《植物組織培養(yǎng)》課件 項(xiàng)目2 培養(yǎng)基的配制

任務(wù)一母液的配制任務(wù)二培養(yǎng)基的制備模塊二培養(yǎng)基的配制項(xiàng)目二

培養(yǎng)基的配制任務(wù)一母液的配制知識(shí)目標(biāo)一般掌握培養(yǎng)基的種類(lèi)、特點(diǎn)。掌握基本培養(yǎng)基的配方。一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量。123技能目標(biāo)掌握基本培養(yǎng)基的配制的配方。掌握培養(yǎng)基母液的配制方法和步驟。12任務(wù)講解第一節(jié)培養(yǎng)基的種類(lèi)第二節(jié)培養(yǎng)基的和成分第三節(jié)培養(yǎng)基的配制流程第一節(jié)培養(yǎng)基的種類(lèi)

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求也不相同，只有滿(mǎn)足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長(zhǎng)。

因此，沒(méi)有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類(lèi)型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。第一節(jié)培養(yǎng)基的種類(lèi)

培養(yǎng)基有幾十種，根據(jù)不同植物和部位選用不同的培養(yǎng)基。歷史沿革：

（1）培養(yǎng)基的產(chǎn)生最早是Knop(1681)，以后根據(jù)不同目的進(jìn)行改良產(chǎn)生了多種培養(yǎng)基。（2）White培養(yǎng)基在40年代用得較多，現(xiàn)在還常用。（3）而到60和70年代則大多采用MS等高濃度培養(yǎng)基，可以保證培養(yǎng)材料對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需要，并能生長(zhǎng)快、分化快，且由于濃度高，在配制、消毒過(guò)程中某些成分有些出入，也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。一、培養(yǎng)基的種類(lèi)第一節(jié)培養(yǎng)基的種類(lèi)

培養(yǎng)基的名稱(chēng)，多數(shù)以發(fā)明人的名字來(lái)命名，如White培養(yǎng)基，Murashige和Skoog培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱(chēng)MS培養(yǎng)基)。目前國(guó)際上流行的培養(yǎng)基有幾十種，常用的培養(yǎng)基及特點(diǎn)如下：

(1)MS培養(yǎng)基它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。第一節(jié)培養(yǎng)基的種類(lèi)(2)B5培養(yǎng)基是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。其主要特點(diǎn)是含有較低的銨，這可能對(duì)不少培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用。從實(shí)踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長(zhǎng)更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。

(3)White培養(yǎng)基是1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。1963年又作了改良，稱(chēng)作White改良培養(yǎng)基。其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。第一節(jié)培養(yǎng)基的種類(lèi)

（4）N6培養(yǎng)基是1974年朱至清等為水稻等禾谷類(lèi)作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是成分較簡(jiǎn)單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國(guó)內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。第二節(jié)培養(yǎng)基的成分

水

無(wú)機(jī)鹽：大量元素

微量元素

有機(jī)化合物：碳源

維生素

氨基酸

植物激素

天然提取物

瓊脂

其它：PH值、活性炭、抗生素、抗酚類(lèi)物質(zhì)污染的添加劑、生長(zhǎng)抑制劑、染色劑……視頻2-1培養(yǎng)基成分1.水

1.水水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過(guò)程的介質(zhì)和溶媒。它是生命活動(dòng)過(guò)程中不可缺少的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過(guò)程發(fā)霉變質(zhì)，大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來(lái)水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。2.無(wú)機(jī)元素

元素名稱(chēng)添加形式

NKNO3,NH4NO3

大量PKH2PO4NaH2PO4

元素KKClKNO3(≥0.5mmol/L)CaCaCl2

·2H2OMgMg2SO4

·7H2OSMg2SO4·

7H2OFeFeNa2-EDTA

微量BH3BO3

元素MnMnSO4(≤0.5mmol/L)CuCuSO4MoNa2MoO4·2H2OClCaCl2

·2H2O2.無(wú)機(jī)元素2.無(wú)機(jī)元素

總之，植物必需營(yíng)養(yǎng)元素可組成結(jié)構(gòu)物質(zhì)，也可是具有生理活性的物質(zhì)，如酶、輔酶以及作為酶的活化劑，參與活躍的新陳代謝。此外，在維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等電化學(xué)方面起著重要作用。當(dāng)某些營(yíng)養(yǎng)元素供應(yīng)不足時(shí)，愈傷組織表現(xiàn)出一定的缺素癥狀。2.無(wú)機(jī)元素3.有機(jī)化合物有機(jī)物維生素肌醇氨基酸天然復(fù)合物椰乳香蕉泥水解酪蛋白碳水化合物馬鈴薯其它3.有機(jī)化合物a.碳水化合物

