DB13-T2609-2017-禽流感病毒與新城疫病毒二重RT-PCR檢測方法-河北省

ICS65.020.30DB13B41河北省地方標準DB13/T2609—2017禽流感病毒與新城疫病毒二重RT-PCR檢測方法河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB13/T2609—2017前言本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本標準起草單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標準主要起草人：袁萬哲、劉聚祥、陳立功、孫繼國、董世山、武現(xiàn)軍、劉靜、張磊、李睿文、李麗敏、白云、韓慶安。IDB13/T2609—2017禽流感病毒與新城疫病毒二重RT-PCR檢測方法1范圍本標準規(guī)定了禽流感病毒與新城疫病毒RT-PCR檢測方法的技術(shù)要求。本標準適用于檢測家禽咽喉拭子、肛拭子，發(fā)病禽組織和這些采集樣品培養(yǎng)物中的禽流感病毒與新城疫病毒。2縮略語下列縮略語適用于本文件。EB：溴化乙錠（ethidiumbromide）DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse-transcriptionpolymerasechainreaction）dNTP：脫氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）3包括LSTRIzolRNA提取試劑或各種市售病毒核酸提取試劑盒，氯仿，異丙醇，75%乙醇，1.0％瓊脂糖凝膠，50×TAE緩沖液，溴化乙錠（EB，10ug/μL）或核酸染料，焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的滅菌的雙蒸水，DNA分子量標準（100bp），2×TaqMasterMix。警示:氯仿屬中等毒性，在操作中應(yīng)在通風(fēng)條件下進行，使用時戴手套和口罩，不小心沾到皮膚應(yīng)立即沖洗；電泳中用到的EB在操作中應(yīng)戴手套和口罩。試驗中被EB污染的物品要進行無害化處理；DEPC在操作中應(yīng)在通風(fēng)條件下進行，使用時戴手套和口罩，不小心沾到皮膚應(yīng)立即沖洗。3.31.0％瓊脂糖凝膠，配制方法見附錄A中A.1。3.450×TAE緩沖液，配制方法見附錄A中A.2。3.7DNA分子量標準（100bp）:包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp幾種分3.8反轉(zhuǎn)錄酶:M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）或AMV反轉(zhuǎn)錄酶（10U/μL）。1DB13/T2609—20173.9RNA酶抑制劑。3.102×TaqMasterMix:含有PCR緩沖液、酶混合物、dNTP混合物、無RNA酶的水等。3.11dNTP。濃度為2.5mM。3.12引物:反轉(zhuǎn)錄引物、上游引物與下游引物見附錄B中的表B.1。引物濃度為10μmol/L。4儀器設(shè)備4.14.24.3PCR儀:溫度范圍4.0℃～99.9℃,樣品基座配置至少包括單個0.2mL孔。凝膠成像系統(tǒng):檢測靈敏度DNA≥0.1ng；有效像數(shù)1360×1024、10bit、USB2.0。臺式低溫高速離心機:最高轉(zhuǎn)速16000r/min；容量1.5mL×12。4.4電泳儀:電壓50V～120V，電流10mA～800mA，定時0min～999min。4.5電泳槽:耐高溫、耐腐蝕、不漏液；緩沖液容量充足。4.6冰箱:具有冷藏功能。4.7微量移液器:單道可調(diào),量程包括0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL、100μL～1000μL。4.8水浴鍋:溫度范圍為室溫～100℃。5以滅活的禽流感病毒與新城疫病毒雞胚培養(yǎng)物或者感染禽組織作為陽性對照，以正常雞胚尿囊液將棉拭子深入咽喉或肛門轉(zhuǎn)一圈；將采集后的棉拭子放入盛有1.0mLPBS（配制方法見附錄A中A.5）的1.5mL的離心管，加蓋，編號。2DB13/T2609—2017剖檢家禽，用剪刀采集心肝脾肺腎法氏囊等組織，裝入一次性滅菌容器，編號。5.2.4樣品儲運樣品采集后放入塑料袋內(nèi)密封（一個采集點的樣品放一個塑料袋內(nèi)），于保溫箱中加冰，密封24h內(nèi)送至實驗室。5.2.5樣品的處理5.2.5.1棉拭子處理方法將裝有棉拭子的離心管在混合器上充分混合后，用高壓滅菌的鑷子將拭子中的液體擠出，4℃條件下3000r/min離心15min，取上清液轉(zhuǎn)入無菌的1.5mL離心管中，編號備用。5.2.5.2組織的處理方法將所采集的組織至于潔凈、滅菌并烘干的搪瓷盤中，稱取組織按照質(zhì)量體積比（1:5）加入樣品保存液進行充分研磨，4℃條件下3000r/min離心15min。