《植物組織培養(yǎng)》課件 項目3 無菌操作技術(shù)

項目三

無菌操作技術(shù)任務(wù)三外植體的選擇與處理任務(wù)二無菌操作技術(shù)任務(wù)一虛擬無菌操作任務(wù)二無菌操作技術(shù)知識目標理解有菌和無菌的范疇；掌握常用的滅菌方法；掌握無菌操作過程。

123掌握組織培養(yǎng)相關(guān)的滅菌方法；熟練掌握無菌操作技術(shù)；12

滅菌和接種

任務(wù)講解滅菌和接種一、滅菌二、無菌操作三、接種第一節(jié)滅菌和接種

滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學(xué)者首先要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。無菌室等未經(jīng)處理的地方、超凈臺表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。滅菌和接種第一節(jié)滅菌和接種

這里所指的菌，包括細菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。茵的特點是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時不有，無孔不人。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡單，繁殖力極強，條件適宜時便可大量滋生。滅菌和接種第一節(jié)滅菌和接種

無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體(當然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的)，高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強酸強堿，化學(xué)元素滅菌劑等表面和內(nèi)部等等都是無菌的。滅菌和接種第一節(jié)滅菌和接種消毒：殺死、消除或抑制部分微生物，使之不發(fā)生作用。滅菌：用物理或化學(xué)方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)一切微生物或生物體，即所有生命的物質(zhì)全部殺死。滅菌和消毒的區(qū)別是什么？一、滅菌滅菌和接種滅菌概念1.培養(yǎng)基滅菌◆高壓濕熱滅菌◆某些激素、維生素采用過濾滅菌視頻3-1培養(yǎng)基滅菌自動高壓濕熱滅菌鍋1電源水位指示燈溫度、壓力顯示窗溫度壓力設(shè)置鈕壓力表放汽閥滅菌鍋1臥式滅菌鍋2臥式滅菌鍋2臥式滅菌鍋結(jié)構(gòu)

過濾滅菌濾膜?0.45um以下1.過濾器先滅菌，滅菌溫度不超過121℃。2.溶液先進行初濾(濾膜?0.65um)過濾滅菌

培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必需的最少時間容器體積(mL)121℃滅菌所需最少時間(min)20-501575-15020250-50025100030高壓蒸汽滅菌2.玻璃器皿滅菌◆干熱滅菌：160-180℃,1.5-2.0h◆濕熱滅菌：121℃,20-40min◆接種前用酒精棉球擦試，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌。3.接種工具滅菌◆用前干熱滅菌：160～180℃,1.5～2.0h◆用前濕熱滅菌：121℃,20～30min◆接種前用酒精棉球擦試，浸入95%酒精液中，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌?！魸駸釡缇?21℃，20～30min◆實驗服滅菌后置于緩沖間或密封好。4.實驗服、口罩、濾紙滅菌4.實驗服、口罩、濾紙滅菌5.接種室滅菌紫外燈照射(接種室、超凈臺、接種箱)：波長260nm，距離小于1.2m，15～20min。臭氧滅菌機：1～2h熏蒸滅菌：2ml/m3甲醛+0.2g/m3

高錳酸鉀；冰醋酸；1～3%高錳酸鉀或3%來蘇兒。

接種臺噴霧消毒：75%酒精。

◆用化學(xué)滅菌劑消毒◆常用化學(xué)滅菌劑6.接種材料滅菌視頻3-2

接種材料滅菌水洗莖尖選取酒精滅菌氯化汞滅菌無菌水沖洗接種滅菌圖示常用滅菌劑的使用濃度與效果比較滅菌劑使用濃度持續(xù)時間去除難易效果次氯酸鈣9-10%5-30min易很好次氯酸鈉2%5-30min易很好氯化汞0.1-1%5-8min較難最好抗菌素4-50mg/L30-60min中較好滅菌劑的使用濃度與效果8.培養(yǎng)室滅菌新建培養(yǎng)室用前一定要徹底熏蒸1次；隔2-5天用洗衣粉水或來蘇水拖地1次，用高錳酸鉀擦架1次。

熏蒸滅菌：

2ml/m3甲醛+0.2g/m3

高錳酸鉀二、無菌操作

接種時由于有一個敞口的過程，所以是極易引起污染的時期，這一時期主要由空氣中的細菌和工作人員本身引起，接種室要嚴格進行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1%～3%的高錳酸鉀溶液對設(shè)備、墻壁、地板等進行擦洗。視頻3-3無菌操作

除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進行：(1)在接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外燈進行滅菌；(2)在接種前20min，打開超凈工作臺的風(fēng)機以及臺上的紫外燈；(3)接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，并換穿拖鞋等；(4)上工作臺后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭工作臺面；(5)先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對培養(yǎng)皿要過火烤干；(6)接種時，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等；(7)接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外燈滅菌30min。注：若連續(xù)接種，每5天要大強度滅菌一次。三、接種三、接種三、接種滅菌和無菌操作是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，在各環(huán)節(jié)中都要保持無菌的環(huán)境；滅菌的方法很多，要根據(jù)材料和目的來選擇；接種是整個組織培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟，要嚴格按照操作流程完成。123滅菌和消毒有何差別?為什么?常用的滅菌方法各有哪些優(yōu)缺點?采用高壓蒸汽鍋高壓滅菌時，應(yīng)注意哪些事項?實驗人員進入接種室接種之前，應(yīng)做哪些準備工作?1234項目三

