DB22-T2012-2014-福氏阿米巴原蟲檢測方法-吉林省

ICS11.220B41DB22吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2012—2014福氏阿米巴原蟲檢測方法DetectionofNaegleriafowleri吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2012—2014前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省畜牧業(yè)管理局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：曹利利、姚新華、苑淑賢、程榮華。IDB22/T2012—2014福氏阿米巴原蟲檢測方法警告─使用本標(biāo)準(zhǔn)的人員應(yīng)有正規(guī)實驗室工作的實踐經(jīng)驗。本標(biāo)準(zhǔn)并未指出所有可能的安全問題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧⒈ＷC符合國家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水環(huán)境中福氏阿米巴原蟲的分離鑒定和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測方法的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于生活用水、畜舍蓄水池中福氏阿米巴原蟲的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1耐格里屬阿米巴屬于雙鞭毛阿米巴科原蟲，多孳生于淡水中，有滋養(yǎng)體和包囊2個生活階段，滋養(yǎng)體呈長阿米巴型，大小為7×20μm，在不良環(huán)境中可形成有2根鞭毛的滋養(yǎng)體；包囊圓形，直徑9μm，單核?，F(xiàn)知該屬有5個種N．gruberi,N．foweri，N．lovaniensis，N．jadini和N.austratiensis，其中能致病的以福氏耐格里阿米巴原蟲（N．fowleri）為主。人或動物接觸污染水體或在游泳池游泳，福氏耐格里阿米巴滋養(yǎng)體可侵入鼻腔增殖后穿過鼻粘膜和篩狀板，經(jīng)嗅神經(jīng)上行入腦部寄生，引起急性原發(fā)性阿米巴腦膜腦炎，因此又被稱作“食腦蟲”。體外培養(yǎng)invitroculture將寄生蟲活體結(jié)構(gòu)或活蟲從寄生體內(nèi)或外部環(huán)境中分離出來，放在類似的生存環(huán)境（模擬體內(nèi)溫度，濕度，營養(yǎng)條件），讓蟲體生長發(fā)育的方法并維持其結(jié)構(gòu)和功能。1DB22/T2012—2014聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種級聯(lián)反復(fù)循環(huán)的DNA合成反應(yīng)過程。一般由三個步驟組成：模板的熱變性，寡核苷酸引物復(fù)性到單鏈靶序列上以及由熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化的復(fù)性引物引導(dǎo)的新生DNA鏈延伸聚合反應(yīng)的過程。4試劑與材料4.1引物引物序列如下，引物濃度為15pmol/μL。上游引物：5’-GTGAAAACCTTTTTTCCATTTACA-3’下游引物：5’-AAATAAAAGATTGACCATTTGAAA-3’4.2試劑除另有規(guī)定，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，水應(yīng)符合GB/T6682中4.2二級水要求。4.2.1阿米巴生理鹽水(AmebicSaline,簡稱AS)（見附錄A.1）4.2.2阿米巴無營養(yǎng)瓊脂平板(NonnutrientAgar,簡稱NNA)（見附錄A.2）4.2.3滅活大腸桿菌溶液（見附錄A.3）4.2.4阿米巴培養(yǎng)緩沖溶液（見附錄A.4）4.2.5真核細(xì)胞DNA提取試劑盒4.2.6標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000Marker4.2.7PCR反應(yīng)試劑盒4.2.101.0%瓊脂糖凝膠（見附錄A.7）4.2.11電泳上樣緩沖液（見附錄A.8）4.3材料4.3.6吸頭:10μL、200μL、1000μL；4.3.7瓊脂平板。5儀器設(shè)備2DB22/T2012—20145.7倒置顯微鏡；5.8恒溫水浴鍋：30-100℃；5.9恒溫培養(yǎng)箱；5.10分析天平：感量0.1g；5.11接種環(huán)；5.12接種涂布器；5.134℃冰箱。6樣品6.1采集6.1.1采樣地點畜禽飲用水源、畜舍蓄水池等邊緣。6.1.2采樣位置水面至水面下40㎝。6.1.3采樣方法用無菌試劑瓶直接取指定位置待檢水樣1000mL。6.1.4運輸保存6.2.1待檢水樣經(jīng)單層紗布初步過濾，去除大的雜質(zhì)物。6.2.2初過濾完的水樣經(jīng)5μm濾膜孔的Millipore水過濾系統(tǒng)進行負(fù)壓過濾，留濾膜待用。7檢測水樣過濾完后，將濾膜翻轉(zhuǎn)后蓋于表面涂布滅活大腸桿菌的NNA培養(yǎng)基上，接種后置于28℃培養(yǎng)24h，倒置顯微鏡下觀察滋養(yǎng)體生長情況以判斷培養(yǎng)結(jié)果。