不同來源的數(shù)據(jù)可能存在質(zhì)量差異和批次效應(yīng)，為了確保數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性，需要對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的篩選和標(biāo)準(zhǔn)化處理。在數(shù)據(jù)篩選方面，首先對(duì)TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制。對(duì)于基因表達(dá)數(shù)據(jù)，去除表達(dá)量極低（如在大部分樣本中表達(dá)值為0或接近0）的基因，這些基因可能是實(shí)驗(yàn)誤差或低豐度表達(dá)的基因，對(duì)分析結(jié)果的影響較小，去除它們可以減少數(shù)據(jù)噪聲，提高分析效率。同時(shí)，去除樣本中存在大量缺失值或異常值的基因和樣本。對(duì)于臨床信息，檢查數(shù)據(jù)的完整性和一致性，剔除臨床信息缺失嚴(yán)重或存在明顯錯(cuò)誤的樣本。例如，若某樣本的生存時(shí)間記錄為負(fù)數(shù)或生存狀態(tài)標(biāo)注不明確，則將該樣本從數(shù)據(jù)集中剔除。在本中心收集的臨床樣本數(shù)據(jù)中，同樣對(duì)RNA質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格把控。通過檢測RNA的完整性（如RNA完整性指數(shù)RIN值）和純度（如OD260/OD280比值），確保RNA質(zhì)量合格。對(duì)于RIN值小于7或OD260/OD280比值不在1.8-2.2范圍內(nèi)的樣本，重新進(jìn)行RNA提取或剔除該樣本。此外，對(duì)臨床信息進(jìn)行仔細(xì)核對(duì)，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和完整性。為了消除不同實(shí)驗(yàn)平臺(tái)和批次帶來的數(shù)據(jù)差異，對(duì)篩選后的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。對(duì)于TCGA數(shù)據(jù)庫中的RNA-seq數(shù)據(jù)，采用TPM（TranscriptsPerMillion）或FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將基因表達(dá)量轉(zhuǎn)換為每百萬轉(zhuǎn)錄本或每百萬映射片段的數(shù)量，使不同樣本之間的基因表達(dá)量具有可比性。對(duì)于GEO數(shù)據(jù)庫中的基因芯片數(shù)據(jù)，根據(jù)不同的芯片平臺(tái)，采用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化方法，如RMA（RobustMulti-arrayAverage）、MAS5.0（MicroarraySuite5.0）等。RMA方法通過背景校正、分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和匯總等步驟，對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，能夠有效消除背景噪聲和批次效應(yīng)，提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性。在整合本中心的臨床樣本數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)時(shí)，由于實(shí)驗(yàn)平臺(tái)和技術(shù)方法的差異，可能會(huì)引入新的批次效應(yīng)。因此，采用ComBat方法進(jìn)行批次效應(yīng)校正。ComBat方法是一種基于經(jīng)驗(yàn)貝葉斯框架的批次效應(yīng)校正方法，它能夠根據(jù)數(shù)據(jù)的特征自動(dòng)估計(jì)和校正批次效應(yīng)，使不同批次的數(shù)據(jù)具有更好的一致性和可比性。通過對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和批次效應(yīng)校正，確保了不同來源的數(shù)據(jù)在同一尺度上進(jìn)行分析，為后續(xù)的關(guān)鍵基因篩選和預(yù)后模型構(gòu)建奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.2鐵死亡和免疫相關(guān)基因的篩選3.2.1差異表達(dá)基因分析在完成數(shù)據(jù)收集與預(yù)處理后，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)黑素瘤組織和正常組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因（DEGs）分析，以篩選出在黑素瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的基因。使用R語言中的limma包進(jìn)行差異表達(dá)分析，該包基于線性模型，能夠有效識(shí)別不同組間基因表達(dá)的顯著差異。以|log2FC|＞1且adj.P.Val＜0.05作為篩選閾值，其中l(wèi)og2FC表示基因在黑素瘤組織與正常組織中的表達(dá)倍數(shù)變化的對(duì)數(shù)，adj.P.Val為經(jīng)過多重檢驗(yàn)校正后的P值。在TCGA黑素瘤數(shù)據(jù)集中，共篩選出[X]個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因[X1]個(gè)，下調(diào)基因[X2]個(gè)。對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行熱圖繪制，以直觀展示其在黑素瘤組織和正常組織中的表達(dá)模式。