《基因技術(shù)》課件2

基因編輯技術(shù)革命性生物技術(shù)，精確修改生物體遺傳物質(zhì)課程概述基本概念與歷史基因編輯定義與發(fā)展歷程技術(shù)原理與方法主要編輯系統(tǒng)工作機制應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)應(yīng)用案例倫理與未來什么是基因編輯？定義有目的地修改生物體基因組特定位置的技術(shù)目的糾正有害突變，改善生物特性基本原理基因編輯的歷史11970年代重組DNA技術(shù)出現(xiàn)21980年代基因敲除小鼠技術(shù)發(fā)展31990年代鋅指核酸酶技術(shù)(ZFN)初現(xiàn)42000年代TALEN技術(shù)開發(fā)成功52012年CRISPR/Cas9技術(shù)問世基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程第一代：鋅指核酸酶開創(chuàng)性但設(shè)計復(fù)雜2第二代：TALEN提高特異性但仍難設(shè)計第三代：CRISPR/Cas9簡便高效革命性突破基因編輯的主要方法ZFN技術(shù)鋅指蛋白與核酸酶結(jié)合最早開發(fā)的精準編輯技術(shù)TALEN技術(shù)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物比ZFN更靈活CRISPR/Cas9細菌免疫系統(tǒng)改造革命性突破ZFN技術(shù)原理鋅指蛋白與FokI核酸酶融合特異性識別DNA序列引入雙鏈斷裂優(yōu)點高特異性無需PAM序列缺點設(shè)計復(fù)雜成本高構(gòu)建周期長TALEN技術(shù)原理TALE蛋白與FokI核酸酶融合模塊化設(shè)計識別DNA序列優(yōu)點設(shè)計更靈活特異性高缺點構(gòu)建仍復(fù)雜大分子量影響遞送效率CRISPR/Cas9技術(shù)11987年首次發(fā)現(xiàn)CRISPR序列22005年確認CRISPR在細菌免疫中的作用32012年證明可用于基因組編輯42013年首次應(yīng)用于人類細胞編輯CRISPR/Cas9系統(tǒng)組成Cas9蛋白核酸酶活性切割雙鏈DNA識別PAM序列sgRNA引導(dǎo)RNA決定靶位點特異性約20個堿基互補配對CRISPR/Cas9的優(yōu)勢簡單高效僅需設(shè)計sgRNA，無需復(fù)雜蛋白工程多基因編輯可同時編輯多個基因位點成本低合成簡單，實驗周期短適用性廣幾乎所有生物體都可使用CRISPR/Cas9的局限性脫靶效應(yīng)可能在非目標位點切割DNA導(dǎo)致意外突變影響編輯安全性PAM序列依賴性需要特定PAM序列限制可編輯位點典型Cas9需要NGG序列大片段插入效率低基因敲入效率不高HDR效率低于NHEJ基因編輯的作用機制DNA雙鏈斷裂（DSB）編輯工具在特定位點切割DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂觸發(fā)細胞修復(fù)機制細胞修復(fù)機制兩種主要修復(fù)途徑1.非同源末端連接(NHEJ)2.同源定向修復(fù)(HDR)非同源末端連接（NHEJ）雙鏈斷裂編輯工具切割DNA末端處理斷裂末端調(diào)整直接連接不需模板直接連接出現(xiàn)插入或缺失隨機indel突變同源定向修復(fù)（HDR）雙鏈斷裂編輯工具切割DNA提供模板外源修復(fù)模板同源重組按模板序列修復(fù)精確修復(fù)準確引入目標變化基因編輯的類型基因敲除使基因失活基因插入添加新基因基因替換用新序列替代原序列基因敲除（Knock-out）原理通過NHEJ引入移碼突變導(dǎo)致基因功能喪失產(chǎn)生提前終止密碼子應(yīng)用案例CCR5基因敲除阻斷HIV感染腫瘤相關(guān)基因功能研究無角牛育種基因插入（Knock-in）原理通過HDR在特定位點插入序列需要提供外源DNA模板精確添加新功能應(yīng)用案例熒光標記基因插入細胞追蹤人源化動物模型構(gòu)建作物新性狀導(dǎo)入基因替換1定點切割在目標位點產(chǎn)生DSB2模板提供引入含有目標序列的修復(fù)