無菌操作技術(shù)任務(wù)三外植體的選擇與處理任務(wù)二無菌操作技術(shù)任務(wù)一虛擬無菌操作無菌操作任務(wù)三外植體的選擇與處理知識目標學(xué)會處理各種外植體的方法和操作流程；學(xué)會外植體的培養(yǎng)方法；掌握外植體的培養(yǎng)過程。123掌握外植體的選擇方法；熟練掌握外植體的滅菌方法和無菌操作技術(shù)；學(xué)會外植體的培養(yǎng)過程

123技能目標第一節(jié)外植體的選擇和處理第二節(jié)培養(yǎng)和馴化任務(wù)講解第一節(jié)外植體的選擇和處理一、外植體選擇時應(yīng)注意：（1）選擇優(yōu)良的種質(zhì)及母株（2）選擇適當?shù)臅r期（3）選取適宜的大?。?）外植體來源要豐富（5）外植體要易于消毒二、外植體取材的部位：（1）莖尖莖尖不僅生長速度快，繁殖率高，不容易發(fā)生變異，而且莖尖培養(yǎng)是獲得脫毒苗木的有效途徑。因此莖尖是植物組織培養(yǎng)中最常用的外植體。（2）節(jié)間部大部分果樹和花卉等植物，新梢的節(jié)間部是組織培養(yǎng)的較好材料。新梢節(jié)間部位不僅消毒容易，而且脫分化和再分化能力較強，因此是常用組織培養(yǎng)材料。（3）葉和葉柄葉片和葉柄取材容易，新出的葉片雜菌較少，實驗操作方便，是植物組織培養(yǎng)中常用的材料。尤其是近年在植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，以葉片為試驗材料的報道很多。（4）鱗片水仙、百合、蔥、蒜、風(fēng)信子等鱗莖類植物常以鱗片為材料。（5）其他種子、根、塊莖、塊根、花粉等也可以作為植物組織培養(yǎng)的材料。三、外植體處理：首先，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當?shù)乃⒆拥人⑾?。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，準備好消毒的燒杯、70％酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70％酒精浸10-30s。第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取1-2種使用。第四步是用無菌水涮洗，涮洗要每次1-3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-10次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。第五步接種。接種是將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊，放人培養(yǎng)基的過程。第二節(jié)培養(yǎng)和馴化

指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室(有光照、溫度條件)里，使之生長，分裂和分化形成愈傷組織或進一步分化成再生植株的過程。

1．培養(yǎng)方法(1)固體培養(yǎng)法即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。雖然該方法設(shè)備簡單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。1培養(yǎng)方法(2)液體培養(yǎng)法即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動或振動培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進行培養(yǎng)，其速度一般為50-100r／min，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。1.初代培養(yǎng)◆2.繼代培養(yǎng)◆3.生根培養(yǎng)◆培養(yǎng)步驟2．培養(yǎng)步驟2．培養(yǎng)步驟叢生芽的發(fā)育Ⅰ頂芽腋芽微型扦插叢生芽的發(fā)育Ⅱ頂芽CTK刺激帶芽的莖切段側(cè)芽接種培養(yǎng)形成的莖梢節(jié)長，直立向上呈小灌木叢狀獲得較多嫩莖梢莖段培養(yǎng)繼代擴繁試管苗生根培養(yǎng)無愈傷組織產(chǎn)生初代繼代叢生芽的發(fā)育2不定芽的發(fā)育脫分化分化愈傷組織芽、芽叢切割芽叢繼代培養(yǎng)大量芽叢試管苗生根培養(yǎng)外植體初代繼代不定芽的發(fā)育石龍芮下胚軸培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體過程體細胞胚狀體的發(fā)育Ⅰ體細胞胚狀體的發(fā)育1體細胞胚狀體的發(fā)育Ⅱ

外植體特點：數(shù)量多，速度快，結(jié)構(gòu)完整，成苗率高愈傷組織小孢子游離單細胞器官

胚狀體

試管苗體細胞胚狀體的發(fā)育2原球莖的發(fā)育

縮短的、呈珠粒狀的、由胚性細胞組成的、類似嫩莖的器官。原球莖的發(fā)育視頻視頻3-5初代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)擴繁方法：以幾何級數(shù)增加，可切割莖段、分離芽叢、胚狀體、原球莖。培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基或分化培養(yǎng)基實質(zhì)：增殖培養(yǎng)物，為生產(chǎn)成品試管苗做準備。繼代培養(yǎng)目的：擴繁無根苗，最后達到邊繁殖邊生根視頻3-6繼代培養(yǎng)生根培養(yǎng)培養(yǎng)材料生根繼代培養(yǎng)初代培養(yǎng)生根培養(yǎng)基：1／2或1／4MS培養(yǎng)基生根方法與途徑新梢基部浸入50或100ppmIBA液4－8h在含IAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)