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植物生理生化實(shí)驗(yàn)

劉永軍郭守華楊曉玲主編

河北科技師范學(xué)院

2003年8月

編寫(xiě)人員名單

主編劉永軍郭守華楊曉玲

副主編楊晴于鳳鳴

編者（按姓氏筆劃排序）

于鳳鳴劉永軍楊曉玲

楊晴孟憲東郭學(xué)民

郭守華徐興友

主審宋金耀白寶璋

?2?

-XX.—1—

刖百

本教材是國(guó)家教委教育師范司委托中國(guó)職業(yè)技術(shù)教育學(xué)會(huì)高等農(nóng)業(yè)技術(shù)師范教育工

作委員會(huì)編寫(xiě)的系列教材之一《植物生理生化》的配套教材。

本教材的適用范圍是農(nóng)業(yè)院校中以植物為研究對(duì)象的專(zhuān)業(yè)及開(kāi)設(shè)植物生理生化課的

其他專(zhuān)業(yè)。

本教材的內(nèi)容分為三部分。

第一篇為實(shí)驗(yàn)理論部分。包括取樣與處理、層析技術(shù)、離心技術(shù)、電泳技術(shù)、分光光

度技術(shù)、電化學(xué)分析技術(shù)、免疫化學(xué)技術(shù)等。這一部分之所以占有較大篇幅，是為了適應(yīng)

多數(shù)院校已將“植物生理生化實(shí)驗(yàn)”作為獨(dú)立開(kāi)設(shè)的課程，有必要加深學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)基本理

論的理解，真正提高學(xué)生在實(shí)驗(yàn)室工作中分析問(wèn)題、解決問(wèn)題的能力，并培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?/p>

科學(xué)態(tài)度。

第二篇為實(shí)驗(yàn)技術(shù)部分。共收錄植物生理生化實(shí)驗(yàn)38項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的選擇依據(jù)有三:

一是以研究性實(shí)驗(yàn)內(nèi)容為主，以驗(yàn)證性?xún)?nèi)容為輔；二是同一實(shí)驗(yàn)內(nèi)容在盡量選擇新的實(shí)驗(yàn)

方法的同時(shí)，考慮不同條件院校的實(shí)驗(yàn)條件，也容納了較傳統(tǒng)的、實(shí)用的、能夠保證實(shí)驗(yàn)

效果的實(shí)驗(yàn)方法；三是基本上能夠滿(mǎn)足本科學(xué)生在校期間及畢業(yè)之后從事農(nóng)林科研工作的

需要，并為繼續(xù)深造打下必要的實(shí)驗(yàn)技能基礎(chǔ)。

第三篇為附錄部分。除了一般實(shí)驗(yàn)教材中都有的常用附表之外，將常用儀器的使用及

注意事項(xiàng)單獨(dú)列出，尤其是根據(jù)多年教學(xué)體會(huì)，以例題的方式編寫(xiě)了常用試劑的配制及計(jì)

算方法。

本教材的主要特點(diǎn)是可操作性強(qiáng)。教材編寫(xiě)人員在多年的植物生理生化實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，

對(duì)實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)過(guò)程及關(guān)鍵環(huán)節(jié)做出了很多調(diào)整和改進(jìn)，使之更合理、更簡(jiǎn)便、更符合

實(shí)驗(yàn)要求。在此基礎(chǔ)上，本教材力求達(dá)到這樣的效果：學(xué)生能夠根據(jù)專(zhuān)業(yè)特點(diǎn)和實(shí)際問(wèn)題

自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并依據(jù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的要求獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)，盡量減少對(duì)教師的依賴(lài)。

本書(shū)初稿完成后，由宋金耀、白寶璋先生審閱了全稿，并提出了很好的修改意見(jiàn)。籍

此書(shū)出版之際，深表謝意。

盡管編寫(xiě)的初衷和追求是好的，但由于編寫(xiě)人員水平所限，疏漏不足之處在所難免，

在此懇請(qǐng)同行專(zhuān)家及使用這本教材的廣大師生批評(píng)指正。

編者

2003年8月

目錄

第一篇植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理(1)

第一章取樣與樣品處理(1)

一、植物材料的種類(lèi)(1)

二、植物材料的采取(1)

三、分析樣品的前處理和保存(2)

四、待測(cè)組分的提取、分離和純化技術(shù)(3)

五、樣品中待測(cè)組分的測(cè)定(5)

第二章層析技術(shù)(6

一、發(fā)展簡(jiǎn)史(6)

二、層析法分類(lèi)(7)

三、層析原理(8)

四、分配層析(9)

五、吸附層析(12)

六、凝膠層析(14)

七、離子交換層析(16)

八、呆和層析(17)

九、高效液相色譜(19)

十、氣相色譜(20)

十一、層析技術(shù)的應(yīng)用(21)

第三章離心技術(shù)(23)

一、基本原理(23)

二、離心機(jī)的類(lèi)型及主要構(gòu)造(24)

三、常用離心技術(shù)(26)

四、分析性超速離心技術(shù)的應(yīng)用(27)

第四章電泳技術(shù)(28)

一、電泳的分類(lèi)(29)

二、電泳基本原理(30)

三、影響遷移率的主要因素(31)

四、凝膠電泳(32)

?4?

五、電泳的應(yīng)用(44)

第五章分光光度技術(shù)(45)

一、紫外光和可見(jiàn)光分光光度法(46)

二、原子吸收分光光度法(50)

三、火焰光度法(52)

四、熒光分光光度法(54)

第六章電化學(xué)分析技術(shù)(56)

?、電化學(xué)分析技術(shù)的類(lèi)型及其基本原理(56)

二、電化學(xué)分析技術(shù)的應(yīng)用(58)

第七章免疫化學(xué)技術(shù)一酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)(59)

?、ELISA的原理(59)

二、設(shè)計(jì)和合成特定的免疫原(59)

三、抗體的制備(60)

四、標(biāo)記抗原的制備(61)

五、ELISA測(cè)定程序的設(shè)計(jì)(61)

第二篇植物生理生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)(62)

實(shí)驗(yàn)1應(yīng)用紙層析分離鑒定氨基酸(62)

實(shí)驗(yàn)2植物組織中游離氨基酸總量的測(cè)定(64)

實(shí)驗(yàn)3谷物種子中賴(lài)氨酸含量的測(cè)定(66)

M三酮溶液顯色法(66)

染料結(jié)合(DBL)法(68)

三硝基苯磺酸(TNBS)法(71)

實(shí)驗(yàn)4谷物種子中色氨酸含量的測(cè)定(73)

二羥基乙酸鹽法(73)

對(duì)二甲氨基苯甲醛(PDAB)法(74)

熒光法(75)

實(shí)驗(yàn)5植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測(cè)定(76)

酸性苗三酮法(76)

磺基水楊酸法(77)

實(shí)驗(yàn)6蛋白質(zhì)含量的測(cè)定(79)

改良雙縮胭法(79)

斐林(Folin)一酚法(80)

