《植物組織培養(yǎng)》課件 模塊四－6 植物液體培養(yǎng)

任務(wù)一器官培養(yǎng)（一）莖段培養(yǎng)任務(wù)二器官培養(yǎng)（二）植物的再生培養(yǎng)任務(wù)三培養(yǎng)物的不良表現(xiàn)及改進(jìn)措施任務(wù)四花卉的組織培養(yǎng)任務(wù)五水果作物的組織培養(yǎng)任務(wù)六植物液體培養(yǎng)常見(jiàn)植物組配方法與易發(fā)問(wèn)題處理項(xiàng)目四常見(jiàn)植物組培方法與易發(fā)問(wèn)題的處理任務(wù)六植物的液體培養(yǎng)

一般掌握液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基的區(qū)別；掌握液體培養(yǎng)基的配制方法及流程；

掌握馬鈴薯莖段液體接種的流程及要點(diǎn)。知識(shí)目標(biāo)123能夠根據(jù)不同植物及種類(lèi)選擇液體培養(yǎng)；能夠根據(jù)不同的植物器官及器官狀態(tài)，進(jìn)行液體培養(yǎng)；會(huì)通過(guò)觀察試管苗的長(zhǎng)勢(shì)，大體判斷采取何種措施改善培養(yǎng)條件；熟練液體培養(yǎng)組培苗的轉(zhuǎn)接操作流程；熟練各種試管苗繼代培養(yǎng)過(guò)程中的切割方式與技術(shù)；技能目標(biāo)12345學(xué)習(xí)提示多動(dòng)手，勤實(shí)踐；多比較，多聯(lián)想，勤歸納；手、口、腦并用，學(xué)做合一。理論閱讀

植物液體培養(yǎng)主要在植物細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用廣泛，主要是離體條件下將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，將組織振蕩分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過(guò)繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖來(lái)獲得大量細(xì)胞群體。液體培養(yǎng)可分為靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)等兩類(lèi)。靜止培養(yǎng)不需要任何設(shè)備，適合于某些原生質(zhì)體和輕質(zhì)植物莖段的培養(yǎng)。振蕩培養(yǎng)需要搖床或轉(zhuǎn)床等設(shè)備使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基保持充分混和以利于氣體交換。

液體培養(yǎng)有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)；（2）可帶走培養(yǎng)物產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物，避免有害代謝產(chǎn)物局部濃度過(guò)高等問(wèn)題；（3）保證氧的充分供給。所以，液體培養(yǎng)的生長(zhǎng)條件比固體培養(yǎng)有很大的改善。實(shí)際應(yīng)用

植物莖段的液體培養(yǎng)基同固體培養(yǎng)基的種類(lèi)及成分大體一致，唯一不同在于固體培養(yǎng)基含有瓊脂等作為支撐物，液體培養(yǎng)及不含瓊脂等。

第一節(jié)液體培養(yǎng)基的配制一、根無(wú)性繁殖系的建立1.外植體

根的培養(yǎng)材料一般來(lái)自無(wú)菌種子發(fā)芽產(chǎn)生的幼根或植株根系經(jīng)滅菌處理后的切段。2.根無(wú)性繁殖系的建立

將種子進(jìn)行表面消毒，在無(wú)菌條件下萌發(fā)，待根伸長(zhǎng)后從根尖一端切取長(zhǎng)1.2cm的根尖（或植株的根系經(jīng)表面滅菌后）接種于培養(yǎng)基中。這些根的培養(yǎng)物生長(zhǎng)甚快，幾天后發(fā)育出側(cè)根。待側(cè)根生長(zhǎng)約一周后，即切取側(cè)根的根尖進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，它們又迅速生長(zhǎng)并長(zhǎng)出側(cè)根，又可切下進(jìn)行培養(yǎng)，如此反復(fù)，就可得到從單個(gè)根尖衍生而來(lái)的離體根的無(wú)性繁殖系。這種根可用來(lái)進(jìn)行根系生理生化和代謝方面的實(shí)驗(yàn)研究。油棕根培養(yǎng)（引自劉進(jìn)平，2005）二、培養(yǎng)方法一、植株再生培養(yǎng)根的離體培養(yǎng)也可以用來(lái)再生植株。第一步誘導(dǎo)形成愈傷組織；第二步在再分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽的分化，在愈傷組織上分化成小植株。

需要注意的是，愈傷組織如果先分化形成根則往往抑制芽的形成。再生培養(yǎng)流程再生培養(yǎng)視頻

視頻4-1-1再生培養(yǎng)

二、固氮培養(yǎng)

