DB22-T2010-2014-家畜（豬牛羊）戊型肝炎病毒的測定RT-PCR法-吉林省

ICS11.220B41DB22吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2010—2014家畜（豬牛羊）戊型肝炎病毒的測定RT-PCR法DetectionofHepatitisEvirusbyRT-PCRinLivestock（pig/cattle/sheep）吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2010—2014前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省畜牧業(yè)管理局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘇雙、邵洪澤、許志林、程榮華、王楠、李琳、毛文智、王忠國、李文東，于丹。1DB22/T2010—2014家畜（豬牛羊）戊型肝炎病毒的測定RT-PCR法警告─使用本標(biāo)準(zhǔn)的人員應(yīng)有正規(guī)實驗室工作的實踐經(jīng)驗。本標(biāo)準(zhǔn)并未指出所有可能的安全問題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧⒈ＷC符合國家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了家畜（豬牛羊）戊型肝炎病毒RT-PCR測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬、牛、羊等家畜戊型肝炎病毒的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義戊型肝炎病毒科成員。一種單股正鏈RNA病毒，呈球形、直徑27～34nm，無囊膜，核衣殼呈二十面體立體對稱。病毒基因組長約7.2knt，有3個開放閱讀框（ORF1、ORF2、ORF3）。ORF2位于3′端，為主要的結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū)，可編碼核衣殼蛋白。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是一種在體外快速擴增特定DNA片段的方法。由熱變性→復(fù)性→延伸三步反應(yīng)組成一個PCR循環(huán)，經(jīng)過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以大量擴增。4試劑與材料2DB22/T2010—2014引物序列見表1，引物濃度為25mmol/L。表1特異性引物序列引物種類外引物引物名稱HEV-1HEV-2HEV-3HEV-4特異性引物的核苷酸序列擴增片段長度（bp）5'-TAYCGHAAYCAAGGHTGGCG-3'5'-TGYTGGTTRTCRTARTCCTG-3'5'-ATWCATGGVTCRCCTGTGAA-3'5'-AAATYAATTCTGTCGGRAGC-3'524（第1次PCR引物）內(nèi)引物328（第2次PCR引物）注：R=A/G，Y=C/T，W=A/T，H=A/C/T，V=A/C/G。4.2試劑4.2.1RNA提取試劑盒4.2.2RT-PCR試劑盒4.2.3DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker）DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可采用100bpDNAladderMaker、DNAMarkerDL2000或其它等效產(chǎn)品。4.2.4其它試劑4.2.4.14.2.4.24.2.4.34.2.4.4雙蒸水：符合GB/T6682中4.2二級水要求；0.1%DEPC水：見附錄A中A.1；4.3.1一次性無菌手套或乳膠手套；4.3.21.5mL離心管；4.3.30.2mLPCR反應(yīng)管；4.3.4瓊脂糖；5儀器設(shè)備3DB22/T2010—20145.3電泳槽；5.4紫外光透射儀或凝膠成像系統(tǒng)；5.5高速臺式冷凍離心機：12000r/min；5.6微型高速離心機：12000r/min；5.7水浴鍋：30-100℃；5.8分析天平：感量0.1g；5.9微波爐；5.10-20℃冰箱；5.11旋渦振蕩器；5.12乳缽或玻璃研磨器；5.13微量移液器。6樣品的采集及處理6.1肝臟樣品的采集及處理采取肝臟樣品約1.0~2.0g，置于滅菌研缽中，充分研磨成勻漿，加入滅菌的1mol/LPBS溶液配成1︰5乳懸液，反復(fù)凍融3次。4℃8000r/min離心5min，收集上清液，供RNA抽提或者-20℃保存?zhèn)溆谩?.2糞便樣品的采集及處理挑取0.5~1.0g糞便樣品于1.5mL離心管內(nèi)，加入滅菌的1mol/LPBS溶液，旋渦震蕩混勻，制備成10%的糞便懸液，4℃8000r/min離心10min，收集上清液，供RNA抽提或者-20℃保存?zhèn)溆?。取上述處理好的樣?00μL于1.5mL無RNA酶離心管中，每管加入1000μLTrizol試劑，混勻，室溫放置5min；加入200μL氯仿，混勻，室溫放置5min，4℃，12000r/min離心10min。取上清400μL于一個新的無RNA酶離心管，加入40μLRNA助沉劑，加入440μL異丙醇，混勻，-20℃放置30min，4℃，12000r/min離心10min。棄上清，沉淀用0.1%DEPC水配置的75%乙醇洗滌兩次，在生物安全柜中通風(fēng)晾干，加入25μL0.1%DEPC水溶解沉淀，獲得的RNA樣品可直接進行反轉(zhuǎn)錄（RT）或置-20℃以下保存，盡快使用。本操作應(yīng)在一個無RNA酶（Rnase）的條件下進行。4DB22/T2010—2014在冰浴條件下，按下列試劑用量在PCR反應(yīng)管中分別加入各成分：待檢樣品RNA：10μL；a)b)10mmol/LdNTPs混合物：2μL，終濃度為0.8mmol/L；c)25mmol/LHEV外下游引物（HEV-2）：1μL，終濃度為1.0mmol/L。加完試劑后瞬時離心混勻。72℃5min，冰浴2min。取出后再依次加入下列試劑：d)5×RT緩沖液（RTBuffer）：5μL，終濃度為1倍；e)200U/μLM-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶：1μL，終濃度為8U/μL；f)40U/μLRNA酶抑制劑：1μL，終濃度為1.6U/μL；g)0.1%DEPC水：5μL。反應(yīng)總體積為25μL。加完試劑后瞬時離心混勻。將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)，按如下程序進行RT反應(yīng)：42℃反應(yīng)1h；然后95℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶5min。RT反應(yīng)獲得的cDNA可直接進行PCR反應(yīng)或置-20℃保存?zhèn)溆?。本加樣操作?yīng)在一個無RNA酶（Rnase）的條件下進行。7.2外引物PCR擴增7.2.1擴增體系在冰浴條件下，按下列試劑用量在PCR反應(yīng)管中分別加入各成份：a)滅菌雙蒸水：15.7μL；b)10×PCR緩沖液（PCRBuffer）：2.5μL，終濃度為1倍；c)20mmol/LMgCl2：2.0μL，終濃度為1.6mmol/L；d)10mmol/LdNTPs混合物：0.5μL，終濃度為0.2mmol/L；e)25mmol/LHEV外引物（HEV-1/HEV-2）：各0.5μL，終濃度為0.5mmol/L；f)5u/μLTaqDNA聚合酶：0.3μL，終濃度為0.06u/μL；g)RT反應(yīng)產(chǎn)物（cDNA）：3μL。依次加入試劑后瞬時離心混勻。將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)，按如下反應(yīng)程序進行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性4min；然后進入94℃變性40s，53℃復(fù)性40s，72℃延伸60s的循環(huán)，共進行35個循環(huán)；72℃徹底延伸10min；4℃保存。PCR產(chǎn)物用于下一輪內(nèi)引物PCR反應(yīng)。在冰浴條件下，按下列試劑用量在PCR反應(yīng)管中分別加入各成分：a)滅菌雙蒸水：15.7μL；5DB22/T2010—2014依次加入試劑后瞬時離心混勻。將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)，按如下反應(yīng)程序進行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性4min；然后進入94℃變性50s，53℃復(fù)性50s，72℃延伸50s的循環(huán)，共進行35個循環(huán)；72℃徹底延伸10min；4℃保存。PCR產(chǎn)物可直接進行瓊脂糖凝膠電泳分析或置4℃保存?zhèn)溆谩?.4電泳7.4.11%瓊脂糖凝膠的制備及放置將凝膠托架水平放置在工作臺上，并放上梳子。稱取1.0g瓊脂糖于三角燒瓶中，加入100mL1倍Tris-硼酸電泳緩沖液，用微波爐加熱溶解瓊脂糖；待瓊脂糖溶液冷卻至約50℃時，加入10mg/mL溴化乙錠（EB）溶液5μL，使其終濃度為0.5μg/mL，充分混合，避免起氣泡，倒入凝膠托架，凝膠厚度控制在3～5mm之間；待凝膠完全凝固后輕輕拔出梳子。將凝膠連同托架一起放入電泳槽中，加入1倍Tris-硼酸電泳緩沖液，使之浸過凝膠表面約2mm。