考馬斯亮藍(lán)G-250染色法（81）

紫外吸收（UV）法（82）

實(shí)驗(yàn)7谷物種子中蛋白質(zhì)的提取與分離（83）

實(shí)驗(yàn)8酵母核糖核酸的提制（85）

實(shí)驗(yàn)9酵母核糖核酸含量的測(cè)定（86）

實(shí)驗(yàn)10酶的基本性質(zhì)（88）

實(shí)驗(yàn)11植物組織中轉(zhuǎn)化酶活性的測(cè)定（93）

實(shí)驗(yàn)12植物組織中淀粉酶的活力測(cè)定（95）

實(shí)驗(yàn)13植物組織中轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定（97）

實(shí)驗(yàn)14植物同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳（99）

實(shí)驗(yàn)15植物細(xì)胞的質(zhì)壁分離及其復(fù)原（104）

實(shí)驗(yàn)16植物組織水勢(shì)測(cè)定（105）

小液流法（105）

折射儀法（107）

壓力室法（109）

實(shí)驗(yàn)17植物組織中自由水與束縛水含量的測(cè)定（110）

實(shí)驗(yàn)18根系活力的測(cè)定（111）

a一蔡胺氧化法（111）

TTC比色法（H2）

實(shí)驗(yàn)19植物組織中硝酸還原酶活性的測(cè)定（114）

實(shí)驗(yàn)20葉綠體色素的提取、分離及理化性質(zhì)鑒定（116）

實(shí)驗(yàn)21光合色素含量的測(cè)定（117）

實(shí)驗(yàn)22植物光合速率的測(cè)定（118）

改良半葉法（119）

氧電極法（120）

實(shí)驗(yàn)23呼吸速率的測(cè)定（123）

小籃子法（123）

氧電極法（124）

實(shí)驗(yàn)24植物組織中過(guò)氧化氫含量測(cè)定（125）

實(shí)驗(yàn)25還原糠和總糖含量的測(cè)定（126）

實(shí)驗(yàn)26可溶性糖含量的測(cè)定（128）

實(shí)驗(yàn)27粗脂肪的測(cè)定（130）

油重法（130）

,6,

殘余法（131）

實(shí)驗(yàn)28維生素C含量的測(cè)定（132）

滴定法（132）

二甲苯萃取比色法（134）

2,4一二硝基苯朋比色法（135）

熒光法（136）

實(shí)驗(yàn)29花色素含量的測(cè)定（138）

實(shí)驗(yàn)30激動(dòng)素對(duì)葉片的保綠作用（138）

實(shí)驗(yàn)31酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定植物激素含量（140）

實(shí)驗(yàn)32種子生活力快速測(cè)定（142）

紅墨水染色法（142）

BTB變色法（143）

TTC顯色法（143）

熒光法（145）

實(shí)驗(yàn)33過(guò)氧化氫酶的活性測(cè)定（145）

高鈦酸鉀滴定法（145）

紫外吸收法（146）

實(shí)驗(yàn)34植物組織中過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定（147）

聯(lián)苯胺比色法（148）

愈創(chuàng)木酚比色法（149）

實(shí)驗(yàn)35植物組織中超氧化物歧化酶活性的測(cè)定（150）

實(shí)驗(yàn)36植物組織中多酚氧化酶活性的測(cè)定（152）

比色法（152）

氧電極法（153）

實(shí)驗(yàn)37植物組織中酚類(lèi)物質(zhì)含量的測(cè)定（154）

實(shí)驗(yàn)38植物組織中丙二醛含量的測(cè)定（155）

實(shí)驗(yàn)39植物細(xì)胞差別透性的測(cè)定（156）

實(shí)驗(yàn)40植物組織P0D的提取分離純化與鑒定（165）

附錄（169）

附錄1實(shí)驗(yàn)室基本知識(shí)（169）

附錄2常用儀器的使用（175）

附錄3試劑配制的基本知識(shí)（187）

附錄4常用數(shù)據(jù)表（199）

參考文獻(xiàn)（206）

第一篇植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理

第一章取樣與樣品處理

一、植物材料的種類(lèi)

植物生理生化實(shí)驗(yàn)（plantphysiologicalbiochemicalexperiment）使用的材料非

常廣泛，根據(jù)來(lái)源可劃分為天然的植物材料（如植物幼苗、根、莖、葉、花等器官或組織

等）和人工培養(yǎng)、選育的植物材料（如雜交種、誘導(dǎo)突變種、植物組織培養(yǎng)突變型細(xì)胞、

愈傷組織、酵母等）兩大類(lèi)；按其水分狀況、生理狀態(tài)可劃分為新鮮植物材料（如蘋(píng)果、

梨、桃果肉，蔬菜葉片，綠豆、豌豆芽下胚軸，麥芽、谷芽，鱗莖、花椰菜等）和干材料

（小麥面粉，玉米粉，大豆粉，根、莖、葉干粉，干酵母等）兩大類(lèi)。一般應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

的和條件不同而加以選擇。

二、植物材料的采取

植物材料生理生化分析的準(zhǔn)確性，在很大程度上取決于植物材料的采取是否具有最大

的代表性。為了保證植物材料的代表性，必須運(yùn)用科學(xué)方法采取材料。從大田或?qū)嶒?yàn)地、

實(shí)驗(yàn)器皿中采取的植物材料，--般數(shù)量較大，稱(chēng)為“原始樣品”。進(jìn)行分析之前，應(yīng)首先按

原始樣品的種類(lèi)（如植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等）分別選出“平均樣品”，再根

據(jù)分析的目的、要求和樣品種類(lèi)的特征，采用適當(dāng)?shù)姆椒?，從“平均樣品”中選出供分析

用的“分析樣品”。

1.原始樣品的取樣法

（1）隨機(jī)取樣：在試驗(yàn)區(qū)（或大田）中選擇有代表性的取樣點(diǎn)，取樣點(diǎn)的數(shù)目視田塊

的大小而定。選好點(diǎn)后，隨機(jī)采取一定數(shù)量的樣株，或在每一個(gè)取樣點(diǎn)上按規(guī)定的面積從

中采取樣株。

（2）對(duì)角線(xiàn)取樣：在試驗(yàn)區(qū)（或大田）可按對(duì)?角線(xiàn)選定5個(gè)取樣點(diǎn)，然后在每個(gè)點(diǎn)上

隨機(jī)取一定數(shù)量的樣株，或在每個(gè)取樣點(diǎn)上按規(guī)定的面積從中采取樣株。

2.平均樣品的采取法

（1）混合取樣法：一般顆粒狀（如種子等）或粉末狀樣品可以采取混合取樣法進(jìn)行。

具體的做法為：將供采取樣品的材料鋪在木板（或玻板、牛皮紙）上成為均勻的一層，按

照對(duì)角線(xiàn)劃分為四等分。取對(duì)角的兩份為進(jìn)一步取樣的材料，而將其余的對(duì)角兩份淘汰。

再把已取中的兩份樣品充分混合后重復(fù)上述方法取樣。反復(fù)操作，每次均淘汰50%的樣品，

直至所取樣品達(dá)到所要求的數(shù)量為止。這種取樣的方法叫做“四分法”。經(jīng)過(guò)四分法的反復(fù)

混合、淘汰所取得的樣品，在實(shí)驗(yàn)室中再經(jīng)適當(dāng)?shù)奶幚碇蠹纯芍瞥煞治鰳悠贰Ｒ话愫坦?/p>

?8?

類(lèi)、豆類(lèi)及油料作物的種子均可采用這個(gè)方法采取平均樣品，但應(yīng)注意樣品中不要混有破

損、蟲(chóng)噬或不成熟的種子及其他混雜物。

(2)按比例取樣法：對(duì)體積較大、生長(zhǎng)不均等的材料，如甘薯、甜菜、馬鈴薯等塊根、

塊莖材料，應(yīng)按原始樣品大、中、小不同類(lèi)型的比例取樣，然后再將每一單個(gè)樣品縱切剖

開(kāi)，每個(gè)切取1/4、1/8或1/16,混在一起組成平均樣品。

在采取桃、梨、蘋(píng)果、柑橘等果實(shí)的平均樣品時(shí)，即使是從同一株果樹(shù)上取樣，也應(yīng)

考慮到果枝在樹(shù)冠上的各個(gè)不同方位和部位以及果實(shí)的大小和成熟度上的差異，按各相關(guān)

的比例取樣混合成平均樣品。

3.取樣注意事項(xiàng)

(1)取樣的地點(diǎn)。一般在距山城或地邊一定距離的株行取樣，或在特定的取樣區(qū)內(nèi)取

樣。為避免邊際效應(yīng)的影響，勿在邊行或靠近邊行取樣，取樣點(diǎn)的四周也不應(yīng)有缺株現(xiàn)象。

(2)取樣后，按分析的目的分成各部分(如根、莖、葉、果實(shí)等)，然后捆齊，并附

上標(biāo)簽，裝入紙袋。有些多汁果實(shí)取樣時(shí)，應(yīng)用鋒利不銹鋼刀子，并注意勿使果汁流失。

(3)對(duì)于多汁的瓜、果、蔬菜及幼嫩器官等樣品，因含水分較多，容易變質(zhì)或霉?fàn)€,

可以在冰箱中冷藏，或進(jìn)行滅菌處理或烘干以供分析之用。

(4)選取平均樣品的數(shù)量應(yīng)當(dāng)不少于供分析用樣品的兩倍。

(5)為了動(dòng)態(tài)地了解供試驗(yàn)用的植物在不同生育期的生理狀況，常按植物不同的生

育期采取樣品進(jìn)行分析。取樣方法系在植物的不同生育時(shí)期先調(diào)查植株的生育狀況并區(qū)分

為若干類(lèi)型，計(jì)算出各種類(lèi)型株所占的百分比，再按此比例采取相應(yīng)數(shù)目的樣株作為平均

樣品。

三、分析樣品的前處理和保存

1.種子樣品的前處理和保存

一般作物種子(如禾谷類(lèi))的平均樣品清除雜質(zhì)后要進(jìn)行磨碎，如條件許可最好用電

動(dòng)磨粉機(jī)，在磨碎樣品前后都應(yīng)當(dāng)使磨粉機(jī)(或其他碾磨用具)的內(nèi)部十分清潔，最初磨

出的少量樣品可以棄去不要，然后正式磨碎，使樣品全部無(wú)損地通過(guò)80?100目篩孔的篩

子，混合均勻，作為分析樣品貯存于具有磨口玻塞的廣口瓶中，并隨即貼上標(biāo)簽，注明樣

品的采取地點(diǎn)、試驗(yàn)處理、采樣日期和采樣人姓名等。長(zhǎng)期保存的樣品，在其貯存瓶上的

標(biāo)簽還需要涂蠟。為了防止樣品在貯存期間生蟲(chóng)，可在瓶中放置一點(diǎn)樟腦或?qū)ξ欢燃妆健?/p>

油料作物種子(如芝麻、亞麻、花生、潼麻等)如需要測(cè)定其含油量時(shí)，不應(yīng)當(dāng)用磨

粉機(jī)磨碎，否則樣品中所含的油分吸附在磨粉機(jī)上將明顯地影響分析的準(zhǔn)確性。所以，應(yīng)