通過(guò)分離和培養(yǎng)具有固氮作用的根瘤菌，接種到禾谷類(lèi)等作物的試管苗根系中，可以實(shí)現(xiàn)谷物直接利用生物固氮的捷徑。通過(guò)選擇有效的適當(dāng)濃度的誘瘤劑誘導(dǎo)根瘤菌侵入試管苗根部結(jié)瘤固氮，固氮菌接種時(shí)要給根系創(chuàng)造傷口，以利于根瘤菌的侵入。接種根瘤菌形成的根瘤具有一定的固氮活性并向宿主提供氮素，能促進(jìn)植株生長(zhǎng)和氮營(yíng)養(yǎng)的改善，無(wú)論在株高、鮮重和葉綠素含量都有提高。

二、培養(yǎng)方法三、影響因素1.植物種類(lèi)2.培養(yǎng)基多為濃度低的White培養(yǎng)基，許多植物在1/2MS培養(yǎng)基上能生根。糖的使用濃度應(yīng)稍低，如玫瑰生根蔗糖為2%。3.生長(zhǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基中添加適宜濃度的生長(zhǎng)素有利于根的形成和生長(zhǎng)，常用生長(zhǎng)素為IAA、NAA、IBA，濃度范圍一般為0.0-1.0mg/L。三、影響因素4.pH根的培養(yǎng)適宜的pH范圍為5.0~6.0，5.光照大多數(shù)人認(rèn)為，黑暗有利于根的形成。試管苗的生根一般無(wú)需考慮光照的影響，有時(shí)加一點(diǎn)活性炭可減弱光照，對(duì)植物的生根比較有利。6.溫度生根溫度一般控制在16~25℃。第二節(jié)莖尖培養(yǎng)

意義：莖尖不僅生長(zhǎng)速度快、繁殖率高、不易產(chǎn)生遺傳變異，而且是獲得無(wú)病毒苗木的有效途徑，故莖尖培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)最常用的試材之一。類(lèi)型：莖尖培養(yǎng)分為微莖尖培養(yǎng)和普通莖尖培養(yǎng)。微莖尖指帶有1～2個(gè)葉原基的生長(zhǎng)錐，其長(zhǎng)度不超過(guò)0.5mm。普通莖尖指較大的莖尖（如幾mm到幾十mm）、芽尖及側(cè)芽。這里主要講普通莖尖培養(yǎng)。這種培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)單，操作方便，莖尖容易成活，成苗所需時(shí)間短。一、普通莖尖培養(yǎng)1.取材

挑選雜菌污染少，生長(zhǎng)不久的莖尖。木本植物可在取材前對(duì)莖尖噴幾次滅菌藥劑。以保證材料不帶或少帶雜菌。用于普通莖尖培養(yǎng)，可先從植物的莖、藤或匍匐枝上切取2cm以上的頂梢。莖尖取材示意圖視頻4-1-2外植體采集與處理視頻外植體采集與處理視頻

莖尖的解剖構(gòu)造（引自劉進(jìn)平，2005）一、普通莖尖培養(yǎng)2.滅菌將采到的莖尖切成0.5～1.0cm長(zhǎng)，并將大葉除去，休眠芽預(yù)先剝除鱗片。將莖尖置于流水沖洗2～4小時(shí)(視干凈程度），再在70%的酒精中處理10-30秒，然后在稀釋5～10倍的次氯酸鈉（商品次氯酸鈉為10%）中浸10～15分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗3～4次，或者用0.1～0.2%的氯化汞滅菌5～10分鐘，無(wú)菌水沖洗5次以上。莖尖滅菌視頻4-1-3外植體滅菌外植體滅菌視頻一、普通莖尖培養(yǎng)

3.接種

為了減少污染，可在接種前再剝掉一些葉片，使莖尖為0.5cm左右大小。有些植物的莖尖由于多酚氧化酶的氧化作用而發(fā)生褐化，使培養(yǎng)基變褐，影響材料的成活。所以在接種時(shí)，不能用生銹的解剖刀，動(dòng)作要敏捷，隨切隨接，減少傷口在空氣中暴露的時(shí)間，也可配制1～5%Vc液，將切下的莖尖材料浸入處理一下。視頻4-1-4接種接種視頻一、普通莖尖培養(yǎng)

4.培養(yǎng)（1）培養(yǎng)基多數(shù)莖尖培養(yǎng)采用MS作為基本培養(yǎng)基或改良MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素是必須的，如2,4-D，IAA，NAA等，一般用0.1mg/L左右，高于此濃度，往往產(chǎn)生畸變芽或形成愈傷組織。莖尖在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)太慢、生長(zhǎng)太快和生長(zhǎng)正常等三種類(lèi)型。

桑樹(shù)莖尖萌發(fā)

桑樹(shù)莖尖萌發(fā)

楊樹(shù)頂芽萌發(fā)成叢生芽楊樹(shù)頂芽萌發(fā)成叢生芽

一、普通莖尖培養(yǎng)