7.4.2加樣將5μLPCR產(chǎn)物與1μL凝膠加樣緩沖液混合均勻，加至瓊脂糖凝膠加樣孔中。同時在瓊脂糖凝膠板一側(cè)加樣孔中加入DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物。7.4.3電泳條件以5V/cm凝膠長的穩(wěn)壓電泳，電泳30min，停止電泳。8結(jié)果判定8.1將電泳后的瓊脂糖凝膠置于紫外光透射儀或凝膠成像系統(tǒng)上觀察，與DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物比較，分析擴增核苷酸片段大小，然后拍照保存。當(dāng)陽性對照在328bp位置上出現(xiàn)DNA擴增帶，陰性對照未出現(xiàn)目的擴增帶時，實驗結(jié)果成立。8.2若被檢樣品在328bp位置出現(xiàn)DNA擴增帶，判定為HEV陽性，記為HEV(+)。8.3若被檢樣品在328bp位置未出現(xiàn)DNA擴增帶，判定為HEV陰性，記為HEV(-)。8.4檢測結(jié)果凝膠電泳圖見附錄B。9廢棄物處理和防止污染的措施9.1檢測過程中分區(qū)操作，防止交叉污染。9.2檢測廢棄物高壓滅菌等無害化處理。9.3實驗前后，實驗室用紫外線消毒。6DB22/T2010—2014AA附錄A（規(guī)范性附錄）戊型肝炎病毒RT-PCR檢測試劑的配制A.10.1%DEPC水的制備0.1%DEPC水按下列方法進行配制：——焦碳酸二乙酯（DEPC）：0.1mL；——雙蒸水：100mL；將0.1mLDEPC加入100mL雙蒸水中配成0.1%的水溶液，室溫作用12h以上，其間間歇搖勻幾次或在室溫下磁力攪拌20min，然后1.034×105Pa高壓滅菌30min，室溫保存。DEPC是強的蛋白變性劑和致癌物，開瓶取用時應(yīng)使瓶子盡可能小心謹(jǐn)慎，避免溶液因內(nèi)部壓力而導(dǎo)致飛濺。A.275%乙醇的配制75%乙醇按下列方法進行配制：——無水乙醇：750mL；——0.1%DEPC水：250mL；在750mL無水乙醇中加入250mL0.1%DEPC水，4℃保存。10mg/mL溴化乙錠按下列方法進行配制：在100mL雙蒸水中加入1.0g溴化乙錠（EB），用鋁箔包裹容器，磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全溶解，然后移至棕色瓶中，保存于室溫。溴化乙錠（EB）是強誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶液時應(yīng)戴上手套，稱量時應(yīng)戴面罩，避免皮膚沾染。——溴酚藍：50.0mg；先將蔗糖完全溶解于雙蒸水，然后按順序加入其余各成份，待所有成分溶解混合均勻后，用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。7DB22/T2010—2014A.5.10.5mol/LEDTA（pH8.0）的配制0.5mol/LEDTA（pH8.0）按下列方法進行配制：——二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2·2H2O）：186.1g；——氫氧化鈉：20.0g；——雙蒸水：定容至1000mL；在800mL雙蒸水中加入186.1gEDTA-Na2·2H2O，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0（約需20.0g氫氧化鈉顆粒），然后定容至1000mL，分裝后1.034×105Pa高壓滅菌30min。室溫保存。A.5.25倍Tris-硼酸電泳緩沖液的配制5倍Tris-硼酸電泳緩沖液按下列方法進行配制：——Tris：54.0g；——硼酸：27.5g；——0.5mol/LEDTA（pH8.0）：20mL；——雙蒸水：定容至1000mL。A.5.31倍Tris-硼酸電泳緩沖液的配制1倍Tris-硼酸電泳緩沖液按下列方法進行配制：——5倍Tris-硼酸電泳緩沖液：100mL；——雙蒸水：400mL。在800mL雙蒸水中依次加入上述成分，用1moL/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH至7.2，加水定容至1000mL，B8DB22/T2010—2014CB附錄B（資料性附錄）電泳圖示和目的片段序列B.1凝膠電泳結(jié)果圖示凝膠電泳檢測結(jié)果如圖B.1所示。注：“+”表示檢測結(jié)果陽性，“-”表示檢測結(jié)果陰性。圖B.1HEVRT-PCR檢測結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖tacatggatcacctgtgaattcttacactaatacaccttacactggtgctctcggcctgctcgattttgcgcttgagcttgagtttcgtaatttgacacctggt