選用種類(lèi)：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等。蔗糖濃度：2－3%，胚培養(yǎng)為4－15%

高壓滅菌部分糖會(huì)分解。大生產(chǎn)時(shí)可用白砂糖。a.碳水化合物b.維生素種類(lèi)：

VB1、VB6、VB3、Vc濃度：0.1－1.0mg/L

作用：

VB1[鹽酸硫胺素]促愈傷組織產(chǎn)生，提高活力。

VB6[鹽酸吡哆醇]促根生長(zhǎng)。

VB3[煙酸]與代謝和胚發(fā)育有關(guān)。

Vc[抗壞血酸]防組織褐變。b.維生素c.肌醇

促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)、胚狀體和芽的形成。對(duì)組織細(xì)胞繁殖、分化的促進(jìn)作用。濃度100mg/L。促進(jìn)糖類(lèi)的相互轉(zhuǎn)化，提高活性物質(zhì)的活性。c.肌醇d.氨基酸

常用：甘氨酸水解酪蛋白[CH]

水解乳蛋白[LH]等。

作用：是蛋白質(zhì)的組分；

促進(jìn)器官增殖；

可作有機(jī)氮源。d.氨基酸e.天然復(fù)合物椰乳：促愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)，用量10－20%;香蕉泥：對(duì)PH值緩沖大，用量150－200ml/L;馬鈴薯：對(duì)PH值緩沖大，用量150－200g/L;水解酪蛋白：濃度100－200mg/L.其他：酵母提取液[YE]、蘋(píng)果汁、番茄汁等。e.天然復(fù)合物4.植物激素（1）生長(zhǎng)素類(lèi)

A.種類(lèi)

IAA

NAA

IBA

2,4－DB.作用誘導(dǎo)愈傷組織和根分化，促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)。

C.濃度

0.05～5mg/mL（2）赤霉素（GA）

注：不耐熱

A.種類(lèi)：GA3B.作用：促莖伸長(zhǎng)，促胚發(fā)育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入。4.植物激素4.植物激素（3）細(xì)胞分裂素（CTK）

A.種類(lèi)：6－BA

KT

ZTB.作用：誘導(dǎo)不定芽分化和莖、苗增殖。

C.濃度：0.05－10mg/mL4.植物激素5.培養(yǎng)體支持材料1.瓊脂

A.用量6－10g/LB.新買(mǎi)應(yīng)試凝固力

C.使用優(yōu)缺點(diǎn)2.其它玻璃纖維濾紙橋海綿蛭石等5.培養(yǎng)體支持材料6.輔助性物質(zhì)A.常用種類(lèi)：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等B.用量：5～20%C.注意：抗生素對(duì)組織生長(zhǎng)有抑制作用，使用要慎重（1）抗生素6.輔助性物質(zhì)6.輔助性物質(zhì)常用抗氧化劑及使用：半胱氨酸VC（50～200mg/L液洗滌外植體傷口表面）。（2）抗氧化物6.輔助性物質(zhì)6.輔助性物質(zhì)6.輔助性物質(zhì)（3）活性炭A.作用：具吸附作用；莖尖初代培養(yǎng)可防褐化；促進(jìn)新梢增殖（濃度0.1～0.2%）；促進(jìn)生根；防止組培苗玻璃化（濃度0.3%）。利于胚胎培養(yǎng)。B.常用濃度：0.5～10g/L