將少量油料種子樣品放在研缽磨碎或用切片機(jī)切成薄片作為分析樣品。

2.莖葉樣品的前處理和保存

采回的新鮮樣品(平均樣品)，在做分析之前，一般先要經(jīng)過(guò)凈化、殺青、烘干(或風(fēng)

干)等一系列前處理(pretreatment)。

(1)凈化。新鮮樣品從田間或試驗(yàn)地取回時(shí)，常沾有泥土等雜質(zhì)，應(yīng)用柔軟濕布擦凈,

不應(yīng)用水沖洗。

(2)殺青。為了保持樣品化學(xué)成分不發(fā)生轉(zhuǎn)變和損耗，務(wù)必及時(shí)終止樣品中前的活動(dòng),

這就需要將樣品置于105℃的烘箱中殺青15?20min。

（3）烘干。樣品經(jīng)過(guò)殺青之后，應(yīng)立即降低烘箱的溫度，維持在70?80℃,直到烘

至恒重。烘干所需的時(shí)間因樣品數(shù)量和含水量、烘箱的容積和通風(fēng)性能而定。烘干時(shí)應(yīng)注

意溫度不能過(guò)高，否則會(huì)把樣品烤焦，特別是含糖較多的樣品，更易在高溫下焦化。為了

更精密地分析，避免某些成分的損失（如蛋白質(zhì)、維生素、糖等），在條件許可的情況下最

好采用真空干燥法。

已經(jīng)烘干（或風(fēng)干）的莖葉樣品，均要進(jìn)行磨碎，磨莖葉用的粉碎機(jī)與磨種子的磨粉

機(jī)的結(jié)構(gòu)不同，不宜用磨種子的電磨來(lái)代替。如果莖葉樣品中的水分偏高而不利于磨碎時(shí),

那就需要進(jìn)一步烘干之后再磨碎。磨碎后樣品的保存方法均與上相同。

此外，在測(cè)定植物材料中酶的活性或某些成分（如維生素C、DNA、RNA等）的含量時(shí),

需要用新鮮樣品。取樣時(shí)注意保鮮，取樣后應(yīng)立即進(jìn)行待測(cè)組分提?。阂部刹捎靡旱鋬?/p>

保存或冰凍真空干燥法得到干燥的制品，放在0?4c冰箱中保存即可。在鮮樣已進(jìn)行了勻

漿，尚未完成提取、純化，不能進(jìn)行分析測(cè)定等特殊情況下，也可加入防腐劑（甲苯、苯

甲酸），以液態(tài)保存在緩沖液中，置于0?4c冰箱即可。但保存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

四、待測(cè)組分的提取、分離和純化技術(shù)

1.待測(cè)組分的提取

上述烘干（風(fēng)干）的、冰凍的或是新鮮的樣品置于一定的溶劑（提取液）中，用電動(dòng)

搗碎機(jī)或研缽破碎后，樣品混合液內(nèi)含有各種待測(cè)組分。由于待測(cè)組分的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)不同，

與其他細(xì)胞組分的結(jié)合強(qiáng)度及在提取液中的溶解程度有差異，因而不同待測(cè)組分的提取液

性質(zhì)、成分和操作條件都有很大差別。

對(duì)于像色素、植物激素、氨基酸、可溶性糖、有機(jī)酸等小分子物質(zhì)的提取，首要的是

選擇適當(dāng)性質(zhì)的溶劑。?般而言，極性的（親水的）待測(cè)組分易溶于極性溶劑中，非極性

的（親脂的）待測(cè)組分易溶于非極性的有機(jī)溶劑中。提取液的pH影響待測(cè)組分的解離狀態(tài)

及其活性和穩(wěn)定性，不可忽視。例如葉綠素可以用95%乙醇或丙酮溶液提取，脫落酸、赤

霉素可用丙酮、甲醇溶液提取，還原糖可用蒸儲(chǔ)水提取，維生素C可用2%草酸溶液提取。

兩性物質(zhì)氨基酸在等電點(diǎn)以外的任何pH溶液中都是呈解離態(tài)，一般可用10%乙酸提取。

為了使待測(cè)組分能更快、更充分地從其他細(xì)胞組分中分離出來(lái)，可以采用電爐加熱、煮沸、

恒溫水浴保溫、劇烈攪拌或振蕩等，這樣就可以使待測(cè)組分最大限度地存在于提取液中，

再經(jīng)過(guò)離心或過(guò)濾除去殘?jiān)?，即可得到較理想的粗提液。

對(duì)于像核酸、蛋白質(zhì)及酶等生物大分子的提取則要相對(duì)復(fù)雜一些。一般情況下，堿性

生物大分子物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性生物大分子物質(zhì)易溶于堿性溶劑。山于不同蛋白質(zhì)

分子中，含有不同比例的極性基團(tuán)與非極性基團(tuán)，氨基酸排列順序有很大差別，因此，提

取蛋白質(zhì)時(shí)，要根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)溶解性質(zhì)、等電點(diǎn)等因素配制不同的蛋白質(zhì)提取液。一

般而言，蛋白質(zhì)提取液以水為主，再加少量酸、堿或鹽組成，這樣可以通過(guò)少量離子的作

用，減少蛋白質(zhì)分子極性基團(tuán)之間的靜電引力，加強(qiáng)蛋白質(zhì)與提取液之間的相互作用，從

而提高其溶解性。緩沖溶液的pH應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)的兩側(cè)，使蛋白質(zhì)分子帶上凈電荷,

以提高其溶解度。對(duì)于某些與脂質(zhì)結(jié)合得比較牢固的蛋白質(zhì)復(fù)合體或含脂肪族氨基酸較多

的蛋白質(zhì)，疏水性強(qiáng)，則需要在微堿性提取液中加入一定濃度的表面活性劑，如十二烷基

硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate,SDS）或高濃度的有機(jī)溶劑（如70%?80%的乙醇）。

在提取酶時(shí)，一定要在冰浴上或低溫室內(nèi)操作。其提取液應(yīng)為偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH

?10?

緩沖液，離子強(qiáng)度適中，以維持酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。此外，還應(yīng)加入適量的筑基乙醉和聚乙烯

毗咯烷酮(PVP),以防止酶分子中的筑基氧化和樣品中的酚氧化。重金屬離子的絡(luò)合劑乙

二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)也是提取液中常用的成分之一，

以防酶變性失活。為防止酶蛋白在分離過(guò)程中發(fā)生降解，還需加入蛋白酶抑制劑。

對(duì)核酸的提取方法有多種。提取核酸時(shí)常采用鹽溶法，即根據(jù)DNA核蛋白易溶于高鹽

(1?2moi?L1NaCl溶液，難溶于低鹽(0.14mol?L1NaCl)溶液，而RNA核蛋白則易溶

于低鹽(0.14molNaCl)溶液這一原理進(jìn)行提取的。對(duì)RNA和DNA的分離(separation)

也可根據(jù)RNA易被堿解，DNA易被酸解的性質(zhì)進(jìn)行。在提取植物組織中的DNA時(shí)，常用液

氮凍融法改善勻漿效果，縮短勻漿時(shí)間，并具有抑制DNase活性的效果。勻漿緩沖液中加

入浸化乙錠，可顯著提高DNA的純度(purity)和相對(duì)分子質(zhì)量(molecularweight)。

2.待測(cè)組分的分離純化

在一般的生理生化分析中，如果待測(cè)組分與分析試劑(如顯色劑、氧化還原劑)反應(yīng)