在20倍或40倍倒置顯微鏡下,檢查NNA平板上的蟲體集落并標(biāo)記,然后在涂有經(jīng)滅活大腸桿菌的NNA平板反復(fù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)直至無菌。刮取蟲體,放入盛有0.2mL蒸餾水的1.5mL的離心管中，室溫放置1h，混勻后取少量用100倍顯微鏡觀察鞭毛體。3DB22/T2012—20147.2PCR鑒定7.2.1模版制備刮取集落蟲體，按DNA提取試劑盒說明書操作。7.2.2陽性及陰性對照陽性對照：福氏耐格里阿米巴標(biāo)準(zhǔn)蟲株（例如福氏耐格里阿米巴MW4U株），DNA提取按DNA提取試劑盒說明書操作。陰性對照：用滅菌蒸餾水做相同處理，作為標(biāo)準(zhǔn)陰性對照以及陰性模板。7.2.3PCR反應(yīng)體系PCR為50μL體系：a)滅菌雙餾水：26μL；b)10倍PCR緩沖液：5μL；c)dNTPs：4μL；d)上游引物：2μL；e)下游引物：2μL；f)模板：10μL；g)TaqDNA聚合酶：1μL。在0.5mL反應(yīng)管中按上述列表依次加入上述試劑，同時設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性對照樣品組和待檢樣品組，做好標(biāo)記。94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)；72℃延伸7min；4℃保存10min。取8μLPCR產(chǎn)物，與2μL上樣緩沖液混合，加入瓊脂糖凝膠板的加樣孔中。同法加入陰、陽性對照PCR產(chǎn)物及標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000Marker。用紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果。8結(jié)果判定4DB22/T2012—20148.1耐格里阿米巴分離鑒定8.1.1生長軌跡特征在NNA平板上呈放射性生長并在倒置顯微鏡下可見噬菌空斑的，可初步判定為樣品中存在阿米巴原蟲（參考附錄B.5）。8.1.2滋養(yǎng)體形態(tài)學(xué)特征倒置顯微鏡下可見滋養(yǎng)體呈長圓形，外壁光滑，可初步判定為耐格里阿米巴原蟲（參考附錄B.4）。8.1.3鞭毛體特征顯微鏡下可見一對或多根鞭毛的蟲體，可初步判定為耐格里阿米巴屬原蟲（參考附錄B.6）。8.2PCR鑒定PCR產(chǎn)物電泳后，可見311bp條帶，且陰、陽性對照成立，可判定為福氏耐格里阿米巴原蟲（參考附錄B.7）。9廢棄物處理和防止污染的措施9.1檢測過程中分區(qū)操作，防止交叉污染。9.2檢測廢棄物高壓滅菌等無害化處理。9.3實驗前后，實驗室用紫外線消毒。5DB22/T2012—2014AA附錄A（規(guī)范性附錄）福氏阿米巴原蟲檢測試劑的配置A.1阿米巴生理鹽水(AS)——NaCl：120mg；——MgSO4.7H2O：4mg；——CaCl.2H2O：4mg；——Na2HPO4：142mg；——KH2PO4：136mg；——蒸餾水：1000mL。121℃15min滅菌，pH=6.8，4℃可保存6個月。A.2無營養(yǎng)瓊脂平板（NNA）——阿米巴生理鹽水：100mL；——瓊脂粉：1.5g；121℃15min滅菌，60℃澆瓊脂平板。制備大腸桿菌液體培養(yǎng)基（LB）1L：——胰蛋白胨：10g；取5mLLB培養(yǎng)基，接種單菌落大腸桿菌，37℃震蕩過夜培養(yǎng)。大腸桿菌溶液121℃高壓10min,冷卻，4℃保存?zhèn)溆谩?DB22/T2012—2014A.6TAE電泳緩沖液制備A.6.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液配制（pH8.0）?！叶@四乙酸二鈉：18.6g；——滅菌蒸餾水：80mL；——氫氧化鈉（1mol/LNaOH）調(diào)pH值至8.0；——滅菌蒸餾水加至100mL。A.6.250倍TAE電泳緩沖液配制——三羥甲基氨基甲烷（Tris）：242g；——冰乙酸：57.1mL；——0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH值8.0）：100mL；——滅菌蒸餾水加至1000mL。作電泳液使用時，用雙餾水50倍稀釋。A.71.0%瓊脂糖凝膠板制備——瓊脂糖：1g；——50倍TAE電泳緩沖液：2mL；——滅菌蒸餾水：98mL。微波爐中完全融化，待冷卻至50-60℃時，加溴化乙錠（EB）溶液5μL，搖勻，倒入電泳板上，凝固后取下梳子，備用。溴酚藍(lán)0.2g，加10mL滅菌蒸餾水過夜溶解。50g蔗糖加入50mL滅菌蒸餾水溶解后，移入已溶解的溴酚藍(lán)溶液中，搖勻定容至100mL。7DB22/T2012—2014BB附錄B（資料性附錄）結(jié)果圖示和目的片段序列B.1耐格里阿米巴形態(tài)示意圖圖B.1B.2培養(yǎng)陽性結(jié)果（滋養(yǎng)體以及包囊×400）圖B.2圖B.3（注：n為細(xì)胞核；f為鞭毛）B.4福氏阿米巴原蟲標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)CR鑒定陽性結(jié)果圖8DB22/T2012—2014圖B.4（注：1為DL2000;2為福氏阿米巴原蟲陽性PCR擴增結(jié)果）B.5目標(biāo)片段序列Gtgaaaaccttttttccatttacaaaaaataactctgtgcaatggagcacacggctcgtgtatcgatgaagcccgcggcaaaaagcgatatgtaatgagattcgttagcctcgagattcatcaaattggtgaacacagtctggacctcgcaaga