4.培養(yǎng)（2）初代培養(yǎng)

莖尖的初代培養(yǎng)主要是通過(guò)適宜的培養(yǎng)條件刺激頂芽和腋芽的生長(zhǎng)。外植體啟動(dòng)生長(zhǎng)的關(guān)鍵主要是培養(yǎng)基的激素配比與濃度，一般應(yīng)使用較高濃度的細(xì)胞分裂素和較低濃度的生長(zhǎng)素，解除頂端優(yōu)勢(shì)的抑制作用，生長(zhǎng)素濃度過(guò)高容易產(chǎn)生愈傷組織。視頻4-1-5初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)視頻一、普通莖尖培養(yǎng)

4.培養(yǎng)

（3）繼代培養(yǎng)

莖尖長(zhǎng)成的新梢，可切成若干小段，轉(zhuǎn)入到增殖培養(yǎng)基中。長(zhǎng)大后又可切成小段，再轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基，這樣一代一代繼續(xù)下去，便建立和維持了莖尖無(wú)性繁殖系。繼代培養(yǎng)的激素濃度要降低或用MS0培養(yǎng)基。有時(shí)也可邊進(jìn)行繼代培養(yǎng)邊進(jìn)行誘導(dǎo)生根。取比較長(zhǎng)的新梢（如2cm以上）轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，余下較短的新梢繼續(xù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)。視頻4-1-6繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)視頻一、普通莖尖培養(yǎng)

4.培養(yǎng)（4）誘導(dǎo)生根誘導(dǎo)生根多采用1/2MS培養(yǎng)基，即MS培養(yǎng)基的各種組成成份用量均減半的培養(yǎng)基。并加入一定的生長(zhǎng)素類(lèi)調(diào)節(jié)物質(zhì)，如NAA、IBA等。也可將切下的新梢基部浸入50或100ppm的IBA溶液中處理4～8小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的生根培養(yǎng)基中。注意較高濃度的生長(zhǎng)素對(duì)生根有抑制作用。視頻4-1-7生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)視頻單芽莖段微繁示意圖

單芽莖段微繁示意圖單芽莖段增殖示意圖單芽莖段增殖示意圖叢生芽微繁示意圖（引自劉進(jìn)平，2005）叢生芽微繁示意圖叢生芽增殖示意圖（5）培養(yǎng)條件

每天照光16小時(shí)，照度1500～3000Lx即可，溫度通常為25±2℃。一般莖尖培養(yǎng)在40天左右可長(zhǎng)成新梢，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。4.培養(yǎng)一、普通莖尖培養(yǎng)5．馴化移栽

生根培養(yǎng)一個(gè)月左右，多數(shù)新梢即可獲得生長(zhǎng)健壯而發(fā)達(dá)的根系。移植時(shí)可根據(jù)生根情況來(lái)進(jìn)行。若發(fā)現(xiàn)新梢基部生有較濃密的不定根，長(zhǎng)度在1cm以?xún)?nèi)，就可移栽入土。移栽時(shí)通過(guò)幾天的煉苗過(guò)程，從試管中取出小植株，輕輕洗掉培養(yǎng)基。栽后給予較高的空氣濕度條件。一、普通莖尖培養(yǎng)視頻4-1-8馴化馴化視頻

首先營(yíng)養(yǎng)缽的培養(yǎng)土要澆透水，所放置的床面也要澆濕，然后搭小拱棚，以減少水分的蒸騰，初期要常噴霧處理，保持拱棚薄膜上有水珠出現(xiàn)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)小苗有生長(zhǎng)趨勢(shì)，可逐漸減少濕度將拱棚兩端打開(kāi)通風(fēng)，并且減少?lài)娝螖?shù)。使小苗適應(yīng)濕度較小的條件。以后揭去拱棚的薄膜，并給予水分控制，少澆水或不澆水，促進(jìn)小苗長(zhǎng)得粗壯。

最適宜的溫度是16～20℃，春季地溫較低時(shí)，可用電熱線來(lái)加溫。光照管理上，初期可用較弱的光照，在小拱棚上加蓋遮陽(yáng)網(wǎng)或報(bào)紙等，以防陽(yáng)光灼傷小苗和增加蒸騰作用，后期可直接利用自然光照。為了提高馴化效率，可用育苗盤(pán)進(jìn)行馴化生根，選擇2cm左右孔徑的育苗盤(pán)即可?？籽ㄑb入蛭石：珍珠巖：草炭土為1︰1︰0.5的基質(zhì)。第三節(jié)莖段培養(yǎng)

