重組DNA技術(shù)的基本工具課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3-3

我國是棉花的生產(chǎn)和消費(fèi)大國。棉花在種植過程中，常常會受到一些害蟲的侵襲，其中以棉鈴蟲最為常見。棉鈴蟲可以使棉

花產(chǎn)量減少三分之一，嚴(yán)重時(shí)，甚至能使一片棉田絕收。大量使用農(nóng)藥殺蟲不僅會提高生產(chǎn)成本，還可能造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境的污

染。要是能培育出自身就能抵抗蟲害的棉花新品種，這一問題就

會迎刃而解，我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是在這樣

的背景下產(chǎn)生的。為什么傳統(tǒng)的雜交育種方法培育不出抗蟲棉，

基因工程卻可以呢?基因工程是如何進(jìn)行操作的?它給我們的生

產(chǎn)和生活帶來了怎樣的影響?基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的生物類型和生物產(chǎn)品。

從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA

分子水平上進(jìn)行設(shè)

計(jì)和施工的，因此又叫做重組DNA

技術(shù)?；蚬こ?/p>

是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA

分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做重組DNA

技術(shù)。>操作對象：基因

(DNA)>操作水平：DNA

分子水平>

原

理

：基因重組>

結(jié)

果

：

創(chuàng)造出人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品>

意

義

：定向改造生物遺傳特性；徹底打破種間界限基因工程分析基因工程的理論基礎(chǔ)1.基因工程操作導(dǎo)致的基因重組與有性生殖中的基因重組的主要區(qū)別是什么?有性生殖中的基因重組是隨機(jī)的，并且只能在同一物種間進(jìn)行重組；基因工程可以實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)在不同物

種間進(jìn)行重組，并且方向性強(qiáng)，可以

定向地改變生物的性狀。減數(shù)分裂I前期：同源染色體上非

姐妹染色單體間的互換；減數(shù)分裂I后期：非同源染色體上

非等位基因的自由組合。2.

為什么不同生物的DNA

分子能拼接起來?①

DNA

的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。②

雙鏈DNA

分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。3.為什么一種生物的基因可以在另一種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)?①

基因是控制生物性狀的獨(dú)立遺傳單位。②

遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。③生物界共用一套遺傳密碼。分析基因工程的理論基礎(chǔ)第三章基因工程第1節(jié)重組DNA

技術(shù)的基本工具露

生

物生

物

學(xué)

(人教版)選擇性必修三

生物技術(shù)與工程番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒侵染后，產(chǎn)量會大大下降?？茖W(xué)

家通過精心設(shè)計(jì)，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基

因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。DNA

雙螺旋的直徑只有2

nm,

對如此微小

的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需

要專門的“分子工具”。那么,科學(xué)家究竟用到

了哪些“分子工具”?這些“分子工具”各具有

什么特征呢?從社會中來△

轉(zhuǎn)基因番木瓜(左)與非轉(zhuǎn)基因番木瓜(右)外源

DNA

片段難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即使進(jìn)入也很難穩(wěn)定存在、復(fù)制并表達(dá)。在培育轉(zhuǎn)基因番木瓜時(shí)，既要在體外對含有所需基因的DNA

分子“切割”、改造和“拼接”

;又要將重組

DNA

分子

導(dǎo)入番木瓜體細(xì)胞內(nèi)，并使其在細(xì)胞中表

達(dá)

。>思考：你認(rèn)為完成基因工程的操作可能需要哪些關(guān)鍵性的工具?“分子運(yùn)輸車”“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”基因工程的基本工具含目的基因的DNA目的基因重組DNA“分子運(yùn)輸車”主要是從原核生物中分離純化出來的數(shù)千種

(限制酶不是一種酶，而是一類酶)能夠識別雙鏈DNA

分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(核苷酸之間的磷酸酯鍵)磷酸二酯鍵限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)——

"分子手術(shù)刀"1.來

源

：

2.種類：3.