模板3HDR修復(fù)細胞用新序列替換原序列基因編輯的新技術(shù)堿基編輯無需雙鏈斷裂單堿基精確替換減少脫靶風(fēng)險先導(dǎo)編輯PrimeEditing更精確編輯方式擴大編輯類型堿基編輯技術(shù)胞嘧啶堿基編輯器（CBE）將C-G轉(zhuǎn)換為T-A胞嘧啶脫氨酶+Cas蛋白無需雙鏈斷裂腺嘌呤堿基編輯器（ABE）將A-T轉(zhuǎn)換為G-C腺嘌呤脫氨酶+Cas蛋白擴展編輯范圍先導(dǎo)編輯技術(shù)原理結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄酶的Cas9變體pegRNA包含目標序列和修復(fù)模板信息優(yōu)勢可實現(xiàn)所有類型點突變、小插入和缺失安全性僅切割單鏈DNA，脫靶風(fēng)險更低基因編輯在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用遺傳病治療修復(fù)致病突變1癌癥治療增強免疫細胞傳染病防治阻斷病毒感染藥物開發(fā)靶點驗證遺傳病治療單基因遺傳病鐮狀細胞貧血β-地中海貧血囊性纖維化杜氏肌營養(yǎng)不良復(fù)雜遺傳病心血管疾病風(fēng)險降低神經(jīng)退行性疾病代謝性疾病癌癥治療CAR-T細胞療法編輯T細胞表達嵌合抗原受體增強識別腫瘤能力已成功應(yīng)用于白血病治療腫瘤抑制基因修復(fù)修復(fù)p53等抑癌基因恢復(fù)細胞正常功能免疫檢查點調(diào)控編輯PD-1/CTLA-4表達增強抗腫瘤免疫傳染病防治HIV/AIDS編輯CCR5基因阻斷病毒入侵攻擊病毒基因組病毒性肝炎切除整合的HBVDNA破壞病毒復(fù)制呼吸道病毒靶向病毒基因組阻斷感染提高宿主抵抗力藥物開發(fā)靶點驗證敲除基因確認藥物作用位點細胞模型構(gòu)建疾病相關(guān)細胞系藥效篩選高通量篩選潛在藥物個體化醫(yī)療基于基因型優(yōu)化治療方案基因編輯在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用作物改良抗病蟲害，增產(chǎn)，抗逆性動物育種改善生產(chǎn)性能，疾病抗性食品安全減少過敏原，提高營養(yǎng)可持續(xù)農(nóng)業(yè)減少農(nóng)藥使用，提高資源利用作物改良抗病性增強抗真菌、細菌和病毒感染抗逆性提高耐旱、耐鹽、耐寒能力增強產(chǎn)量提高優(yōu)化光合作用，提高養(yǎng)分利用實際案例非褐變蘑菇，抗枯萎病香蕉動物育種肉質(zhì)改善肌肉生長相關(guān)基因優(yōu)化脂肪分布調(diào)整肉質(zhì)更嫩，營養(yǎng)更高疾病抗性非洲豬瘟抗性豬禽流感抗性家禽結(jié)核病抗性牛福利改善無角牛減少傷害耐熱性提高減輕熱應(yīng)激食品安全過敏原消除無過敏原小麥低致敏大豆減少花生過敏原營養(yǎng)成分優(yōu)化高賴氨酸玉米高油酸大豆黃金大米富硒農(nóng)作物基因編輯在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用工業(yè)酶生產(chǎn)更高效的生物催化劑生物燃料高效能源作物與微生物生物材料新型生物可降解材料生物燃料生產(chǎn)藻類改造增加油脂含量纖維素降解開發(fā)高效纖維素酶產(chǎn)油微生物直接合成烴類化合物高效能源作物降低木質(zhì)素含量提高轉(zhuǎn)化率生物材料合成新型纖維蜘蛛絲蛋白生產(chǎn)生物塑料聚羥基脂肪酸酯(PHA)生產(chǎn)人造皮革真菌菌絲體材料基因編輯在環(huán)境保護中的應(yīng)用污染物降解改造微生物降解塑料分解石油污染物處理重金屬污染生物修復(fù)超積累植物富集重金屬根際微生物強化提高植物代謝有毒物質(zhì)能力基因編輯技術(shù)的倫理問題人類胚胎編輯遺傳變異世代傳遞問題1基因增強超越治療目的改變?nèi)祟愋誀罟将@取技術(shù)可及性和社會不平等知情同意未來世代無法參與決策人類胚胎基因編輯爭議支持觀點預(yù)防遺傳疾病減輕未來痛苦技術(shù)自由發(fā)展反對觀點安全性風(fēng)險意外后果滑坡效應(yīng)人類基因庫干預(yù)基因編輯的安全性問題脫靶效應(yīng)非目標位點發(fā)生突