《病原生物學(xué)實驗原理與操作規(guī)范》課件

病原生物學(xué)實驗原理與操作規(guī)范生物安全是保障實驗人員健康和防止病原微生物擴散的關(guān)鍵課程概述課程目標(biāo)掌握病原生物操作規(guī)范主要內(nèi)容生物安全要求與實驗技術(shù)學(xué)習(xí)方法第一章：病原生物學(xué)實驗室安全概述實驗室生物安全的重要性保護人員健康與環(huán)境安全生物安全的定義和范圍生物安全等級1BSL-1基礎(chǔ)教學(xué)實驗室2BSL-2臨床診斷實驗室3BSL-3高致病性病原體實驗室4BSL-4最高防護級別實驗室實驗室生物安全相關(guān)法規(guī)《病原微生物實驗室生物安全管理條例》規(guī)定實驗室建設(shè)與管理標(biāo)準(zhǔn)《人間傳染的病原微生物名錄》明確不同風(fēng)險等級的病原體分類第二章：實驗室設(shè)施與設(shè)備實驗室布局清潔區(qū)、緩沖區(qū)和污染區(qū)分區(qū)正壓向負(fù)壓單向流動設(shè)計基本設(shè)施要求氣密門窗通風(fēng)系統(tǒng)廢水處理裝置生物安全柜I類生物安全柜保護操作者和環(huán)境1II類生物安全柜同時保護樣本和操作者2III類生物安全柜最高防護級別的全封閉系統(tǒng)3實驗室其他重要設(shè)備離心機樣本分離，須使用安全蓋培養(yǎng)箱微生物培養(yǎng)，溫度控制精確高壓滅菌器121℃濕熱滅菌，徹底消毒第三章：個人防護裝備（PPE）呼吸防護防止吸入感染面部防護防止濺入眼睛身體防護防止皮膚暴露防護服的選擇和使用呼吸防護普通醫(yī)用口罩基礎(chǔ)實驗防護2N95口罩過濾95%微粒全面式呼吸器高危病原體防護手套和其他防護裝備2手套層數(shù)高風(fēng)險操作雙層手套30佩戴時間最長連續(xù)使用分鐘數(shù)100%覆蓋率眼部防護必須完全密封第四章：實驗室基本操作規(guī)范更換實驗服穿戴專用實驗室工作服洗手消毒進入實驗區(qū)前徹底清潔穿戴防護裝備按規(guī)定順序穿戴防護用品遵守行為規(guī)范實驗室內(nèi)禁止飲食和化妝洗手技術(shù)掌心相對揉搓掌心1手指交叉清潔指縫2指尖搓揉清潔指甲3拇指旋轉(zhuǎn)特別注意拇指4手腕清洗延伸至手腕部位5無菌操作技術(shù)無菌區(qū)建立酒精燈周圍30厘米范圍器材火焰滅菌接種環(huán)需紅熱滅菌開口容器傾斜持握防止空氣中雜菌落入操作速度適中動作熟練避免污染接種技術(shù)平板劃線接種分離純化細(xì)菌菌落斜面接種保存培養(yǎng)物種液體接種擴大培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量染色技術(shù)1革蘭氏染色區(qū)分G+/G-菌2抗酸染色結(jié)核分枝桿菌檢測3熒光染色提高檢出敏感性4負(fù)染色觀察菌體周圍莢膜顯微鏡使用目鏡調(diào)節(jié)物鏡切換聚光器調(diào)節(jié)光圈調(diào)節(jié)粗微調(diào)焦第五章：病原微生物培養(yǎng)與鑒定培養(yǎng)基選擇根據(jù)微生物特性培養(yǎng)條件控制溫度、濕度、氣體觀察分析形態(tài)學(xué)特征生化鑒定代謝特性確認(rèn)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)需氧培養(yǎng)普通培養(yǎng)箱溫度37℃觀察時間24-48小時厭氧培養(yǎng)厭氧罐或厭氧培養(yǎng)箱添加厭氧指示劑培養(yǎng)時間需延長病毒培養(yǎng)技術(shù)1細(xì)胞系選擇選擇易感細(xì)胞系2樣本處理抗生素預(yù)處理去除雜菌3接種培養(yǎng)接種后定期觀察細(xì)胞病變4病毒收獲收集病毒液進行鑒定真菌培養(yǎng)技術(shù)寄生蟲檢查技術(shù)直接涂片法活動性滴蟲和阿米巴檢測濃縮法提高寄生蟲卵檢出率血液檢查瘧原蟲和絲蟲檢測生化鑒定方法氧化酶試驗細(xì)菌產(chǎn)氧化酶能力催化酶試驗分解過氧化氫能力IMViC試驗?zāi)c桿菌科細(xì)菌鑒定糖發(fā)酵試驗區(qū)分不同發(fā)酵類型自動化系統(tǒng)VITEK、API系統(tǒng)快速鑒定血清學(xué)鑒定方法凝集試驗簡便快速定性檢測免疫熒光法直接觀察抗原抗體反應(yīng)ELISA技術(shù)高靈敏度定量檢測免疫層析快速現(xiàn)場檢測分子生物學(xué)鑒定方法核酸提取樣本處理獲取DNA/RNAPCR擴增特異性引物擴增目標(biāo)基因產(chǎn)物檢測電泳或?qū)崟r熒光檢測基因測序精確分型和鑒定第六章：實驗室廢棄物處理銳器廢棄物專用利器盒收集感染性廢棄物雙層黃色醫(yī)廢袋化學(xué)廢棄物按性質(zhì)分類收集感染性廢棄物處理高壓蒸汽滅菌121℃，30分鐘適用大多數(shù)微生物廢棄物化學(xué)消毒含氯消毒劑浸泡液體廢棄物處理首選焚燒處理最終處理方式需專業(yè)機構(gòu)進行銳器廢棄物處理專用銳器盒防刺穿，黃色標(biāo)識使用原則不回套針頭，裝填不超3/4最終處置密封后交專業(yè)機構(gòu)處理化學(xué)廢棄物處理酸堿廢液中和后排放有機溶劑專用容器收集重金屬廢液特殊處理，不得直接排放染色廢液脫色處理后排放第七章：實驗室消毒與滅菌消毒減少微生物數(shù)量降低感染風(fēng)險滅菌徹底殺滅所有微生物包括芽孢和病毒物理消毒方法殺滅效率(%)處理時間(分鐘)化學(xué)消毒方法含氯消毒劑廣譜高效，有機物降效醇類消毒劑75%乙醇，快速揮發(fā)醛類消毒劑戊二醛，高水平消毒季銨鹽類低毒性，環(huán)境友好空氣消毒自然通風(fēng)每日開窗30分鐘機械通風(fēng)負(fù)壓排風(fēng)系統(tǒng)紫外線燈無人狀態(tài)下開啟30分鐘化學(xué)噴霧過氧化氫噴霧消毒物表消毒1000PPM有效氯濃度10分鐘消毒劑作用時間2次/日工作臺面最少消毒頻次手部消毒洗手液選擇抗菌或普通皂液洗手時間至少15秒免洗手消毒劑75%酒精為主洗手時機操作前后必須洗手第八章：實驗室生物安全風(fēng)險評估風(fēng)險識別確定危險源風(fēng)險分析評估概率和后果風(fēng)險評價確定風(fēng)險等級風(fēng)險控制制定防范措施風(fēng)險識別病原體危害性傳染性、致病性、穩(wěn)定性操作風(fēng)險氣溶膠產(chǎn)生、銳器傷害防護屏障設(shè)施設(shè)備和個人防護人員因素技能水平和健康狀況風(fēng)險分析危害程度發(fā)生概率風(fēng)險控制措施1個人防護最后防線，不可完全依賴管理控制規(guī)程培訓(xùn)和監(jiān)督檢查工程控制生物安全柜等物理屏障第九章：實驗室安全事故處理常見事故類型生物材料溢灑人員暴露設(shè)備故障火災(zāi)化學(xué)品泄漏應(yīng)急預(yù)案要素明確責(zé)任人詳細(xì)處置流程必要物資準(zhǔn)備定期演練生物材料溢灑處理現(xiàn)場隔離標(biāo)