作

用

：4.結(jié)

果

：限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)——

"分子手術(shù)刀">當(dāng)限制酶在它的識別序列的中心軸線兩側(cè)將

DNA

分子的兩條鏈分別切開時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端。①EcoRI

限制酶：能特異性識別5'-GAATTC-3

'序列，并在G與

A之間切割黏性末端(5'AATT-3')中軸線限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)——

"分子手術(shù)刀"②SmaI限制酶：

能特異性識別5'-CCCGGG-3'序列，并在C與G之間切割>當(dāng)限制酶在它的識別序列的中心軸線處切開時(shí)，產(chǎn)生的是平末端。平末端3'5'>大多數(shù)限制酶的識別序列由6個(gè)核苷酸組成；也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)

量的核苷酸組成。>限制酶所識別的序列的特點(diǎn)是：都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA

上的堿基是

反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。正向讀

與另一條鏈反向讀的堿基順序完全一致。3'GA

A

G5'中軸線5'

3'G

GG3'

5'中軸線核心歸納>DNA

分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA

片段末端通常有兩種形式——黏性末端和平末

端。EcoRISma

IATAT3'5'屬名Escherichia

首字母R

型菌株EcoR

I種名coli前兩個(gè)字母從中分離的第一個(gè)限制酶資料卡

限制酶名字的由來例如：流感嗜血桿菌(Haemophilus

influenzae)d株中先后分離到3種限制

酶，則分別命名為：Hind

I、Hind

IⅡ、Hind

IⅢ1.根據(jù)上述所學(xué)，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么?限制酶是原核生物的一種防御工具，當(dāng)外源DNA

入侵時(shí)，它會利用限制酶來切割侵入細(xì)胞的外源DNA,

使之失效，以保證自身安全。甲基

限制酶的識別序列(

被

甲

基

化

修

飾

)細(xì)菌A限制酶A噬菌體細(xì)菌的限制一修飾作用使侵入的外源DNA

被切

割(噬菌體失去繁殖能力)

而自身DNA

得到保護(hù)2.為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA

分

子

?含某種限制酶的細(xì)菌的DNA

分子不具備這種限制酶的識別序列，或者甲基化酶將甲基

轉(zhuǎn)移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限

制酶不能將其切開。思考

·

討論限制酶的識別序列(未被甲基化修飾)思考

·討論3.有2個(gè)不同來源的DNA

片段A和

B,A

片段用限制酶Spe

I

進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶Hind

IⅢ、Xba

I、EcoR

V

和Xho

I

進(jìn)行切割。各限制酶的識別序

列和切割位點(diǎn)如下。(1)A片段經(jīng)限制酶切割一次可斷開2個(gè)磷酸二酯鍵，產(chǎn)生2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，產(chǎn)生

2

個(gè)黏性末端，其黏性末端是5'CTAG-3'

o思考

·

討論3.

有2個(gè)不同來源的DNA

片段A和

B,A片段用限制酶

Spe

I

進(jìn)行切割，

B

片

段分別用限制酶Hind

IⅢ、Xba

I、EcoR

V

和Xho

I

進(jìn)行切割。各限制酶的識別序

列和切割位點(diǎn)如下。(2)同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同?不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同?相同；不一定，不同的限制酶切割可能會形成相同的黏性末端，如SpeI

和XbaI。>

識

別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶。思考

·

討論3.有2個(gè)不同來源的DNA

片段A和B,A片段用限制酶Spe

I

進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶Hind

IⅢ、Xba

I、EcoR

V

和Xho

I

進(jìn)行切割。各限制酶的識別序

列和切割位點(diǎn)如下。(3)哪種限制酶切割B片段產(chǎn)生的DNA

片段能與限制酶

Spe

I

切割A(yù)片段產(chǎn)生的DNA

片段相連

接?為什么?連接完成后，該重組DNA

分子的新連接處能否再被所用的限制酶識別?為什么?限制酶XbaI;因?yàn)橄拗泼?/p>

XbaI

與

SpeI

切割產(chǎn)生了相同的黏性末端。不能；因?yàn)樗玫膬煞N限制酶均不能識別該重組DNA

分子的新連接處的脫氧核苷酸序列。切口5'A3'切口5'G

TA3'DNA連接酶——"分子縫合針"1.作用：將兩個(gè)DNA片段連接起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。C

G

G

G

G

GCGCGGGG3'3'3'3'3'3'5'5'5'5'5'5'種類E.coli

DNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體相同點(diǎn)都能將雙鏈DNA片段"縫合"起來，恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵不同點(diǎn)E.coli