變可能導(dǎo)致基因失活激活癌基因風(fēng)險免疫反應(yīng)對編輯工具的免疫應(yīng)答潛在炎癥反應(yīng)長期影響多代遺傳效應(yīng)未知生態(tài)系統(tǒng)潛在風(fēng)險基因編輯的監(jiān)管與法律問題臨床前研究實驗室安全標準臨床試驗嚴格審批程序產(chǎn)品上市監(jiān)管機構(gòu)評估上市后監(jiān)測長期安全性追蹤國際基因編輯政策比較國家/地區(qū)人類胚胎研究臨床應(yīng)用農(nóng)業(yè)應(yīng)用中國有條件允許嚴格監(jiān)管支持發(fā)展美國私人資金可進行需FDA批準基于產(chǎn)品監(jiān)管歐盟多數(shù)國家禁止嚴格限制等同轉(zhuǎn)基因監(jiān)管日本有條件允許需特別批準逐案審批基因編輯技術(shù)的未來發(fā)展方向提高精確性降低脫靶效應(yīng)擴大應(yīng)用范圍更多疾病和特性提高遞送效率更好的體內(nèi)遞送降低成本普及臨床應(yīng)用提高編輯精確性改進Cas9蛋白高保真Cas9變體開發(fā)優(yōu)化sgRNA設(shè)計算法提高特異性脫靶檢測全基因組測序評估遞送方式瞬時表達降低脫靶機會擴大編輯范圍新型Cas蛋白Cas12，Cas13等擴展靶向能力人工設(shè)計的編輯酶組合不同功能域的融合蛋白PAM依賴性拓展改造Cas9識別更多PAM序列提高編輯效率細胞滲透肽直接蛋白遞送納米顆粒脂質(zhì)體和聚合物載體病毒載體AAV和慢病毒遞送系統(tǒng)基因編輯與其他技術(shù)的結(jié)合單細胞測序精確評估編輯效果細胞異質(zhì)性分析基因表達變化追蹤人工智能優(yōu)化sgRNA設(shè)計預(yù)測脫靶位點自動設(shè)計編輯策略大數(shù)據(jù)分析編輯效應(yīng)基因編輯實驗設(shè)計明確目標確定編輯位點和所需修改選擇編輯系統(tǒng)根據(jù)需求選擇合適技術(shù)設(shè)計sgRNA確保特異性和效率遞送策略選擇合適的遞送方法編輯效果驗證評估編輯效率和準確性靶點選擇與sgRNA設(shè)計1選擇目標序列避開重要功能結(jié)構(gòu)域2檢查PAM位點確認PAM可用性3預(yù)測脫靶位點使用生物信息工具4合成sgRNA選擇體外轉(zhuǎn)錄或化學(xué)合成實驗流程概述1設(shè)計階段sgRNA設(shè)計，載體構(gòu)建2細胞處理轉(zhuǎn)染或病毒感染3篩選階段抗生素篩選或流式分選4克隆擴增單克隆分離培養(yǎng)5驗證分析基因型和表型檢測基因編輯效率評估方法T7E1酶切法檢測錯配位點Surveyor核酸酶法識別雜合突變高通量測序精確定量編輯效率數(shù)字PCR檢測稀有編輯事件脫靶檢測方法生物信息預(yù)測計算機算法預(yù)測潛在位點序列相似性分析實驗驗證GUIDE-seqCIRCLE-seqDISCOVER-seq全基因組測序基因編輯技術(shù)在科研中的應(yīng)用基因功能研究系統(tǒng)性基因敲除功能域分析表觀遺傳修飾動物模型構(gòu)建疾病模型小鼠非人靈長類模型多基因編輯模型藥物篩選平臺靶點驗證藥物敏感性測試高通量篩選系統(tǒng)基因編輯數(shù)據(jù)庫與生物信息學(xué)工具sgRNA設(shè)計工具CHOPCHOP、CRISPR-ERA基因組瀏覽器UCSC、Ensembl脫靶預(yù)測Cas-OFFinder、CRISPOR基因編輯技術(shù)的商業(yè)化應(yīng)用基因編輯專利爭議12012年伯克利團隊首次發(fā)表CRISPR基因編輯論文22013年布羅德研究所應(yīng)用于真核細胞32014-2018年專利訴訟持續(xù)進行42018年后全球?qū)＠窬謴?fù)雜化基因編輯技術(shù)人才培養(yǎng)1實驗技術(shù)操作技能培訓(xùn)2理論知識分子生物學(xué)基礎(chǔ)3生物信息分析數(shù)據(jù)處理與解讀4倫理與監(jiān)管負責(zé)任研究意識基因編輯領(lǐng)域的前沿研究基因編輯技術(shù)的社會影響健康改善遺傳疾病治愈可能糧食安全作物產(chǎn)量提高倫理挑戰(zhàn)生物安全與道德邊界全球治理國際合作與監(jiān)管需求案例分析：CRISPR嬰