的專(zhuān)一性程度高，受其他雜質(zhì)的干擾少，則不需要進(jìn)一步純化(purification)。但在制備

性生化實(shí)驗(yàn)中，必須采用一系列生化分離純化技術(shù)，除去粗提取液中的雜質(zhì)(異類(lèi)物質(zhì)和

同類(lèi)物質(zhì))，以制成高純品。常用的生化分離純化技術(shù)有：鹽析技術(shù)、離心技術(shù)、電泳技術(shù)、

層析技術(shù)等，這里重點(diǎn)介紹鹽析技術(shù)和透析技術(shù)。

(1)鹽析：向含有待測(cè)組分的粗提取液中加入高濃度中性鹽達(dá)到一定的飽和度，使待

測(cè)組分沉淀析出的過(guò)程稱(chēng)為鹽析(saltingout)o蛋白質(zhì)、酶、多糖、核酸等都可應(yīng)用鹽

析技術(shù)進(jìn)行沉淀分離。但該技術(shù)在蛋白質(zhì)或酶的分離純化中應(yīng)用最廣泛，它是一種山提取

到分離純化的銜接技術(shù)。其原理是，蛋白質(zhì)或酶分子的穩(wěn)定因素一靠電荷，二靠水膜；而

當(dāng)溶液中的中性鹽濃度增至一定的程度時(shí)，蛋白質(zhì)分子表面電荷被中和，包圍蛋白質(zhì)分子

的水膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子溶解度下降，而凝聚析出。

在鹽析中使用的中性鹽種類(lèi)很多，如硫酸鍍、硫酸鎂、氯化鈉、醋酸鈉等。最常用的

中性鹽是硫酸筱，它的溶解度大，受溫度影響小，不易引起蛋白質(zhì)變性，價(jià)格便宜。在使

用硫酸鏤進(jìn)行蛋白質(zhì)鹽析時(shí)，要選用純度較高的或重結(jié)晶的硫酸鍍。硫酸鍍的濃度常用飽

和度表示，達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)的硫酸核飽和度為100%。不同的硫酸筱飽和度可用加入固體

鹽法、加入飽和溶液法及透析平衡法任意調(diào)節(jié)。不同濃度的蛋白質(zhì)溶液，使用硫酸鏤的飽

和度范圍是有差別的。蛋白質(zhì)濃度較高時(shí)，需硫酸鏤量較少；蛋白質(zhì)濃度較低時(shí)，需硫酸

錢(qián)量較多。在具體進(jìn)行鹽析時(shí)，因制備階段不同，其操作方法有差異。一般在制備早期，

應(yīng)保持一定的pH和溫度，而改變離子強(qiáng)度(鹽濃度)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分步分離。在制備后期,

分離純化及結(jié)晶階段，則往往保持一定的離子強(qiáng)度，而改變pH和溫度。為保證實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)

性好，對(duì)鹽析的條件如pH、溫度和硫酸鏤的純度、用量都必須嚴(yán)加控制。鹽析后放置0.5?

lh,沉淀完全后，可采用離心法或過(guò)濾法進(jìn)行固液分離。

(2)透析：透析(dialysis)是膜分離技術(shù)的一種，用于分離大小不同的分子。透析

膜只允許小分子通過(guò)，而阻止大分子通過(guò)。鹽析得到的蛋白質(zhì)沉淀，用緩沖液懸浮，裝入

透析袋內(nèi)進(jìn)行脫鹽，可以除去硫酸鏤等鹽類(lèi)。具體方法是，把盛有蛋白質(zhì)溶液的透析袋兩

端系緊，懸掛在裝有緩沖液的三角瓶中，置于磁力攪拌器上，在低溫(4C左右)條件下透

析30?36h,由于透析袋只允許小分子鹽類(lèi)透過(guò)，而蛋白質(zhì)大分子不能逸出膜外，經(jīng)多次

更換透析外液，不斷降低膜外液中小分子鹽類(lèi)的濃度，即可將混雜于蛋白質(zhì)大分子中的鹽

類(lèi)等雜質(zhì)透析掉。在透析時(shí)，要選用透析速度快、透性界限明確的透析袋。

3.濃縮與干燥

（1）濃縮：通過(guò)對(duì)水或溶劑的吸收和透析等方法使低濃度溶液變?yōu)楦邼舛热芤旱倪^(guò)程

稱(chēng)為濃縮。

濃縮的方法很多，如加熱蒸發(fā)、加沉淀劑、離子交換法、吸收法、減壓濃縮法、膜濃

縮法、親和層析法等。在實(shí)驗(yàn)室中最常用的是吸收濃縮法，即通過(guò)向溶液中投入吸收劑（如

聚乙二醇、聚丙烯酰胺干凝膠等），直接吸收溶液中的水分，使溶液濃縮的方法。在使用吸

收劑時(shí)，也可先將生物大分子溶液裝入透析袋里，扎緊袋口，外加聚乙二醇覆蓋，袋內(nèi)水

分滲出，即被聚乙二醇迅速吸收而被濃縮，可稱(chēng)為高滲透析法，兼有脫鹽效果。其次是超

濾法，是指使用種特制的薄膜對(duì)溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過(guò)濾的方法。應(yīng)用超濾

法，關(guān)鍵在于濾膜的類(lèi)型、規(guī)格的選擇。該法除濃縮、脫鹽外，還可應(yīng)用于生物大分子的

分離純化，如進(jìn)行多成分提取液的分離時(shí)，可先用超濾器分組，再進(jìn)行柱層析，可將多種

待測(cè)組分分離。

止匕外，還常用減壓濃縮法對(duì)不耐熱的生物大分子及生物制品進(jìn)行濃縮。其原理是通過(guò)

降低液面之上的氣體壓力使液體沸點(diǎn)降低，加快蒸發(fā)。

（2）干燥：就是將潮濕的固體及液體中的水或溶劑清除干凈的過(guò)程。在生化研究中最

常用的干燥方法是真空干燥法（減壓干燥法）和冰凍真空干燥法（升華干燥法）。前者適用

于不耐高溫、易氧化物質(zhì)的干燥和保存，其真空度越高，溶液沸點(diǎn)越低，蒸發(fā)越快；后者

適用于蛋白質(zhì)、酶等各類(lèi)生物大分子的干燥保存，可保持其天然結(jié)構(gòu)與活力。在相同壓力

下，水蒸氣壓力隨溫度的下降而下降，因而在低溫和高度真空下，水分變成固態(tài)冰，冰可

以升華為氣體，并直接被真空泵抽走而得以干燥。

五、樣品中待測(cè)組分的測(cè)定

樣品中待測(cè)組分的測(cè)定可采用化學(xué)分析、物理分析等方法，而現(xiàn)代的植物生理生化實(shí)

驗(yàn)則越來(lái)越多地依賴(lài)于儀器分析方法。但待測(cè)樣品在上機(jī)之前，則要經(jīng)過(guò)一些特異處理，

提供特異的信號(hào)，才能使儀器作出反應(yīng)。如比色技術(shù)、色譜技術(shù)等，多以化學(xué)變化過(guò)程中

待測(cè)組分與試劑反應(yīng)發(fā)生顏色的消長(zhǎng)，通過(guò)儀器檢測(cè)即可得知某組分的含量。其中像苗三

酮比色法測(cè)定氨基酸含量，就是利用氨基酸在酸性條件卜與水合苛三酮作用后能產(chǎn)生二酮

前胺的取代鹽等藍(lán)紫色化合物，在一定范圍內(nèi)，其顏色的深淺與氨基酸的含量成正比。又

如核磁共振技術(shù)、火焰分光光度技術(shù)、熒光光譜技術(shù)、紫外光光譜技術(shù)、紅外光光譜技術(shù)

和旋光分析技術(shù)等，則是基于待測(cè)組分在特定的物理狀態(tài)卜具有相應(yīng)的物理特性而進(jìn)行測(cè)

試的。其中如熒光分析蛋白質(zhì)N-末端氨基酸組成的DNS法，就是利用熒光試劑DNS-C1與

氨基酸在pH10左右的堿性條件下作用形成一類(lèi)稱(chēng)為DNS—氨基酸的衍生物。這類(lèi)衍生物

在254nm或365nm的紫外光下可發(fā)出強(qiáng)烈的黃色熒光，根據(jù)其熒光的強(qiáng)弱即可在紫外分析

儀上檢測(cè)N-末端氨基酸的種類(lèi)。核酸及其衍生物、核甘酸、核甘、喀唾和噪吟均有紫外

光吸收的性質(zhì)，因此，都可以用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量測(cè)定。

在植物生理生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)中，對(duì)同一待測(cè)組分含量可以采用不同的測(cè)定方法。植物組

織水勢(shì)的測(cè)定方法有：小液流法、折光儀法、壓力室法；植物體內(nèi)硝酸還原能活力測(cè)定的

方法有活體法、離體法；植物呼吸速率的測(cè)定方法有紅外線(xiàn)CO2氣體分析儀法、微量呼吸

?12?

