3.1重組DNA技術(shù)的基本工具課件高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

基因工程發(fā)展歷程1944年艾弗里等人通過(guò)肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，不僅證明了遺傳物質(zhì)是DNA，還證明了DNA可以在同種生物個(gè)體間轉(zhuǎn)移。1961年尼倫伯格和馬太破譯了第一個(gè)編碼氨基酸的密碼子。截至19666年，64個(gè)密碼子均被破譯成功。1970年科學(xué)家在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶（簡(jiǎn)稱限制酶）1972年，伯格首先在體外進(jìn)行了DNA的改造，成功構(gòu)建了第一個(gè)體外重組DNA分子。1982年，第一個(gè)基因工程藥物-重組人胰島素被批準(zhǔn)上市?；蚬こ趟幬锍蔀槭澜绺鲊?guó)研究和投資開發(fā)的熱點(diǎn)。1953年沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型并提出了遺傳物質(zhì)自我復(fù)制的假說(shuō)。1967年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌擬核DNA之外的質(zhì)粒有自我復(fù)制能力，并可以在細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。20世紀(jì)70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶被相繼發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。1973年，科學(xué)家證明了質(zhì)?？梢宰鳛榛蚬こ痰妮d體，構(gòu)建重組DNA，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使外源基因在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)了物種間的基因交流。至此，基因工程正式問世。1985年，穆里斯等人發(fā)明PCR,為獲取目的基因提供了有效手段。

我國(guó)是棉花的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，以新疆棉最為著名。在棉花種植過(guò)程中，常常會(huì)受到棉鈴蟲的侵襲，這會(huì)使棉花大量減產(chǎn)。

蘇云金桿菌雜交育種？同種生物之間進(jìn)行誘變育種？不定向思考：能否培育出自身就能抵抗蟲害的棉花呢?蘇云金桿菌有一種抗蟲基因（Bt毒蛋白基因），它能通過(guò)編碼產(chǎn)生抗蟲蛋白來(lái)殺死棉鈴蟲。大量施用農(nóng)藥不僅提高了生產(chǎn)成本，還可能造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境的污染?；蚬こ痰?章

基因工程按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品，從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做重組DNA技術(shù)?；颍ň哂羞z傳效應(yīng)的DNA片段）DNA分子水平賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品基因重組定向改造生物遺傳特性；徹底打破種間界限操作對(duì)象：操作水平：結(jié)果：意義：原理：

有性生殖中的基因重組是隨機(jī)的，并且只能在同一物種間進(jìn)行重組！

我國(guó)是棉花的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，以新疆棉最為著名。在棉花種植過(guò)程中，常常會(huì)受到棉鈴蟲的侵襲，這會(huì)使棉花大量減產(chǎn)。大量施用農(nóng)藥不僅提高了生產(chǎn)成本，還可能造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境的污染。蘇云金桿菌有一種抗蟲基因（Bt毒蛋白基因），它能通過(guò)編碼產(chǎn)生抗蟲蛋白來(lái)殺死棉鈴蟲。DNA雙螺旋的直徑只有2nm?？茖W(xué)家用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？準(zhǔn)確切割DNA分子將DNA片段連接起來(lái)將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞本節(jié)聚焦:1、重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具是什么？它們的作用分別是什么？2、基因工程載體需要具備什么條件？3.1重組DNA技術(shù)的基本工具DNA的基本單位：脫氧核苷酸A腺嘌呤G鳥嘌呤C胞嘧啶T胸腺嘧啶OPCH2

OHOOHHOHHHHH堿基

磷酸

脫氧核糖DNA的結(jié)構(gòu)CTTGACAG5’5’3’3’（1）由

條單鏈按_________方式盤旋成_______結(jié)構(gòu)反向平行雙螺旋23',5'-磷酸二酯鍵CH2

HOHHHHH堿基

磷酸

5’4’3’2’1’DNA的結(jié)構(gòu)ATATTAGGGCCATC脫氧核糖和堿基交替連接，構(gòu)成基本骨架(2)外側(cè)：堿基內(nèi)側(cè):(3)