記區(qū)域，阻止人員進入個人防護穿戴適當(dāng)防護裝備覆蓋吸收用吸收材料覆蓋溢灑物消毒處理消毒液由外向內(nèi)噴灑廢棄物處理按感染性廢棄物處理人員暴露處理皮膚暴露流水沖洗15分鐘眼睛暴露洗眼器沖洗，眼瞼翻開吸入暴露離開污染區(qū)，醫(yī)學(xué)觀察火災(zāi)和化學(xué)品事故處理初期火災(zāi)使用合適滅火器火勢擴大觸發(fā)警報，疏散人員化學(xué)品泄漏使用專用吸附劑事后處理詳細(xì)記錄和報告第十章：實驗室生物安全管理組織架構(gòu)明確責(zé)任分工規(guī)章制度標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程人員管理資質(zhì)培訓(xùn)考核監(jiān)督檢查定期安全評估人員管理準(zhǔn)入制度資質(zhì)審核，健康檢查培訓(xùn)要求崗前培訓(xùn)，定期復(fù)訓(xùn)考核評估理論與操作技能考核4健康監(jiān)護定期體檢和應(yīng)急處置設(shè)施設(shè)備管理生物安全柜每年檢測認(rèn)證高壓滅菌器每月壓力測試離心機每季度平衡校準(zhǔn)通風(fēng)系統(tǒng)每半年效率測試實驗室環(huán)境每季度微生物監(jiān)測實驗活動管理實驗申請明確風(fēng)險和防護需求專家審批安全委員會審核操作規(guī)程制定詳細(xì)步驟和注意事項過程監(jiān)督確保規(guī)程執(zhí)行到位記錄與檔案管理第十一章：特殊病原體實驗操作1高致病性病原體傳染性強，致病性高2特殊防護要求BSL-3級以上設(shè)施3嚴(yán)格管理規(guī)定審批許可和備案制度4雙人操作原則互相監(jiān)督確保安全結(jié)核分枝桿菌實驗操作防護要求BSL-2+實驗室空氣防護負(fù)壓生物安全柜內(nèi)操作痰液處理消化液預(yù)處理減少氣溶膠培養(yǎng)特點生長緩慢，4-8周觀察結(jié)果病毒性肝炎病原體實驗操作乙型肝炎病毒(HBV)BSL-2實驗室操作者需接種疫苗丙型肝炎病毒(HCV)BSL-2+實驗室避免銳器傷害戊型肝炎病毒(HEV)糞-口傳播注意消化道防護HIV實驗操作避免銳器傷害生物安全柜操作雙層手套防護廢棄物妥善處理意外暴露處置新發(fā)突發(fā)傳染病病原體實驗操作3安全防護等級至少BSL-3級別實驗室2人員操作數(shù)量雙人操作互相監(jiān)督100%防護覆蓋率全身無暴露區(qū)域0容忍風(fēng)險度零容忍安全事故第十二章：實驗室質(zhì)量控制質(zhì)量規(guī)劃確立質(zhì)量目標(biāo)和指標(biāo)質(zhì)量控制日常監(jiān)測和校準(zhǔn)質(zhì)量評估內(nèi)部質(zhì)控和外部質(zhì)評持續(xù)改進問題分析和糾正預(yù)防實驗室內(nèi)部質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作流程詳細(xì)步驟文件化質(zhì)控品使用陽性和陰性質(zhì)控質(zhì)控圖分析監(jiān)測結(jié)果穩(wěn)定性重復(fù)性驗證關(guān)鍵結(jié)果雙人復(fù)核實驗室間質(zhì)評能力驗證未知樣品檢測評估結(jié)果分析與標(biāo)準(zhǔn)值和其他實驗室比對持續(xù)改進根據(jù)問題制定糾正措施儀器設(shè)備質(zhì)控溫度監(jiān)測每日校準(zhǔn)記錄天平校準(zhǔn)每