DNA連接酶連接具有平末端的DNA片段的效率要

遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于T4DNA連接酶DNA連接酶——"分子縫合針"2.種

類

：由于黏性末端的堿基是互補(bǔ)的，在連接時(shí)，黏性末端可以通過堿基互補(bǔ)配對形成氫鍵，加快

DNA

連接酶的連接速度，而平末端則不能。所以T4DNA

連接酶連

接黏性末端的速度比平末端的速度更快。oDNA連接酶——"分子縫合針">

為

什

么T4DNA連接酶連接平末端的效率相對較低?5'3'3'5'心：6TAA(;6(1)DNA

聚合酶只能催化單個(gè)核苷酸加

到已有的核酸片段3'末端的羥基上，形成

磷酸二酯鍵；而DNA

連接酶是催化兩個(gè)

DNA

片段之間形成磷酸二酯鍵。(2)DNA

聚合酶以一條

DNA

鏈為模板，

催化形成與模板鏈互補(bǔ)的DNA

鏈；而DNA

連接酶催化具有互補(bǔ)黏性末端或平末

端的DNA

片段連接起來，不需要模板。此外，它們雖同為蛋白質(zhì)，但組成、性質(zhì)等各不相同。游離的核苷酸

DNA聚合酶前導(dǎo)鏈解旋酶后隨鏈復(fù)制叉DNA聚合酶DNA

連接酶和

DNA

聚合酶是一回事嗎?為什么?▲DNA

復(fù)制中DNA

聚合酶發(fā)揮作用項(xiàng)目限制酶DNA連接酶DNA聚合酶解旋酶DNA水解酶作用對象D

N

A

分

子D

N

A

分

子

片

段脫氧核苷酸D

N

A

分

子D

N

A

分

子作用部位磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵氫鍵磷酸二酯鍵作用結(jié)果形成黏性末

端或平末端形成重組D

N

A

分

子形成新的D

N

A

分

子形成單鏈D

N

A

分

子形成脫氧核苷酸核心歸納與DNA

相關(guān)的幾種酶的比較基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——"分子運(yùn)輸車"1.作

用

：將外源基因送入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制2.種類：質(zhì)粒

、噬菌體、動植物病毒等利用病毒對宿主細(xì)胞的侵染性

擬

核DNA

質(zhì)

粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于真

核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙

鏈DNA。>真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。目的基因

插入位點(diǎn)-復(fù)制原點(diǎn)▲

大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖氨芐青霉素-

抗性基因大腸桿菌細(xì)胞基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——"分子運(yùn)輸車"3.載體需具備的條件：(1)有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)

(便于插入目的基因)(2)能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存

(使目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)增)(3)具有特殊的標(biāo)記基因(便于重組DNA

分子的篩選/將含有目的基因的

受體細(xì)胞篩選出來)(4)對受體細(xì)胞無害、易分離

(避免受體細(xì)胞受到損傷)自我復(fù)制，或整合到受體DNA

上，隨受體DNA

同步復(fù)制1.若用家蠶作為某基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用噬菌體作為載體，其原因是什么?噬菌體的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，而不是家蠶。2.根據(jù)標(biāo)記基因的作用，有同學(xué)認(rèn)為在含有某種抗生素的培養(yǎng)基中篩選存活的受體細(xì)胞不一定是導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞，這種說法是否合理?并說明理由?合理，因?yàn)閮H導(dǎo)入載體的和導(dǎo)入插入了目的基因的載體的受體細(xì)胞均能在該培養(yǎng)基中存活

。分析載體的種類和載體需具備的條件載體上的標(biāo)記基因一

般是某種抗生素的抗性基因，而受體細(xì)胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)

表達(dá)，受體細(xì)胞對該抗生素產(chǎn)生抗性。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是

被導(dǎo)入了載體的受體細(xì)胞。如圖所示：在含有氨芐進(jìn)入受

青霉素的培Amp2

體細(xì)胞

養(yǎng)基上培養(yǎng)歸納：標(biāo)記基因的篩選原理只有含有載體，并

且載體上的抗性基

因表達(dá)的大腸桿菌才能存活并增殖含有氨芐青霉素

抗性基因的載體

(如質(zhì)粒)大腸桿菌中有的

有載體進(jìn)入，有的沒有載體進(jìn)入目的基因LacZ

基因表達(dá)產(chǎn)生的β-半乳糖甘酶能夠分解

X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，從而使菌落呈藍(lán)色；否則菌落呈白色。請分析下列3種大腸桿菌在含