兩條鏈上的堿基通過(guò)氫鍵連接形成堿基對(duì)，且A只和T配對(duì)、G只和C配對(duì)，堿基之間的一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，就叫作堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。氫鍵堿基對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)一、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）——“分子手術(shù)刀”

1、來(lái)源：主要從原核生物中分離純化出來(lái)，也有少部分來(lái)自真核生物2、種類：數(shù)千種（限制酶不是一種酶，而是一類酶）生物屬名的頭一個(gè)字母與種加詞的頭兩個(gè)字母，組成了3個(gè)字母的略語(yǔ)，以此來(lái)表示這個(gè)酶是從哪種生物中分離出來(lái)的。例如，一種限制酶是從大腸桿菌（

Escherichiacoli）的R型菌株分離來(lái)的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來(lái)的第一種限制酶，則進(jìn)一步表示成EcoR

I。粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）中分離的第一種限制酶即_______；Sma

Ⅰ流感嗜血桿菌的d菌株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:____________________________。Hind

Ⅰ、Hind

Ⅱ、Hind

Ⅲ一、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）——“分子手術(shù)刀”※命名（P72資料卡）

一、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）——“分子手術(shù)刀”實(shí)例1——EcoRI

限制酶AGTCATTCGATAG

5'5'GAT

3'CATC3'ATAT

大腸桿菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能特異性識(shí)別_________序列，并切割___和___之間的____________。切割后產(chǎn)生__________。GAATTCGA磷酸二酯鍵黏性末端限制酶DNA兩條單鏈的切口處，伸出幾個(gè)核苷酸，剛好能互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。實(shí)例2——SmaI限制酶一、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）——“分子手術(shù)刀”CCCGGGGGGCCCG3'GGC5'CCCC5’CGGG3'SmaI限制酶只能識(shí)別

序列，切割

和

之間的

切開，切割后產(chǎn)生

。CCCGGGCG磷酸二酯鍵平末端SmaI

識(shí)別序列：大多數(shù)由6個(gè)核苷酸組成；少數(shù)由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量組成。1.都可以找到一條中（心）軸線；特點(diǎn)：2.識(shí)別序列中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。一、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）——“分子手術(shù)刀”一、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）——“分子手術(shù)刀”

1、來(lái)源：主要從原核生物中分離純化出來(lái)，也有少部分來(lái)自真核生物2、種類：數(shù)千種（限制酶不是一種酶，而是一類酶）3、特點(diǎn):能夠識(shí)別

的特定脫氧核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的

斷開。雙鏈DNA分子磷酸二酯鍵4、結(jié)果產(chǎn)生黏性末端或平末端1.寫出下列限制酶切割形成的末端序列BamHⅠ

EcoRⅠ__________________________

Hind

Ⅲ

BglⅡ_________________________-A-TTCGA-A-TCTAGAGCTT-A-

GATCT-A-（1）同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同？（2）不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同？（3）哪種限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段能與BamHⅠ切割產(chǎn)生的DNA片段相連接？為什么？（4）上述片段連接完成后，該重組DNA分子的新連接處能否再被所用的限制酶識(shí)別？相同。可能相同5'3'5'3'5'3'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'-G-CCTAG-G-CTTAAorGATCC-G-orAATTC-G-oror學(xué)習(xí)評(píng)價(jià)一2.請(qǐng)判斷：以下黏性末端是由

種限制酶作用產(chǎn)生的。33、請(qǐng)結(jié)合圖示，推斷限制酶切割一次可斷開幾個(gè)磷酸二酯鍵？產(chǎn)生多少個(gè)游離的磷酸基團(tuán)？產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？消耗幾分子水？T