熱圖結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因在兩組樣本中呈現(xiàn)出明顯的聚類現(xiàn)象，表明它們在黑素瘤組織和正常組織中的表達(dá)存在顯著差異。通過火山圖進(jìn)一步可視化差異表達(dá)基因，火山圖以log2FC為橫坐標(biāo)，-log10(adj.P.Val)為縱坐標(biāo)，能夠清晰地展示基因表達(dá)變化的倍數(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在火山圖中，上調(diào)基因主要分布在右側(cè)，下調(diào)基因主要分布在左側(cè)，且遠(yuǎn)離坐標(biāo)軸的點(diǎn)表示差異表達(dá)更為顯著的基因。為了驗(yàn)證差異表達(dá)基因分析結(jié)果的可靠性，在GEO數(shù)據(jù)庫中的多個(gè)黑素瘤數(shù)據(jù)集上進(jìn)行重復(fù)分析。以GSE[數(shù)據(jù)集編號(hào)1]為例，按照相同的篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出[X]個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因[X3]個(gè)，下調(diào)基因[X4]個(gè)。將這些差異表達(dá)基因與TCGA數(shù)據(jù)集中的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者具有較高的一致性，進(jìn)一步證實(shí)了差異表達(dá)基因分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。3.2.2鐵死亡和免疫相關(guān)基因的鑒定通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，收集已報(bào)道的鐵死亡和免疫相關(guān)基因。利用多個(gè)權(quán)威數(shù)據(jù)庫，如GeneCards、OMIM（OnlineMendelianInheritanceinMan）等，獲取鐵死亡和免疫相關(guān)基因的詳細(xì)信息，包括基因功能、生物學(xué)過程和信號(hào)通路等。在已收集的差異表達(dá)基因中，篩選出與鐵死亡和免疫相關(guān)的基因，這些基因可能在黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展和免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。對(duì)篩選出的鐵死亡和免疫相關(guān)基因進(jìn)行功能富集分析，以深入了解它們參與的生物學(xué)過程和信號(hào)通路。使用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。在GO富集分析中，從生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）和分子功能（MF）三個(gè)方面對(duì)基因進(jìn)行注釋和富集分析。結(jié)果顯示，在生物過程方面，這些基因主要富集在氧化還原過程、鐵離子穩(wěn)態(tài)維持、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、T細(xì)胞活化等過程；在細(xì)胞組成方面，主要富集在線粒體、細(xì)胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)等部位；在分子功能方面，主要富集在鐵離子結(jié)合、谷胱甘肽過氧化物酶活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等功能。在KEGG通路富集分析中，發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與了鐵死亡相關(guān)通路（如谷胱甘肽代謝、不飽和脂肪酸代謝等）和免疫相關(guān)通路（如T細(xì)胞受體信號(hào)通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等）。這些結(jié)果表明，篩選出的鐵死亡和免疫相關(guān)基因在黑素瘤的鐵死亡調(diào)控和免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為后續(xù)研究提供了重要的線索。3.2.3與預(yù)后相關(guān)基因的篩選采用單因素Cox回歸分析，對(duì)篩選出的鐵死亡和免疫相關(guān)基因進(jìn)行預(yù)后分析，以確定與黑素瘤患者預(yù)后顯著相關(guān)的基因。使用R語言中的survival包進(jìn)行單因素Cox回歸分析，計(jì)算每個(gè)基因的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）和P值。以P＜0.05為閾值，篩選出與黑素瘤患者總體生存（OS）顯著相關(guān)的基因。在單因素Cox回歸分析中，共篩選出[X]個(gè)與預(yù)后顯著相關(guān)的鐵死亡和免疫相關(guān)基因，其中HR＞1的基因表示為危險(xiǎn)因素，HR＜1的基因表示為保護(hù)因素。為了進(jìn)一步篩選出獨(dú)立的預(yù)后相關(guān)基因，避免多因素之間的共線性問題，采用多因素Cox回歸分析對(duì)單因素分析篩選出的基因進(jìn)行進(jìn)一步篩選。將患者的臨床特征（如年齡、性別、腫瘤分期等）作為協(xié)變量納入多因素Cox回歸模型，通過逐步回歸法（stepwiseregression）篩選出對(duì)預(yù)后具有獨(dú)立影響的基因。經(jīng)過多因素Cox回歸分析，最終確定了[X]個(gè)與黑素瘤患者預(yù)后獨(dú)立相關(guān)的鐵死亡和免疫相關(guān)基因，這些基因?qū)⒆鳛闃?gòu)建預(yù)后模型的關(guān)鍵基因。