X-gal

和青霉素的固

體培養(yǎng)基上的存活情況及菌落顏色。歸納：標(biāo)記基因的篩選原理>標(biāo)記基因進(jìn)行篩選重組DNA

分子舉例氨芐青霉素

抗性基因存活；藍(lán)色存活；白色無法存活lacZ

基因思考

·

討論

重組DNA

分子5'-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3'3'-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5'5'-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3'3'-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5'討論：1.剪刀和透明膠帶分別代表哪種“分子工具”?2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配

對?如果不能，可能是什么原因造成的?3.你插入的DNA

片段能稱得上一個(gè)基因

嗎?請你在上述序列中找到EcoR

I

的識別序列和切割位點(diǎn)。然后，用剪刀進(jìn)行

“切割”。待切割位點(diǎn)全部切開后，將

從下面那條DNA

鏈上切下的片段重組到

上面那條DNA

鏈的切口處，并用透明膠

帶將切口粘起來。5'-

TCCTAG

-3'5'-AATTCTCGGTATG-3'5'-AATTCCATAC-3'3'-AGGATCTTAA-5'3'-GAGCCATACTTAA-5'3'-GGTATG-5'5'-

ATAGCATGCTATCCATGAATTCTCGGTATGAATTCGGCATAC-3'3'-

TATCGTACGATAGGTACTTAAGAGCCATACTTAAGCCGTATG-5'個(gè)個(gè)膠帶

膠帶5'-ATAGCATGCTATCCATG-3'3'-TATCGTACGATAGGTACTTAA-5'思考

·討論

重組DNA

分子5'-AATTCGGCATAC-3'3'-GCCGTATG-5'1.實(shí)驗(yàn)思路：裂解細(xì)胞使核酸分子釋放出來從釋放出來的細(xì)胞成分中分離核酸分子純化獲得核酸分子探究

·

實(shí)踐

DNA

的粗提取與鑒定2.實(shí)驗(yàn)原理：(

1

)

提

取

DNA

的原理：

DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存

在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法

對它們進(jìn)行提取。>DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精>DNA

在不同濃度的NaCl

溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L

的

NaCl

溶液>

初步分離DNA

和蛋白質(zhì)DNA

溶解度溶解

DNAo

0.14NaCl

濃度(mol/L)探究

·

實(shí)踐

DNA

的粗提取與鑒定(

2

)

鑒

定DNA

的原理：在一定溫度下，DNA

遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色。3.材料用具：(

1

)

選

材

：DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等

。注意：不能選擇哺乳動物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯游锍墒斓募t細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含

DNA。(2)試劑：①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③

2mol/L的NaCl

溶液④

二苯胺試劑⑤

蒸餾水探究

·實(shí)踐

DNA

的粗提取與鑒定→

提取、溶解DNA→

析出D

NA→

溶

解DNA→

鑒

定DNA

(要現(xiàn)配現(xiàn))4.方法步驟：取材、研磨

稱取30g

洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL

研磨液，充分研磨。>

研

磨

目

的

：破碎細(xì)胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中。探究

·

實(shí)踐

DNA

的粗提取與鑒定研磨洋蔥方法一：在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，

在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。方法二：直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速

下離心5min,再取上清液放入燒杯中。>思考：①上清液中除DNA

之外，可能含有哪些雜質(zhì)?可能含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)②低溫放置幾分鐘有什么作用?抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA

降解；抑制DNA

分子運(yùn)動，使DNA

易形成沉淀析出。4.方法步驟：取材、研磨過濾或離心探究

·

實(shí)踐

DNA

的粗提取與鑒定方法一：在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%),靜置2-3min,溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA

。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；>

思考：①攪拌時(shí)應(yīng)輕緩、并沿一個(gè)方向?減少DNA

斷裂，以便獲得較完整的DNA

分子②酒精預(yù)冷的作用?低溫可抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA

降解；

用冷卻的酒精析出DNA

低溫抑制DNA

分子運(yùn)動，使DNA

易形成沉淀析出；低溫有利于增加DNA

的柔韌性，減少斷裂。方法二：將溶液倒入塑料離心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離