莖段培養(yǎng)是指對(duì)植物帶有一個(gè)以上芽的外植體（包括塊莖、球莖、鱗莖的幼莖切段）進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。莖段培養(yǎng)的主要目的是進(jìn)行植物的離體快速繁殖。莖段培養(yǎng)用于快速繁殖的優(yōu)點(diǎn)在于：培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)單易行、繁殖速度較快；芽生芽方式增殖的苗木質(zhì)量好，且無(wú)病、變異小、性狀均一等。第三節(jié)莖段培養(yǎng)一、無(wú)菌培養(yǎng)物的建立1.取材

取生長(zhǎng)健壯無(wú)病蟲(chóng)的當(dāng)年生幼嫩枝條或鱗莖盤(pán)，去掉葉片，剪成3～4cm的小段。取材時(shí)注意莖的基部比頂部切段、側(cè)芽比頂芽的成活率低，所以應(yīng)優(yōu)先利用頂部的外植體，但由于每個(gè)新梢僅一個(gè)頂芽，也可利用腋芽，莖上部的腋芽培養(yǎng)效果較好。還應(yīng)注意盡量在生長(zhǎng)期取芽，如蘋(píng)果在3～6月取材的成活率為60%，7～11月下降到10%，12～2月都在10%以下。一、無(wú)菌培養(yǎng)物的建立

視頻4-1-9取材取材視頻2.滅菌

20分鐘，如果材料表面有絨毛應(yīng)在消毒劑中滴加1-2滴土溫—20或80。因材料老嫩和蠟質(zhì)多少而定時(shí)間。最后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次以致干凈，否則植物材料會(huì)受殘留滅菌劑的危害。一、無(wú)菌培養(yǎng)物的建立視頻4-1-10滅菌視頻滅菌視頻3.接種

消毒好的莖段用鋒利的解剖刀或剪刀剪去兩端消毒劑殺傷的部位，分切成單芽小段接種于預(yù)先配好的誘導(dǎo)側(cè)芽萌發(fā)的培養(yǎng)基中，一般每瓶接種一塊外植體，防止交叉感染。一、無(wú)菌培養(yǎng)物的建立視頻4-1-11接種接種視頻二、培養(yǎng)方法和程序1.培養(yǎng)

最常用的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，加入3%蔗糖，用0.7%的瓊脂固化。培養(yǎng)條件保持25℃左右，給予充分的光照和光期。經(jīng)培養(yǎng)后莖段的切口特別是基部切口上會(huì)長(zhǎng)出愈傷組織，呈現(xiàn)稍許增大，而芽開(kāi)始長(zhǎng)長(zhǎng)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)叢生芽，從而得到無(wú)菌苗。二、培養(yǎng)方法和程序

月季莖段側(cè)芽萌發(fā)（引自譚文澄、戴策剛，1991）月季莖段側(cè)芽萌發(fā)

在莖段培養(yǎng)中，促進(jìn)腋芽增殖用6-BA是最為有效的。生長(zhǎng)素雖不能促進(jìn)腋芽增殖，但可改善苗的生長(zhǎng)。GA對(duì)芽的伸長(zhǎng)有促進(jìn)作用。繼代擴(kuò)繁是莖段培養(yǎng)的主要一步。這可由二種途徑解決：一是促進(jìn)腋芽的快速生長(zhǎng)；二是誘導(dǎo)形成大量不定芽。二、培養(yǎng)方法和程序莖段快繁方式模式圖

第一種途徑的好處是不會(huì)產(chǎn)生變異，能保持品種優(yōu)良特性，且方法簡(jiǎn)便，可在各種植物上使用。每年從一個(gè)芽可擴(kuò)繁增殖10萬(wàn)株以上。莖段快繁方式模式圖第二種途徑（誘導(dǎo)形成大量不定芽）有時(shí)會(huì)產(chǎn)生變異。

繼代增殖過(guò)程所用培養(yǎng)基和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與初代培養(yǎng)相同，有時(shí)會(huì)稍低。二、培養(yǎng)方法和程序

生根培養(yǎng)主要是降低或除去細(xì)胞分裂素而加入生長(zhǎng)素。由于在苗增殖時(shí)施用了較高濃度的細(xì)胞分裂素，其苗中保持著一定的量，因此在生根培養(yǎng)中不需要加細(xì)胞分裂素。生長(zhǎng)素的濃度，NAA一般為0.01～1.0mg/L，IBA和IAA可稍高。

生根培養(yǎng)時(shí)最好在培養(yǎng)基中加0.3%活性炭，以促進(jìn)生根。二、培養(yǎng)方法和程序二、培養(yǎng)方法和程序2.移植

這是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵一環(huán)。試管苗是在恒溫、濕度飽和、營(yíng)養(yǎng)豐富、激素適當(dāng)和無(wú)菌條件下生長(zhǎng)的。植物的組織發(fā)育程度不高，植株幼嫩，表皮角質(zhì)層變薄，抵抗力減弱