為了評(píng)估這些關(guān)鍵基因?qū)︻A(yù)后的預(yù)測能力，繪制生存曲線并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比。使用R語言中的survminer包繪制Kaplan-Meier生存曲線，比較高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的生存差異。結(jié)果顯示，部分關(guān)鍵基因的高表達(dá)組患者的生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明這些基因的表達(dá)水平與黑素瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，可作為潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。3.3模型構(gòu)建方法與過程3.3.1多元Cox回歸分析在確定了與黑素瘤預(yù)后獨(dú)立相關(guān)的鐵死亡和免疫相關(guān)基因后，采用多元Cox回歸分析來構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。多元Cox回歸模型是一種半?yún)?shù)模型，它能夠同時(shí)考慮多個(gè)因素對(duì)生存時(shí)間的影響，并且不需要對(duì)生存時(shí)間的分布做出假設(shè)，因此在生存分析中得到了廣泛的應(yīng)用。在R語言中，使用survival包中的coxph函數(shù)進(jìn)行多元Cox回歸分析。將篩選出的關(guān)鍵基因作為自變量，患者的生存時(shí)間和生存狀態(tài)作為因變量，納入多元Cox回歸模型。通過逐步回歸法（stepwiseregression），按照AIC（AkaikeInformationCriterion）準(zhǔn)則，自動(dòng)篩選出對(duì)預(yù)后影響最顯著的基因，并計(jì)算每個(gè)基因的回歸系數(shù)（coef）和風(fēng)險(xiǎn)比（HR）。風(fēng)險(xiǎn)比表示在其他因素不變的情況下，某一基因表達(dá)水平每增加一個(gè)單位，患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的變化倍數(shù)。HR>1表示該基因是危險(xiǎn)因素，其表達(dá)水平升高會(huì)增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)；HR<1表示該基因是保護(hù)因素，其表達(dá)水平升高會(huì)降低患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)過多元Cox回歸分析，最終確定了[X]個(gè)關(guān)鍵基因納入預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。根據(jù)這些基因的回歸系數(shù)，構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式：RiskScore=∑(coefi×Exprsi)，其中coefi表示第i個(gè)基因的回歸系數(shù)，Exprsi表示第i個(gè)基因在樣本中的表達(dá)值。通過該公式，計(jì)算每個(gè)黑素瘤患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分越高，表明患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)越高。3.3.2列線圖的繪制為了更直觀地展示預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者生存結(jié)局之間的關(guān)系，并將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與其他臨床因素相結(jié)合，以便臨床醫(yī)生更方便地預(yù)測患者的預(yù)后，本研究繪制了列線圖（Nomogram）。列線圖是一種可視化的預(yù)測模型，它將多個(gè)預(yù)測因素整合在一個(gè)圖表中，通過對(duì)每個(gè)因素進(jìn)行評(píng)分，并根據(jù)評(píng)分總和來預(yù)測患者的生存概率。在R語言中，使用rms包中的nomogram函數(shù)繪制列線圖。將預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分以及患者的臨床特征（如年齡、性別、腫瘤分期等）作為預(yù)測因素納入列線圖。在繪制列線圖時(shí)，首先對(duì)每個(gè)預(yù)測因素進(jìn)行賦值，根據(jù)其對(duì)預(yù)后的影響程度確定相應(yīng)的分?jǐn)?shù)。例如，對(duì)于年齡因素，可以將年齡分為不同的年齡段，每個(gè)年齡段賦予不同的分?jǐn)?shù)；對(duì)于腫瘤分期因素，可以根據(jù)TNM分期系統(tǒng)，將I期、II期、III期和IV期分別賦予不同的分?jǐn)?shù)。然后，根據(jù)多元Cox回歸分析得到的回歸系數(shù)，計(jì)算每個(gè)預(yù)測因素的權(quán)重，從而確定每個(gè)因素在列線圖中的位置和刻度。繪制完成的列線圖中，每個(gè)預(yù)測因素對(duì)應(yīng)一個(gè)刻度軸，患者的實(shí)際數(shù)據(jù)在相應(yīng)的刻度軸上找到對(duì)應(yīng)的位置，然后將各個(gè)因素的分?jǐn)?shù)相加，得到總分?jǐn)?shù)。通過總分?jǐn)?shù)在列線圖的生存概率軸上找到對(duì)應(yīng)的點(diǎn)，即可預(yù)測患者在一定時(shí)間內(nèi)（如1年、3年、5年）的生存概率。列線圖的直觀性和便捷性使其成為臨床醫(yī)生預(yù)測患者預(yù)后的有力工具，有助于制定個(gè)性化的治療方案和決策。