C.注意：活性炭具副作用。第三節(jié)母液的配制(一)母液配制流程圖

稱(chēng)量

母液分裝確定培養(yǎng)基溶解

定容

貼標(biāo)簽保存于冰箱MS培養(yǎng)基母液的配制1MS培養(yǎng)基母液配制的配方母液種類(lèi)成分標(biāo)準(zhǔn)量（mg）擴(kuò)大倍數(shù)稱(chēng)取量（mg）母液體積（ML）用量/L大量元素NH4NO316505082.5100020KNO3190090MgSO4·7H2O37018.5KH2PO41708.5鈣鹽CaCI2·2H2O4405022100020鐵鹽FeSO4?7H2O27.81002.78100010MS培養(yǎng)基母液的配制2MS培養(yǎng)基母液配制的配方母液種類(lèi)成分標(biāo)準(zhǔn)量（mg）擴(kuò)大倍數(shù)稱(chēng)取量（mg）母液體積（ML）用量/L微量元素MnSO4·4H2O22.31002.23100010ZnSO4·7H2O8.60.86CoCl2·6H2O0.0250.0025CuSO45H2O0.0250.0025Na2MOO4·2H2O0.250.025H3BO36.20.62KI0.830.083MS培養(yǎng)基母液的配制3MS培養(yǎng)基母液配制的配方母液種類(lèi)成分標(biāo)準(zhǔn)量（mg）擴(kuò)大倍數(shù)稱(chēng)取量（mg）母液體積（mL）用量/L有機(jī)物煙酸（VB3）0.52000.110005鹽酸吡哆醇（VB6）0.50.1鹽酸硫胺素（vB1）0.10.02甘氨酸2.00.4肌醇100藥品稱(chēng)量視頻天平預(yù)置全顯示清零稱(chēng)藥視頻2-2藥品稱(chēng)量Fe鹽母液的配制

Fe鹽母液的配制硫酸亞鐵和EDTA-Na分別溶解后，冷卻后將Fe鹽倒入EDTA-Na中[反之易沉淀]，然后定容。激素母液的配制激素母液濃度：

0.5-1mg/ml，1次配成100ml激素溶解：

IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容

NAA先溶于熱水或95%酒精再加水；

2,4-D先溶于1mol/LNaOH或酒精再加水；

KT、BA先溶于1mol/LHCl再加水。任務(wù)小結(jié)

目前國(guó)際上流行的培養(yǎng)基有：MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基；培養(yǎng)基的成分：水、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)化合物、天然提取物、瓊脂、活性炭、抗生素等。

母液配制流程圖為：確定培養(yǎng)基稱(chēng)量溶解定容母液分裝貼標(biāo)簽保存于冰箱123思考練習(xí)培養(yǎng)基的種類(lèi)、特點(diǎn)有哪些？簡(jiǎn)述培養(yǎng)基的組成成分、作用和適宜的劑量。簡(jiǎn)述培養(yǎng)基母液的配制方法和步驟。123任務(wù)一母液的配制任務(wù)二培養(yǎng)基的制備模塊二培養(yǎng)基的配制項(xiàng)目二

培養(yǎng)基的配制任務(wù)二培養(yǎng)基的配制知識(shí)目標(biāo)培養(yǎng)基配制方法和步驟；一般掌握培養(yǎng)基的篩選辦法。12技能目標(biāo)熟練掌握培養(yǎng)基配制方法和步驟；熟練掌握培養(yǎng)基的滅菌方法12任務(wù)講解第一節(jié)培養(yǎng)基配制流程第二節(jié)培養(yǎng)基的選擇第一節(jié)培養(yǎng)基配制流程分裝調(diào)PH值接種確定配方移母液定容培養(yǎng)基熬制滅菌稱(chēng)取蔗糖、瓊脂扎口水培養(yǎng)基配制流程圖1.培養(yǎng)基熬制1.將2/3水倒入鋁鍋中，近開(kāi)鍋時(shí)加入稱(chēng)好的蔗糖和瓊脂，邊煮邊攪拌，防止糊底。2.用旺火煮開(kāi)，再用文火加熱，直至瓊脂全部融化。3.將量好的培養(yǎng)基母液倒入鋁鍋中，攪拌均勻。1.培養(yǎng)基熬制培養(yǎng)基熬制視頻視頻2-3培養(yǎng)基熬制母液的量取視頻視頻2-4母液的量取母液的定容

2.定容培養(yǎng)基做好后在調(diào)整pH值之前，應(yīng)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行定容，考慮培養(yǎng)基本身處于熱態(tài)并還需要滅菌等要損失部分，因此定容時(shí)需要多出近1/10。視頻2-5定容母液調(diào)pH3.調(diào)pH值用0.1MNaOH或HCl調(diào)PH值為5.8。在培養(yǎng)基配方不大變動(dòng)的情況下可用經(jīng)驗(yàn)法。可以將連續(xù)三次測(cè)定所加入的酸或堿液的平均值作為以后調(diào)整的用量值。調(diào)后注意一定要搖動(dòng)均勻。視頻2-6調(diào)整PH值4.激素的添加在激素的水平變化較小時(shí)，尤其在配制多種培養(yǎng)基時(shí)，激素可以在pH值調(diào)整后添加。要求嚴(yán)格時(shí)應(yīng)添加激素后再調(diào)整pH值（因激素母液可能影響培養(yǎng)基的pH值）。激素的添加培養(yǎng)基分裝5.培養(yǎng)基分裝趁熱分裝，100ml的三角瓶約裝入30～40ml,30瓶/L。視頻2-7培養(yǎng)基分裝培養(yǎng)基的扎口與滅菌