檢壓計(jì)（瓦氏呼吸計(jì)）法、氧電極法、小籃子法（廣口瓶法）、氣流法等；植物組織中可溶

性蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法有雙縮胭法、斐林一酚試劑法、凱氏定氮法、考馬斯亮藍(lán)G-250染

色法、紫外吸收法等；植物組織中核酸含量測(cè)定的方法有定磷法、戊糖比色法（苔黑酚法）、

二苯胺試劑法、紫外光吸收法等。在實(shí)際工作中應(yīng)當(dāng)根據(jù)測(cè)試的目的、要求、樣品的特點(diǎn)

以及實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件，選擇合適的方法，制定合理的檢測(cè)實(shí)施方案。

第二章層析技術(shù)

一、發(fā)展簡(jiǎn)史

層析法（chromatography）即色層分析法，又叫層離法、色譜法，是目前廣泛應(yīng)用的

一種分離技術(shù)。在層析法發(fā)現(xiàn)之前，物質(zhì)的分離和純化幾乎都是根據(jù)其揮發(fā)度、溶解度的

不同，用分儲(chǔ)、沉淀、升華和重結(jié)晶等方法進(jìn)行的。但是許多結(jié)構(gòu)相似、揮發(fā)度和溶解度

都十分相近的化合物，用上述經(jīng)典的分離方法很難分離。

1906年，俄國(guó)植物學(xué)家M.Tswett在研究葉綠素時(shí)發(fā)現(xiàn)，

把綠葉的石油酸提取液與CaCOs細(xì)粉混合，則有許多色素

被CaC03吸附。后來(lái)他改變了研究方法，用CaCOs裝了根

柱，讓一定量的綠葉石油酸提取液通過(guò)柱子。他發(fā)現(xiàn)提取

液中的色素被吸附在柱的上端，形成一個(gè)不均一的色帶，

色帶上端呈黃色，色帶下端為綠色，流出液則為不含色素

的石油酸。然后，他再用純的石油酸沖洗柱子，色帶隨石

油酸向下移動(dòng)，并逐漸分離成許多不同的色帶，各色帶間圖1-1綠葉石油醍抽提物的層析譜

是無(wú)色的區(qū)帶（圖IT）。Tswett使用這一技術(shù)證明了植物

1.無(wú)色；2.黃色（葉黃素|3）;3.深橄欖綠

的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素。他將這種方法定色（B葉綠素）；4.深橄欖綠色（a葉綠素）;

名為色層分析法。5.黃色（葉黃素a"6.黃色（葉黃素a'）;

以后的30年中，Tswett的這種方法并未引起人們的7.黃色（葉黃素a）;8.深灰色層（葉綠素類(lèi)）

注意，直到1931年R.Kuhn等人用這種方法把卵黃中的葉

黃素成功地分成黃體素和玉米素兩種成分，層析法才受到人們的重視。以后，許多人對(duì)

Tswett的方法進(jìn)行了一系列的基礎(chǔ)研究工作，發(fā)現(xiàn)了許多新的吸附劑，對(duì)操作方法及裝置

進(jìn)行了一系列的改進(jìn)。在很短的時(shí)間內(nèi)，層析法在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)和無(wú)機(jī)化學(xué)中得到

了較為廣泛的應(yīng)用。作為?種分析分離方法，層析法開(kāi)始成為分析化學(xué)的一個(gè)重要的分支。

1941年，A.J.P.Martin和R.L.M.Synge用含有一定量水的硅膠裝柱，在柱上加入一定

量的氨基酸混合液，用氯仿連續(xù)地沖洗柱子，最后不同的氨基酸被相互分開(kāi)。Martin等人

的這個(gè)方法雖然在操作形式上和Tswett的方法相似，但分離的原理則完全不同。Martin

把這種方法稱(chēng)為分配層析。與此同時(shí),Martin和Synge提出了液一液分配層析的塔板理論,

為層析法建立了牢固的理論基礎(chǔ)。目前塔板理論己被廣泛地用來(lái)闡明氣相層析、離子交換

層析和高效液相層析等層析方法的分離機(jī)理。Martin和Synge的工作使層析法進(jìn)入了一個(gè)

新階段。

1944年，R.Consden、A.H.Gordon和A.J.P.Martin等用濾紙代替硅膠，成功地把各種

不同的氨基酸分離開(kāi)來(lái)，他們稱(chēng)這種方法為紙層析。這個(gè)方法一出現(xiàn)就引起了很大的反響，

它不僅可用于氨基酸的分離，而且糖類(lèi)、肽類(lèi)以及各種抗生素等均可用此法進(jìn)行分離。

1947年美國(guó)原子能委員會(huì)，特別是Boyd等人公布了一系列應(yīng)用離子交換層析分離裂

變產(chǎn)物和稀土元素混合物的論文，引起了人們的極大注意。由于許多化學(xué)家和生物化學(xué)家

的努力，現(xiàn)在離子交換層析法已經(jīng)成為分析、分離各種無(wú)機(jī)離子和有機(jī)離子以及蛋白質(zhì)、

核酸、多糖等大分子物質(zhì)的極其重要的工具。

50年代初期Cremer、James和Martin等關(guān)于氣相層析的工作為層析法開(kāi)辟了一個(gè)新

的園地，他很快在石油、化工、有機(jī)合成、醫(yī)藥和食品等工業(yè)生產(chǎn)及科學(xué)研究上得到了廣

泛的應(yīng)用。目前它已逐漸地形成為一個(gè)專(zhuān)門(mén)的學(xué)科領(lǐng)域"一氣相色譜學(xué)。

六十年代后半期，在氣相層析的啟發(fā)下，人們用增加壓力以提高流速、降低裝填物的

力度和改進(jìn)支持物及固定液的性質(zhì)以提高分離效率的辦法，使得經(jīng)典的液相層析向著快速、

高效的方向發(fā)展，出現(xiàn)了所謂高效液相層析(又稱(chēng)高壓液相色譜或者高速液相色譜)。目前

高效液相色譜在分離速度和分離效率上完全可以和氣相層析相媲美，各種型號(hào)的高效液相

層析儀相繼問(wèn)世，這就使得液相層析成為應(yīng)用范圍更廣泛的一種分析、分離工具。根據(jù)層

析峰的位置及峰高或峰面積，可以定性及定量分析。層析法與光學(xué)、電學(xué)或電化學(xué)儀器聯(lián)

用，例如，氣相層析和質(zhì)譜的聯(lián)用，氣相層析和紅外光譜的聯(lián)用、層析法和電泳的聯(lián)用，

可檢測(cè)出層析后各組份的濃度或質(zhì)量，同時(shí)繪出層析圖?層析儀與電子計(jì)算機(jī)聯(lián)用，可使

操作及數(shù)據(jù)處理自動(dòng)化，大大縮短分析時(shí)間。由于層析法具有分辨率高、靈敏度高、選擇

性好、速度快等特點(diǎn)，因此適用于雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生物樣品

的分離分析。近年來(lái)，已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)常用的分析方法。在醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境

化學(xué)、高分子材料、石油化工等方面也得到了廣泛的應(yīng)用。

二、層析法分類(lèi)

經(jīng)過(guò)近一個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，層析法在堅(jiān)持基本原理的原則下發(fā)展了多種類(lèi)型，也有多種

分類(lèi)方法。

1.按分離原理不同分類(lèi)

吸附層析(absorptionchromatography)：吸附劑為支持物，利用吸附劑裹面對(duì)不同

組分吸附性能的差異，達(dá)到分離鑒定的目的。

分配層析(partitionchromatography)：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配

系數(shù)(或溶解度)不同而使之分離的方法。支持物是硅膠，固定相是水，流動(dòng)相是有機(jī)溶

劑。

離子交換層析(ion-exchangechromatography)：利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力

的不同而進(jìn)行分離的方法。支持物或固定相是一種離子交換劑。

凝膠層析(gelchromatography)：以具有一定孔徑大小的凝膠顆粒作為支持物，利用

某些凝膠對(duì)不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異，進(jìn)行分離的技術(shù)。

親和層析(affinitychromatography)：利用生物分子間親和吸附的特異性不同而進(jìn)

行分離的技術(shù)。專(zhuān)門(mén)用于分離生物大分子。

2.按操作形式不同分類(lèi)

?14?