T

A

AGCT

T

A

ACGA

A

T

TGC推斷限制酶切一次：斷開

個(gè)磷酸二酯鍵，產(chǎn)生

個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，產(chǎn)生

個(gè)黏性/平末端，消耗

分子水。兩22兩--ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA……TCCCTAAGAATTCCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---Bt蛋白基因3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’Bt蛋白基因5’3’3’5’EcoRⅠ識(shí)別5'-GAATTC-3'序列，并在G與A之間切割。蘇云金芽孢桿菌DNA片段中的部分基因4、要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)末端？P71思考：你能根據(jù)所掌握的知識(shí)，推測(cè)限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制。限制酶就是它的一種防御性工具。當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，它會(huì)利用限制酶來(lái)切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。細(xì)菌細(xì)菌細(xì)菌限制酶思維拓展P74拓展：為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA?1、通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。2、通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌DNA分子中不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列思維拓展GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG用同種限制酶切割(EcoRⅠ)把兩種來(lái)源不同的DNA進(jìn)行重組，應(yīng)該怎樣處理？

缺口怎么辦？G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G1.作用：將兩個(gè)

連接起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的

。二、DNA連接酶——“分子縫合針”注意：不是連接氫鍵?。滏I的形成不需要酶的催化）DNA片段

磷酸二酯鍵兩DNA片段要具有相同的(互補(bǔ)的)黏性末端才能拼起來(lái)連接黏性末端二、DNA連接酶——“分子縫合針”連接平末端二、DNA連接酶——“分子縫合針”1.作用：將兩個(gè)

連接起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的

。二、DNA連接酶——“分子縫合針”注意：不是連接氫鍵！（氫鍵的形成不需要酶的催化）E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源連接的末端類型相同點(diǎn)大腸桿菌T4噬菌體黏性末端和平末端（連接平末端效率遠(yuǎn)低于T4DNA連接酶）黏性末端和平末端2.種類：恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵DNA片段

磷酸二酯鍵AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶將脫氧核苷酸（底物）連接到單鏈末端DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對(duì)象作用結(jié)果都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵1、DNA連接酶與DNA聚合酶的比較只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵學(xué)習(xí)評(píng)價(jià)二2、與DNA相關(guān)的五種酶的比較名稱作用部位作用結(jié)果限制酶DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯鍵將DNA切成兩個(gè)片段磷酸二酯鍵將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子磷酸二酯鍵將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸堿基對(duì)之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長(zhǎng)鏈學(xué)習(xí)評(píng)價(jià)一我們每天吃很多動(dòng)植物食材，也攝入了它們的DNA，但是我們并沒有因此就被這些DNA操控。這是因?yàn)橥庠碊NA片段難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即使進(jìn)入也很難穩(wěn)定存在并表達(dá)。如何將目的基因運(yùn)送到特定細(xì)胞呢？思考：1.載體的種類？2.載體應(yīng)該具備哪些特點(diǎn)？“分子運(yùn)輸車”---載體將外源基因送入受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。1.作用：三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”來(lái)源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別。2.種類：質(zhì)粒（最常用）動(dòng)植物病毒噬菌體

質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。3、運(yùn)載體需具備的條件條件②：能在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制條件①：有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA片段（基因）插入條件③：常有特殊的標(biāo)記基因三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”【問題1】載體要與外源基因連接，需要具備什么條件？【問題2】要使攜帶的外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，載體需要具備什么條件？【問題3】我們用肉眼看不到載體是否進(jìn)入受體細(xì)胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件？標(biāo)記基因?qū)χ亟MDNA的鑒定和選擇原理

載體上的標(biāo)記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細(xì)胞沒有抵抗該抗生素的能力。在含有該抗生素(如氨芐青霉素)的培養(yǎng)基上，能夠生存的是

。這是因?yàn)開___________________________________________________________________________________________________________。被導(dǎo)入了載體的受體細(xì)胞含有某抗生素抗性基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，受體細(xì)胞對(duì)該抗生素產(chǎn)生抗性存活。思維拓展