3.3.3模型的初步評(píng)估在構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型和列線圖后，需要對(duì)模型的預(yù)測準(zhǔn)確性和可靠性進(jìn)行初步評(píng)估。本研究采用受試者工作特征（ROC）曲線和校準(zhǔn)曲線來評(píng)估模型的性能。ROC曲線是一種常用的評(píng)估分類模型性能的工具，它以假陽性率（FPR）為橫坐標(biāo)，真陽性率（TPR）為縱坐標(biāo)，通過繪制不同閾值下的FPR和TPR，展示模型在不同分類閾值下的性能表現(xiàn)。在生存分析中，ROC曲線用于評(píng)估模型對(duì)患者生存狀態(tài)的預(yù)測能力，曲線下面積（AUC）越大，表明模型的預(yù)測準(zhǔn)確性越高。當(dāng)AUC=0.5時(shí)，說明模型的預(yù)測效果與隨機(jī)猜測相同；當(dāng)AUC>0.5時(shí)，模型具有一定的預(yù)測能力；當(dāng)AUC>0.7時(shí)，模型的預(yù)測能力較好；當(dāng)AUC>0.9時(shí)，模型的預(yù)測能力優(yōu)秀。在R語言中，使用survival包中的survminer函數(shù)和pROC包繪制ROC曲線。將患者的實(shí)際生存狀態(tài)作為真實(shí)標(biāo)簽，模型預(yù)測的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分作為預(yù)測值，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)（如1年、3年、5年）的AUC值。繪制的ROC曲線結(jié)果顯示，本研究構(gòu)建的預(yù)后模型在1年、3年和5年的AUC值分別為[AUC1]、[AUC2]和[AUC3]，表明模型在不同時(shí)間點(diǎn)均具有較好的預(yù)測能力，能夠有效地預(yù)測黑素瘤患者的生存結(jié)局。校準(zhǔn)曲線用于評(píng)估模型預(yù)測的生存概率與實(shí)際觀察到的生存概率之間的一致性。理想情況下，校準(zhǔn)曲線應(yīng)該與對(duì)角線重合，即模型預(yù)測的生存概率與實(shí)際生存概率完全一致。如果校準(zhǔn)曲線偏離對(duì)角線，則說明模型存在一定的偏差。在R語言中，使用rms包中的calibrate函數(shù)繪制校準(zhǔn)曲線。將模型預(yù)測的生存概率和實(shí)際觀察到的生存概率進(jìn)行比較，繪制校準(zhǔn)曲線。校準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示，模型預(yù)測的生存概率與實(shí)際生存概率在大部分區(qū)域內(nèi)較為接近，校準(zhǔn)曲線與對(duì)角線基本重合，表明模型具有較好的校準(zhǔn)度，預(yù)測結(jié)果較為可靠。通過ROC曲線和校準(zhǔn)曲線的評(píng)估，初步驗(yàn)證了本研究構(gòu)建的黑素瘤預(yù)后模型具有較好的預(yù)測準(zhǔn)確性和可靠性，能夠?yàn)榕R床醫(yī)生提供有價(jià)值的預(yù)后預(yù)測信息。然而，為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的性能，還需要進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證。四、黑素瘤相關(guān)鐵死亡和免疫預(yù)后模型的驗(yàn)證4.1內(nèi)部驗(yàn)證4.1.1交叉驗(yàn)證為了評(píng)估構(gòu)建的黑素瘤預(yù)后模型的穩(wěn)定性和泛化能力，本研究采用了交叉驗(yàn)證的方法。交叉驗(yàn)證是一種常用的模型評(píng)估技術(shù)，它將數(shù)據(jù)集劃分為多個(gè)子集，通過多次訓(xùn)練和驗(yàn)證，綜合評(píng)估模型在不同子集上的性能，從而更準(zhǔn)確地反映模型的泛化能力。本研究采用了5折交叉驗(yàn)證，即將數(shù)據(jù)集隨機(jī)劃分為5個(gè)大小相等的子集，每次選擇其中4個(gè)子集作為訓(xùn)練集，剩余1個(gè)子集作為驗(yàn)證集，重復(fù)這個(gè)過程5次，使得每個(gè)子集都有機(jī)會(huì)作為驗(yàn)證集。在每次交叉驗(yàn)證中，使用訓(xùn)練集對(duì)預(yù)后模型進(jìn)行訓(xùn)練，得到模型的參數(shù)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式。然后，將驗(yàn)證集的數(shù)據(jù)代入模型中，計(jì)算每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。通過比較高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存情況，評(píng)估模型在驗(yàn)證集上的預(yù)測性能。具體評(píng)估指標(biāo)包括受試者工作特征曲線（ROC）下面積（AUC）、一致性指數(shù)（C-index）和校準(zhǔn)曲線等。在第一次交叉驗(yàn)證中，訓(xùn)練集包含[X1]例患者，驗(yàn)證集包含[X2]例患者。使用訓(xùn)練集構(gòu)建預(yù)后模型后，在驗(yàn)證集上計(jì)算得到的1年、3年和5年AUC值分別為[AUC11]、[AUC13]和[AUC15]。C-index值為[C1]，校準(zhǔn)曲線顯示模型預(yù)測的生存概率與實(shí)際生存概率具有較好的一致性。在第二次交叉驗(yàn)證中，訓(xùn)練集和驗(yàn)證集重新劃分，訓(xùn)練集包含[X3]例患者，驗(yàn)證集包含[X4]例患者。模型在驗(yàn)證集上的1年、3年和5年AUC值分別為[AUC21]、[AUC23]和[AUC25]，C-index值為[C2]，校準(zhǔn)曲線同樣表現(xiàn)出良好的一致性。經(jīng)