6.扎口與滅菌要求封口松緊適宜，系活扣，便于接種操作。培養(yǎng)基應(yīng)及時(shí)滅菌，防止變質(zhì)。視頻2-8培養(yǎng)基滅菌任務(wù)小結(jié)

培養(yǎng)基配制的順序?yàn)椋旱顾訜岱Q(chēng)取瓊脂入鍋加熱熔解加入蔗糖待瓊脂溶化后加母液攪拌均勻然后加激素。培養(yǎng)基制作視頻視頻2-9培養(yǎng)基母液配制

0.5mg/ml的NAA配制方法，要求配100ml。某培養(yǎng)基為MS+BA2mg/l+NAA0.2mg/l.

問(wèn)：如果做2升，應(yīng)加激素各為多少毫升？（BA母液為0.5mg/ml，NAA為0.5mg/ml）。思考練習(xí)12第二節(jié)培養(yǎng)基的選擇

在建立一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)體系時(shí)，為了能研制出一種適合的培養(yǎng)基，最好先由一種已被廣泛使用的基本培養(yǎng)基(如MS培養(yǎng)基或B5培養(yǎng)基)開(kāi)始。當(dāng)通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)，對(duì)這種培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動(dòng)之后，即有可能得到一種能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需要的新培養(yǎng)基，選擇最佳培養(yǎng)基。常用試驗(yàn)方法主要有單因子試驗(yàn)、多因子試驗(yàn)及廣譜實(shí)驗(yàn)等。單因子試驗(yàn)

在單因子試驗(yàn)中，由于培養(yǎng)基中其他成分都維持在一般水平上，所以只變動(dòng)一個(gè)因子，就可以找出這一因子對(duì)試驗(yàn)的影響和影響的程度。例如MS基本培養(yǎng)基的其他成分和用量都不變，只變動(dòng)NAA用量對(duì)某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個(gè)因素的試驗(yàn)就是單因子試驗(yàn)。單因子試驗(yàn)

試驗(yàn)中要求對(duì)照組與試驗(yàn)組中的試驗(yàn)個(gè)體，即植物組織塊或其他培養(yǎng)物，必須在遺傳性、生理狀態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，盡可能完全一致。以保證試驗(yàn)結(jié)果是來(lái)源于試驗(yàn)因子，而不是由于試驗(yàn)材料的不一致導(dǎo)致的。試驗(yàn)中各處理一般都要設(shè)有一定的重復(fù)，以取得可靠的試驗(yàn)結(jié)果。隨試驗(yàn)規(guī)模和要求不同，大多每個(gè)項(xiàng)目要有4～10瓶，每瓶至少3塊培養(yǎng)物或3叢小幼苗。多因子試驗(yàn)

對(duì)培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究的試驗(yàn)稱(chēng)為多因子實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)可采用完全試驗(yàn)方案，也可選用正交設(shè)計(jì)方案，完全試驗(yàn)方案具有均衡完全的特點(diǎn)，各個(gè)因子的每個(gè)水平都相互搭配，構(gòu)成了所有可能的處理組合，如研究NAA和6－BA的最佳濃度組合，每個(gè)因子各設(shè)5個(gè)濃度水平(0，0.5，2.5，5，10mg／L)，這兩種因子各種濃度的所有組合，就構(gòu)成了一個(gè)具有25項(xiàng)處理的試驗(yàn)見(jiàn)下表。多因子試驗(yàn)2種激素5種濃度的實(shí)驗(yàn)組合6-BA(mg/L）00.52.5510NAA012345(mg/L)0.56789102.5111213141551617181920102122232425廣譜實(shí)驗(yàn)法

在廣譜實(shí)驗(yàn)法中，把培養(yǎng)基中所有組分分為4大類(lèi)：無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素。對(duì)每一類(lèi)物質(zhì)選定低(L)、中(M)、和高(H)3個(gè)濃度。4類(lèi)物質(zhì)各3種濃度的自由組合即構(gòu)成了一項(xiàng)包括81個(gè)處理的實(shí)驗(yàn)。在這81個(gè)處理中最好的一個(gè)可用4個(gè)字母表示。例如，一個(gè)