根據(jù)標(biāo)記基因的作用，有同學(xué)認(rèn)為在含有某種抗生素的培養(yǎng)基中篩選存活的受體細(xì)胞不一定是導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞，這種說(shuō)法是否合理？并說(shuō)明理由。合理；因?yàn)閮H導(dǎo)入載體的和導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞均能在該培養(yǎng)基中存活。思維拓展目的基因是要與運(yùn)載體結(jié)合的，那如何處理質(zhì)粒？1、選目的基因兩端和運(yùn)載體有相同的黏性末端；選擇酶切位點(diǎn)的原則：2、所選酶切位點(diǎn)不能破壞目的基因以及標(biāo)記基因。

例：

圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。（1）上述操作中不宜選用SmaI，原因是________________________________________。（2）在基因工程的操作中，不宜只選用EcoRI，原因是_____________________________________________________________________。SmaI會(huì)破壞目的基因和抗性基因

用EcoRI切割，目的基因只有一側(cè)含有黏性末端，不能插入到質(zhì)粒中學(xué)習(xí)評(píng)價(jià)例：選用下圖載體將目的基因?qū)爰?xì)菌中并將含有目的基因的細(xì)菌篩選出來(lái)。（1）在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中添加抗生素B，則應(yīng)該選擇的限制酶___________切割質(zhì)粒插入目的基因。（2）在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中添加抗生素A，則應(yīng)該選擇的限制酶為___________切割質(zhì)粒插入目的基因。①或②①三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”在基因工程操作中，天然的載體很難滿足上述全部要求，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的。大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖

若用家蠶作為某基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，

在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，

不選用噬菌體作為載體，其原因是什么？噬菌體的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，不能侵染家蠶細(xì)胞，無(wú)法將目的基因?qū)爰倚Q體細(xì)胞中并使其表達(dá)；而昆蟲病毒可以特異性地侵染昆蟲細(xì)胞，能將目的基因?qū)爰倚Q細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)。思維拓展…TATCGTACGATAGGTACTTAA…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…GGTATG…重組DNA分子的模擬操作思考討論重組DNA分子的模擬操作思考討論1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對(duì)?如果不能，可能是什么

原因造成的？

如果制作的黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對(duì)，可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對(duì)，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能稱得上一個(gè)基因嗎？不能。因?yàn)榛虻拈L(zhǎng)度一般在100個(gè)堿基對(duì)以上。限制酶DNA連接酶載體①能自我復(fù)制或能整合到宿主DNA上②有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)③有特殊的標(biāo)記基因④對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒基因工程的基本工具作為載體的條件種類:磷酸二酯鍵來(lái)源：主要來(lái)源于原核生物特點(diǎn)：作用部位：具有專一性結(jié)果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵種類：

E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來(lái)課堂小結(jié)1.為什么不同生物的DNA分子能拼接起來(lái)？2.為什么一種生物的基因可以在另一種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)？①DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸；②都遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則；③雙鏈DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。①基因是控制生物性狀的獨(dú)立遺傳單位；②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則；③生物界共用一套遺傳密碼。思考討論基因工程誕生的理論基礎(chǔ)探究.實(shí)踐---DNA的粗提取與鑒定一、實(shí)驗(yàn)原理可以利用DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)在理化性質(zhì)方面的差異，對(duì)它們進(jìn)行提取DNA不溶于酒精，某些蛋白質(zhì)溶于酒精DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，可溶于2mol/L的NaCl溶液2.在一定的溫度下（沸水浴），DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色，因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑【自主學(xué)習(xí)】閱讀課本74和75頁(yè)的探究實(shí)踐“DNA的粗提取與鑒定”，明確該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)原理及步驟。二、

材料用具DNA含量相對(duì)較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。1.選材：2.試劑：①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——溶解并提取DNA——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用研磨液成分作用SDS裂解細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性EDTA抑制DNA酶Tris