柱層析(columchromatography)：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿著一個(gè)方向前移而達(dá)

到分離。

薄層層析(thinlayperchromatography)：將適當(dāng)粒度的固定相均勻涂鋪在薄板匕

點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開(kāi)，使各組份分離。

紙層析(paperchromatography)：用濾紙作液體的載體(擔(dān)體support),點(diǎn)樣后用

流動(dòng)相展開(kāi)，使各組份分離。

薄膜層析(thinfilmchromatography)：將適當(dāng)?shù)母叻肿佑袡C(jī)吸附劑制成薄膜，以類(lèi)

似紙層析方法進(jìn)行物質(zhì)的分離。

3.按兩相所處狀態(tài)不同分類(lèi)

液一固層析(liquid-solidchromatography)

液相層析

液一液層析(liquid-liquidchromatography)

氣一固層析(gas-solidchromatography)

氣相層析

氣一液層析(gas-liquidchromatography)

三、層析原理

層析技術(shù)是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別(如吸附力、分子形狀和大小、

分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等)，使各組分以不同程度分布在兩相中(其中一相為固

定的，稱(chēng)固定相；另一相流過(guò)此固定相，稱(chēng)流動(dòng)相)，從而使各組分以不同速度移動(dòng)而達(dá)到

分離，以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離純化或分析研究。

分配系數(shù)(partitioncoefficient)通常被用來(lái)描述一種化合物在互不相溶的兩個(gè)相

中的分配狀況。在一定的溫度下達(dá)到平衡后,化合物在兩相中濃度的比值是一個(gè)常數(shù),用K

表示。

k_在溶劑JA中的濃度_固定相中溶質(zhì)的濃度

八一在溶劑B中的濃度—流動(dòng)相中溶質(zhì)的濃度

但是，一個(gè)化合物的分配不僅可以按它在兩種溶劑中的分配來(lái)描述，而且也可以通過(guò)

它在任何兩個(gè)相中的分配來(lái)描述，如固相一液相或氣相一液相等。因此，如果一種物質(zhì)在

硅酸和苯之間的分配系數(shù)為0.5的，這就是說(shuō)這種物質(zhì)在苯中的濃度是硅酸中的二倍。對(duì)

于層析來(lái)說(shuō)，分配系數(shù)可定義為移動(dòng)相中的濃度除以固定相中的濃度。“有效分配系數(shù)”的

定義是物質(zhì)在一個(gè)相的含量除以在另一個(gè)相中的含量。實(shí)際上是分配系數(shù)乘以?xún)蓚€(gè)相的體

積比。如果一個(gè)化合物在溶劑A和B之間的分配系數(shù)是1,那么，當(dāng)化合物在10mL的A和

1mL的B之間達(dá)到平衡后，在兩個(gè)相中的濃度是相同的,但化合物在A中的總量是B中的

10倍。

分離的原理可以用一個(gè)裝有5cm高固體顆粒的固

定相柱來(lái)描述(圖1-2),固相的周?chē)且苿?dòng)的液相，

每cm的柱中有14mL的液相。如果3211g的化合物在

1mL的溶劑中被加到柱上，由于這1mL的溶劑進(jìn)入柱

而占據(jù)了A的位置，同時(shí)將有1mL的溶劑離開(kāi)柱的底

圖1-2柱層析分離的原理

部。如果被加進(jìn)的化合物的有效分配系數(shù)是1,那么，它在固、液相之間的分配是相等的。

如果再有1mL的溶劑被加到柱上，那么A部分中的溶劑帶著1611g的化合物向下移動(dòng)到B,

留下的16ug在人中。在A和B中化合物發(fā)生再分配，使8ug在溶劑中，8ug在固相中。

再加入1mL溶劑到柱上取代A中的溶劑到B中，并把B中的溶劑取代到C,得到第三階段

中的化合物分配的情況，再加入1mL的溶劑，產(chǎn)生了在第四階段中所表示的情況，再加入

1mL的量便成了第五階段的情況。

很明顯，經(jīng)過(guò)五次平衡后，化合物被分配到

整個(gè)柱中，但是最高的濃度是在柱的中部。如果

化合物的有效分配系數(shù)大于1，那么，50%以上

的化合物在每次平衡后仍留在固相中，濃度的高

峰在柱的中部以上；在另外一種情況下，對(duì)于--

個(gè)有效分配系數(shù)小于1的化合物，在柱內(nèi)移動(dòng)速

度快，濃度的高峰在柱的中部以下。

柱上發(fā)生的平衡次數(shù)越多，在柱的某一位置

上的化合物的濃度就越高，因此，有兩個(gè)重要因

素影響著一個(gè)混合物分離的圖形。一個(gè)化合物通

過(guò)柱展開(kāi)的速度取決于它的有效分配系數(shù)，在柱

上化合物的峰度取決于已發(fā)生的平衡的次數(shù)或者

說(shuō)是柱的理論塔板數(shù)（來(lái)源于工業(yè)上分馀塔的塔

板數(shù)）。實(shí)際匕在一個(gè)柱上平衡是連續(xù)發(fā)生的，因?yàn)槿軇┻B續(xù)不斷地被加入，在一根正常

工作的柱中發(fā)生著數(shù)千次的平衡，平衡次數(shù)越多，柱的分離效率便越高，圖1-3中表示了

的理論塔板數(shù)對(duì)一個(gè)有效分配系數(shù)為1的溶質(zhì)分配的影響。

四、分配層析

（-）原理

分配層析是利用混合物中各組分在兩種或兩種以上不同溶劑中的分配系數(shù)不同而分離

混合物中各組分的方法，相當(dāng)于一種連續(xù)的溶劑抽提方法。如用帶水的材料?（載體）作為

一種液相（固定相），加入與水不相混合或僅有部分混合的溶劑為另一種液相（流動(dòng)相），

則混合物各組分在兩相中發(fā)生不同的分配而逐漸分開(kāi)，形成層析譜。

載體在分配層析中只起負(fù)載固定相的作用，它們是一些吸附力小、反應(yīng)性弱的惰性物

質(zhì)，如淀粉、纖維素粉、濾紙等。固定相除水外，也可用稀硫酸、甲醇、仲酰胺等強(qiáng)極性

溶液。流動(dòng)相則采用比固定相極性小或非極性的有機(jī)溶劑。

紙層析與近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的親和層析、等電聚焦、等速電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等

方法比較，相對(duì)來(lái)說(shuō)是一種“古老”的方■法，但由于操作簡(jiǎn)便，不需要特殊儀器設(shè)備，消

耗樣品量少，是應(yīng)用最廣泛的一種分配層析。它是一種用濾紙作支持物，以紙上吸附的水

為固定相的層析方法。紙的主要成分是纖維素。纖維素上含有許多羥基。因?yàn)榱u基是很強(qiáng)

的親水基團(tuán)，所以紙上可以吸附大量的水。一般紙能從水蒸汽中吸收22%的水。我們可以

把一張濾紙條看成由許多理論塔板組成的分微柱。若將一定量的樣品加到濾紙匕當(dāng)讓合

適的有機(jī)溶劑（例如水飽和的正丁醇）在紙上滲透展開(kāi)時(shí)，樣品便在水相和有機(jī)溶劑相之

間反復(fù)地進(jìn)行分配。由于樣品中的各組分的分配系數(shù)不同，根據(jù)塔板理論，各組分隨著有

?16?

