DB22-T2081-2014-鼠疫耶爾森菌核酸的測定熒光PCR方法-吉林省

ICS11.020B41DB22吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2081—2014鼠疫耶爾森菌核酸的測定熒光PCR方法MethodoffluorescencePCRforthedetectionofYersiniapestis吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2081—2014前言本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2009、GB/T20001.4-2001給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王瑋琳、劉陽、孫舒、聶丹丹、陳光宇、劉韜、劉金華、羅雁非、鄭旭IDB22/T2081—2014鼠疫耶爾森菌核酸的測定熒光PCR法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鼠疫耶爾森菌核酸的測定熒光PCR法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鼠疫耶爾森菌的實(shí)驗(yàn)室檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法3警告為了保護(hù)實(shí)驗(yàn)室人員的安全，應(yīng)由具備資格的工作人員進(jìn)行檢測。培養(yǎng)物和廢物應(yīng)小心處置，并按GB19489中的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。試樣制備及核酸提取過程需在生物安全二級及以上實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。FAM:6-羧基-熒光素（一種熒光報(bào)告基團(tuán)）（6-Carboxy-fluorescein）。TTAMRA（Carboxytetramethylrhodamine）。TE:緩沖液(Tris-ClEDTA)。Tm值:核酸融解溫度（Meltingtempreture）。Ct值:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號量達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Cyclethreshold)。實(shí)時(shí)熒光PCR方法，是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過熒光信號的增幅情況來判定反應(yīng)結(jié)果。PCR反應(yīng)體系中加入一對引物的同時(shí)加入一條特異性熒光探針，探針兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，PCR擴(kuò)增時(shí)，利用Taq酶的水解作用，使探針上的熒光報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)而發(fā)出熒光信號，熒光檢測系統(tǒng)可接收到熒光信號，此方法檢測的是積累熒光。TAMRA探針（Carboxytetramethylrhodamine，羧基四甲基羅丹明），是羅丹明類熒光素衍生物，TAMRA易于被mercuryarclamps的546nm光譜線所激發(fā)，且比熒光素具有更好的光穩(wěn)定性和敏感性。1DB22/T2081—20146.1所用水應(yīng)符合GB/T6682中的規(guī)定。6.2除特別說明以外，所用試劑均為分析純或生化試劑。6.3引物及探針上游引物5'-GTTAATACCAAATATATCCCTGA-3'，下游引物5'-TCTGCGTCATAAAGCATTC-3'，探針FAM–TGCAGCCTCCACCGGGATGC-TAMRA6.410%SDS在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用。6.520mg/ml蛋白酶K將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。6.6CTAB/NaCl溶液在80mL水中溶解4.1gNaCl，緩慢加入10gCTAB，同時(shí)加熱并攪拌，如果需要，可加熱至65℃使其溶解，定容終體積至100mL。量取1mol/LTris-HCl(pH8.0)25mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)1mL,置于100mL燒杯中。向燒杯中加入約40mL的去離子水，混合均勻，定容至50mL后，高壓滅菌備用。在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2?2H2O），在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0（約需20gNaOH顆粒）然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。2DB22/T2081—20147.9恒溫水浴箱。7.10微量離心管：1.5mL。8試樣制備8.1取25mg～30mg動物組織，放入1.5mL離心管中,加入500μLTE緩沖液,用勻漿儀研碎。勻漿液10000r/min,離心2min，棄上清，沉淀備用。8.2將菌液制備成懸濁液，10000r/min,離心2min，棄上清，沉淀備用。9檢測步驟9.1DNA提取在上述樣品沉淀中加入560μLTE緩沖液，反復(fù)吹打使之重懸，加入30μL的10%SDS和3μL蛋白酶K（20mg/mL），混勻，37℃孵育1h；加入100μL5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80μLCTAB/NaCl溶液，混勻，65℃溫育10min；加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)入一新離心管中；加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，10000r/min離心15min,去上清；75%乙醇洗一次，去上清，干燥，加入50μL的TE緩沖液溶解DNA備用。也可使用商業(yè)化的DNA提取試劑盒提取。反應(yīng)體系總體積為25μL，其中含：TaqManMix緩沖液12.5μL、上下引物（10μmol/L）各1μL、探針（5μmol/L）1μL、模板DNA5μL、水4.5μL。第一階段，95℃15min，1個(gè)循環(huán)；第二階段，94℃10s，62℃45s，40個(gè)循環(huán)；熒光收集設(shè)置在62℃45s時(shí)進(jìn)行。不同儀器、不同TaqDNA聚合酶可根據(jù)要求將反應(yīng)條件做適當(dāng)調(diào)整?？瞻讓φ眨阂运鍰NA模板?？瞻讓φ眨簾oTAMRA熒光信號，相應(yīng)Ct值>40。陰性對照：無TAMRA熒光信號，相應(yīng)Ct值>40。陽性對照：有TAMRA熒光信號，且TAMRA通道出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，相應(yīng)Ct值≤36。否則判斷為PCR無效。待測樣品Ct值大于或等于40，內(nèi)參照基因檢測Ct值在20～35之間者，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常者，則可判定該樣品陰性。3DB22/T2081—2014待測樣品Ct值小于40，內(nèi)參照基因檢測Ct值在20～35之間者，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常者，則可判定該樣品陽性。待測樣品Ct值在36～