機(jī)溶劑遷移的速度也不同。分配系數(shù)大的組分在紙上一遷移的速度慢，分配系數(shù)小的組分遷

移的速度快，最后不同的組分可以完全分離。

關(guān)于紙層析的分配機(jī)理，曾遭到強(qiáng)烈的反對(duì)。反對(duì)的一個(gè)重要的理由是：溶質(zhì)的分配

是在兩種互補(bǔ)混溶的溶劑中進(jìn)行的。但在實(shí)際工作中，常用一些與水能夠混溶的溶劑，例

如丙醇、丙酮、乙醇等進(jìn)行層析，甚至有時(shí)用純水做流動(dòng)相進(jìn)行紙層析也能夠?qū)⒁恍┌被?/p>

酸以及其他??些物質(zhì)分離。為此，許多人對(duì)紙上吸附的水的性質(zhì)進(jìn)行了一系列的研究，認(rèn)

為紙上吸附的水和纖維素形成一種復(fù)合物。因此，紙上吸附的水便和普通的水不同。它和

葡萄糖的濃溶液一樣，能和純水形成兩相。這就很好地解釋了紙上的分配機(jī)理。當(dāng)然，紙

上還有一定的吸附作用，紙上所含的極少量竣基有離子交換作用，但這些都是次要的，在

紙層析中起主導(dǎo)作用的是分配作用。

物質(zhì)在紙上的移動(dòng)速率可以用Rf值表示。

R_色斑中心至原點(diǎn)中心的距離

/一溶劑前緣至原點(diǎn)中心的距離

物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，因而移動(dòng)速率（R,值）也恒定，因此可以

根據(jù)Rf值來(lái)鑒定被分離的物質(zhì)。

R/值由兩個(gè)因素決定：即物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)及兩相的體積比。

（-）影響因素

由于在同一實(shí)驗(yàn)條件下，兩相體積比為一常數(shù)，所以R/值主要取決于分配系數(shù)K。

因此，凡能影響分配系數(shù)的因素，均能影響R/值。這些因素主要有：

1.物質(zhì)結(jié)構(gòu)與極性：在紙層析中，極性物質(zhì)易進(jìn)入固定相，非極性物質(zhì)易進(jìn)入流動(dòng)相。

所以，決定分配情況的主要因素是物質(zhì)極性的大小。極性大的物質(zhì)其值較小。

2.層析溶劑：溶劑系統(tǒng)的組成和性質(zhì)的改變，直接影響分配系數(shù)的數(shù)值，自然也影響

勺值。溶劑選擇的原則是：

（1）通常選用與水部分混溶的有機(jī)溶劑為展層劑，也可選用和水能混溶的溶劑。

（2）展層劑通常不使用單一的有機(jī)溶劑，而使用多元的混合溶劑系統(tǒng)。因此在使用時(shí)

要注意溫度對(duì)溶劑系統(tǒng)中各組分的相互比例的影響，特別要注意溫度對(duì)含水量的影響。

（3）組成多元溶劑系統(tǒng)的各組分之間，溶劑系統(tǒng)各組分和待分離物質(zhì)之間不能起化學(xué)

反應(yīng)。

（4）揮發(fā)性太大的溶劑不宜作展層劑。

（5）選擇溶劑時(shí)應(yīng)考慮被分離物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中的R/值應(yīng)在0.05?0.85之間。各

分離組分不應(yīng)集中在濾紙的某一區(qū)域而應(yīng)分布全面，彼此間的值之差不應(yīng)小于0.05。

（6）為了增加兩相互溶，防止分層，并克服某些溶質(zhì)在有機(jī)相中溶解度過(guò)小的困難,

一般在推動(dòng)劑中加入一定量的酸或堿。

目前紙層析展層劑的選擇仍然依靠經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定，不可能全部達(dá)到理想條件，上述原則

可供選擇溶劑系統(tǒng)時(shí)參考。常見(jiàn)的紙層析溶劑系統(tǒng)見(jiàn)表1-L

表1-1一些紙層析分離系統(tǒng)的例子

化合物溶劑系統(tǒng)

氨基酸正丁醇:乙醉:水（40:10:50）；正丁醇:此咤:水（33:33:33）；

甲醇:毗咤:水（25:12:63）

單糖或二糖正丁醇:毗咤:水（50:28:22）

葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素丙醇:石油酸（4:96）；氯仿:石油醛（30:70）

3.pH：pH可影響物質(zhì)的解離及流動(dòng)相中的含水量。pH增加或降低,都會(huì)使極性物質(zhì)R.

值增加。當(dāng)分離兩性物質(zhì)時(shí)，可用酸堿兩向?qū)游?，能獲得較好效果。

4.溫度：溫度可影響分配系數(shù)，還影響溶劑組成及纖維素的水合作用。紙層析應(yīng)在恒

溫下進(jìn)行。

5.濾紙：對(duì)層析濾紙的要求是質(zhì)地均一，薄厚適當(dāng)，松緊適中，純度較高，機(jī)械強(qiáng)度

好。必要時(shí)需進(jìn)行空白層析?，干燥后再使用。

6.展開(kāi)方式：上行展開(kāi)的R/值較小，下行展開(kāi)的R/值較大。

（三）定量方法

紙層析不僅可以對(duì)混合物進(jìn)行分離、鑒定等定性分析，還可作定量分析，常用的定量

法有兩類(lèi)：

1.剪洗法:分離顯色后剪下樣品斑點(diǎn)，用適當(dāng)溶劑洗脫,

并用等高處無(wú)樣點(diǎn)濾紙（面積相同）作對(duì)照，比色定量。

2.掃描法：用薄層掃描儀或光密度計(jì)直接測(cè)量斑點(diǎn)顏色

濃度，根據(jù)記錄到的峰面積，求出含量。

以上.定量方法一般有±5%?10%的誤差。

紙層析法按操作方法分成兩類(lèi)，即垂直型和水平型。垂

直型是將紙懸起，使流動(dòng)相向上或向下擴(kuò)散。水平型是將圓

型濾紙置于水平位置，溶劑由中間向四周擴(kuò)散。

圖1-4垂直型紙層析

垂直型使用較廣，按分離物質(zhì)的多寡，將濾紙截成長(zhǎng)條,

在某一端離邊緣2?4cm處點(diǎn)樣，待干后，將點(diǎn)樣端邊緣與溶

液接觸，在密閉的玻璃缸內(nèi)

展開(kāi)（圖-4）。

根據(jù)展層劑在紙上擴(kuò)

展的方向，展層方式大致有

上行法、下行法和環(huán)行法（輻

射法）三種，上行、下行又

可有單向和雙向型式（圖

15）。只用一種溶劑系統(tǒng)進(jìn)

行一次展開(kāi)，稱(chēng)為單向?qū)游?。最終分離

刑前沿部分

如果樣品成分較多，而且彼

B

此的Rr值相近，單向?qū)游龇謫蜗蛏闲须p向上行

離效果不佳，此時(shí)可采用雙

圖1-5紙層析點(diǎn)樣、展層

向?qū)游龇?，即在長(zhǎng)方形或方

X、Y分別為原點(diǎn)至斑點(diǎn)中心和溶劑前沿的距離，x為點(diǎn)樣原點(diǎn).

形濾紙的一角點(diǎn)樣，卷成圓

?18?

筒形，先用第一種溶劑系統(tǒng)展開(kāi)；展開(kāi)完畢吹干后，旋轉(zhuǎn)90°,再放于另一種溶劑系統(tǒng)中，

向另一方向進(jìn)行第二次展開(kāi)，如此可使各成分的分離較為清晰（圖『6）。

在紙層析中，通常支持相是含水的，移動(dòng)相是有機(jī)溶劑。但是，有些化合物（如油料

種子中的不飽和脂肪酸）用有機(jī)的支持相和含水的移動(dòng)相能得到更好的分離。因此，這類(lèi)

化合物的層析紙先用有機(jī)相（一般是液體石蠟）浸潤(rùn),當(dāng)被分離的化合物加到紙上時(shí)，用

一種含水溶劑按通常的方法展開(kāi)，稱(chēng)為反相層析。

五、吸附層析

吸附層析是指混合物隨流動(dòng)相通過(guò)由吸附劑

組成的固定相時(shí)，主要由于吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的

不同吸附力而使混合物分離的方法。

吸附層析分離技術(shù)是各種層析技術(shù)中應(yīng)用

得最早的一類(lèi)，由于吸附劑來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、

易再生、裝置簡(jiǎn)單，又具有一定的分辨率等優(yōu)點(diǎn)，

至今仍廣泛應(yīng)用于各種天然化合物和微生物發(fā)酵

產(chǎn)品的分離制備。

（-）原理

某些物質(zhì)如氧化鋁、硅膠等，具有吸附其他

一些物質(zhì)的性質(zhì)。它們對(duì)各種被吸附物質(zhì)吸附力圖1-6氨基酸雙向紙層析色譜

的大小依其分子結(jié)構(gòu)不同而有差異，故可以選擇I.正丁醇:冰醋酸:水=4:1:5;II.酚:水=8:2

合適的吸附劑，利用這種差異將混合物分離。用這種方法所進(jìn)行的各種成分的分離與待分

離的物質(zhì)被吸附劑所吸附的程度及它們?cè)诜蛛x用的溶劑（洗脫液或展開(kāi)劑）中的溶解度等

因素有關(guān)。待分離物在吸附層析系統(tǒng)中受到兩種力的作用：一種是吸附劑對(duì)它的吸附作用；

另一種是溶劑對(duì)它的溶解作用（解吸作用）。這就造成不同分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在此層析系統(tǒng)的

兩相中具有不同的分配系數(shù)。經(jīng)過(guò)在兩相中的多次分配以后，各種物質(zhì)將依其結(jié)構(gòu)不同而

被分離開(kāi)來(lái)。

（二）吸附劑和洗脫劑的選擇

要使吸附層析的結(jié)果令人滿(mǎn)意，就要正確處理吸附和解吸的矛盾，首先應(yīng)合理選擇和

應(yīng)用吸附劑和洗脫劑。

1.吸附劑

通過(guò)實(shí)踐，根據(jù)具體情況選擇比較理想的吸附劑。通常吸附劑應(yīng)具有以下基本條件：

①吸附劑不溶于樣品溶液和洗脫劑中；②它與待分離的物質(zhì)除發(fā)生吸附、解吸作用外，不

發(fā)生其他化學(xué)反應(yīng)；③吸附劑最好是無(wú)色或淺色，便于觀察；④滲濾的速度要快，這與柱

高、層析物量、樣品溶液和洗脫液粘度有關(guān)?？傊?，較理想的吸附劑應(yīng)是比較活潑、能選

擇性地吸附相當(dāng)數(shù)量的待分離物，同時(shí)又能被適當(dāng)?shù)南疵搫┙馕茌^完全地淋洗卜來(lái)。

常用的較為滿(mǎn)意的吸附劑是氧化鋁、氧化錫及它們的氫氧化物以及鹽類(lèi)如碳酸鹽、硫

酸鹽。滑石、硅石、堿石灰和很多種硅酸鹽都有較特殊的吸附作用。分離不穩(wěn)定的化合物

常用淀粉、蔗糖、乳糖等。應(yīng)當(dāng)指出，由于所分離的物質(zhì)的復(fù)雜性，至今還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一種

通用的吸附劑。

2.洗脫劑

用來(lái)洗脫吸附柱的液體物質(zhì)叫洗脫劑，有時(shí)，它就是溶解被吸附樣品的溶劑。選擇洗

脫劑應(yīng)符合下列條件：①純度較高，若含有雜質(zhì)會(huì)影響洗脫的效果；②不應(yīng)與吸附劑或待

分離物質(zhì)起化學(xué)作用；③能迅速和盡可能地完全洗脫所分離的成分，并能充分地溶解它，

即有較好的解吸能力；④粘度宜小，易流動(dòng)，以便較快洗脫；⑤易于利所需要的成分分離。

可根據(jù)分離物中各成分的極性、溶解度和吸附劑的活性來(lái)選擇洗脫劑，一般極性大的

成分用極性大的洗脫劑，極性小的成分用極性小的洗脫劑。洗脫劑極性決不能比待分離成

分的極性更小，因?yàn)闃O性強(qiáng)的物質(zhì)較易把極性弱的物質(zhì)從吸附柱上洗脫下來(lái)。

（三）吸附層析的方法

根據(jù)操作方式的不同，吸附層析常分為吸附柱層析及吸附薄層層析。

1.吸附柱層析

吸附柱層析是用一根玻璃管柱，下端鋪墊脫脂棉或玻璃棉，管內(nèi)加吸附劑粉末，用一

種溶劑潤(rùn)濕后，即成為吸附柱。然后在柱頂部加入要分離的樣品溶液。假如樣品內(nèi)含兩種

成分A與B,則兩者被吸附在柱上端。樣品溶液全部流入吸附柱中之后，接著就加入合適

的溶劑洗脫，A與B也就隨著溶劑以不同的移動(dòng)速率向下流動(dòng)，最后可使A與B分離。

在洗脫過(guò)程中，管內(nèi)連續(xù)發(fā)生溶解、吸附、再溶解、再吸附的現(xiàn)象。例如，被吸附的

A粒子被溶解（解吸作用）而隨溶劑下移，但遇到新的吸附劑，乂將A吸附，隨后，新溶

劑又使A溶解下移。按照同樣道理，由于溶劑與吸附劑對(duì)A與B的溶解力與吸附力不完全

相同，A與B移動(dòng)的距離也不同，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，如此反復(fù)地溶解與吸附，可形成兩個(gè)環(huán)

帶，每一環(huán)帶是一種純物質(zhì)。如A與B有顏色，就可看到色層；如樣品無(wú)色，可用其他方

法使之顯色。為了進(jìn)一步鑒定，可將吸附柱從管中頂出來(lái)，用刀將各色層分段切開(kāi)，然后

分別洗脫?，F(xiàn)在多采用溶劑洗脫法，即連續(xù)加入溶劑，連續(xù)分段收集洗脫劑，直到各成分

全部依順序從柱中洗出為止。

通常非極性的與極性不強(qiáng)的有機(jī)物如胡蘿卜素、甘油酯、膽固醇等的分離用這種方法

最為合適。

2.薄層層析法

薄層層析（TLC）是將吸附劑在玻璃板上均勻地鋪成薄層，把要分析的樣品加到薄層匕

再用合適的溶劑展開(kāi)，來(lái)達(dá)到分離、鑒定的目的。因?yàn)閷游鍪窃诒“迳线M(jìn)行的，故稱(chēng)為薄層

層析（圖1-7、1-8）。

圖5-15近水平式下行薄以層析簡(jiǎn)易奘置

?20?

薄層層析的作用機(jī)理主要包括吸附、分配、離子交換和凝膠過(guò)濾等作用。當(dāng)樣品組分

在薄板上進(jìn)行分離時(shí)，這幾種作用產(chǎn)生不同的影響，究竟哪種作用為主，須視情況而定。

在吸附薄層層析中，因樣品組分極性有差異，故不同組分與吸附劑和展層劑的親和力就有

差別，從而導(dǎo)致各組分在薄板上的移動(dòng)距離不同，組分與吸附劑親和力強(qiáng)的留在接近原點(diǎn)

的位置；反之，組分與吸附劑親和力弱的留在離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的位置，即親和力愈弱，移動(dòng)愈

遠(yuǎn)，于是樣品中各嚕金善得到分離。

按照相似溶解恒以碗律，極性組分易溶于極性溶劑中；非極性組分則易溶于非極性溶

圖1-7薄層層析裝置圖1-8近水平式下行薄層層析簡(jiǎn)易裝置

I.下行式；U.上行式

劑中，因此在同一薄板上，不同極性化合物的組分在同一溶劑中的溶解度不同，溶解度愈

大，移動(dòng)的速度愈快；否則反之。展層的過(guò)程即樣品各組分得到分離的過(guò)程，它也是一個(gè)

吸附，解吸，再吸附，再解吸的連續(xù)過(guò)程。

薄層層析的優(yōu)點(diǎn)是：①設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易；②層析展開(kāi)時(shí)間短，只需數(shù)分鐘到幾小

時(shí).，即可獲得結(jié)果；③分離時(shí)幾乎不受溫度的影響；④可采用腐蝕性的顯色劑，而且可以

在高溫下顯色；⑤分離效率高。

制備薄層有兩種方法：一種是不加粘合劑，將吸附劑干粉如氧化鋁、硅膠等直接均勻

地鋪在玻板上，通常稱(chēng)為軟板，制作簡(jiǎn)單方便，但易被吹散；另一種是加粘合劑如水或其

他液體，將吸附劑調(diào)成糊狀再鋪板，經(jīng)干燥后才能使用，通常稱(chēng)硬板，制備較復(fù)雜，但易

于保存。通常用氧化鋁G（G表示石膏，即氧化鋁中含5%鍛石膏）或硅膠G制備硬板，此

外可用淀粉或竣甲基纖維素鈉（CMC）作粘合劑制板。

薄層層析后，樣品組分的定量法有洗脫測(cè)定法和原位法。薄層掃描法是原位法中目前

應(yīng)用最廣和最靈敏的一種方法。

洗脫測(cè)定法是將樣品組分的顯色斑點(diǎn)和與它位置相當(dāng)?shù)牧硪豢瞻装唿c(diǎn)（同樣大小）從

薄板上連同吸附劑一起刮下，置于離心管中，用適量溶劑把組分從吸附劑上洗脫出來(lái)，離

心除去吸附劑，上清液可用分光光度法、同位素標(biāo)記法等進(jìn)行定量測(cè)定。

薄層掃描法是目前應(yīng)用較廣的一種定量法。如薄層光吸收法是用薄層掃描儀直接測(cè)定

薄層上斑點(diǎn)的光吸收，即其透射光或