取上清轉(zhuǎn)入無菌的1.5mL的離心管備用，編號。6操作步驟6.1RNA的提取6.1.1用LSTRIzol試劑提取待檢樣品（棉拭子或組織）、陽性對照及陰性對照樣品的RNA。將250μL經(jīng)過預(yù)處理的待檢樣品（棉拭子或組織）加入750μLTRIzolLSReagent中，振蕩2min，室溫放置5min。6.1.3加入250μL氯仿，在微量振蕩器上振蕩1min，室溫放置5min后，4℃條件下12000r/min離心15min。6.1.4吸取上層水相轉(zhuǎn)入一新的離心管中，加入等量的異丙醇，混勻，室溫放置15min，4℃條件下12000r/min離心15min。6.1.5小心吸棄上清，加入DEPC處理的75%乙醇700μL～800μL，4℃條件下12000r/min離心5min。6.1.6小心吸棄上清，將沉淀自然風(fēng)干或于50℃干燥箱中晾干，加適量的DEPC水溶解。6.1.7提取的RNA應(yīng)在2h內(nèi)進行RT-PCR擴增，若需長期保存，應(yīng)至于-80℃的冰箱保存。6.1.8也可采用商品化的病毒核酸提取試劑，按照說明書進行如下操作。同時進行陰陽對照樣品RNA6.1.8.1加入20μL蛋白酶K于1.5mL離心管中，在離心管中加入200μL樣品，加入200μLBB5，渦旋混合15s，56℃孵育15min。3DB13/T2609—20176.1.8.5室溫12000r/min離心1min，徹底去除殘留的乙醇，在室溫靜置1～3min徹底晾干離心柱。6.1.8.6將離心柱轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，并向離心柱中央加20μLRNase-freeWater，室溫靜置1min。6.1.8.7室溫12000r/min離心1min，洗脫RNA。6.1.8.8提取的RNA應(yīng)在2h內(nèi)進行RT-PCR擴增，若需長期保存，應(yīng)至于-80℃的冰箱保存。6.2RT-PCR6.2.1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（cDNA的合成）取上述步驟所得的RNA11μL，加入2μL10μmol//L的反轉(zhuǎn)錄引物（AIV/NDV-RT），4μL5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、0.5μL反轉(zhuǎn)錄酶、0.5μLRNA酶抑制劑、2μLdNTPMixture至20μL，42℃水浴1h，即得到cDNA溶液，直接用于下面的PCR擴增或-20℃凍存?zhèn)溆谩?.2.2PCR反應(yīng)在反應(yīng)管中依次加入8μL無核酸酶水、10μL2×TaqMasterMix、1μL上述cDNA溶液、各0.5μL10μmol/L的上游引物（AIV-decF與NDV-decF）、各0.5μL10μmol/L的下游引物（AIV-decR與NDV-decR）。經(jīng)充分混勻后瞬時離心使液體全部聚集于管底。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性10s，56℃退火30s，72℃延伸25s，循環(huán)30次；72℃延伸5min。擴增反應(yīng)結(jié)束后立即進行電泳或置于4℃條件下備用。7制備1.0%瓊脂糖凝膠板。在電泳槽內(nèi)加入1×TAE電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。取3μL～5μL擴增產(chǎn)物加到凝膠孔，加入DNA分子量標準（100bp）。恒壓（110V）電泳30min～40min，將電泳好的凝膠放到凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。陽性對照的擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，在預(yù)期大小的條帶位置均出現(xiàn)特異性的條帶，陰性的擴增產(chǎn)物沒有預(yù)期的目的條帶，陰陽性同時成立表明試驗有效，否則試驗無效。在試驗結(jié)果成立的前提下，如果樣品的RT-PCR產(chǎn)物電泳后在428bp位置出現(xiàn)特異性的條帶，則判定為禽流感病毒核酸檢測陽性；如果樣品的RT-PCR產(chǎn)物電泳后在297bp位置出現(xiàn)特異性的條帶，則判定為新城疫病毒核酸檢測陽性。如果樣品的RT-PCR產(chǎn)物電泳后在428bp和297bp位置均出現(xiàn)特異性的條帶，則判定為禽流感病毒與新城疫病毒核酸檢測雙陽性；如果樣品的RT-PCR產(chǎn)物電泳后在428bp和297bp位置均未出現(xiàn)特異性的條帶，則判定為禽流感病毒與新城疫病毒核酸檢測雙陰性。RT-PCR產(chǎn)物電泳圖見附錄C中C.1。8依次陳述試驗對象、所使用的標準（包括發(fā)布或出版年號）、所使用的方法、檢測結(jié)果與試驗時4DB13/T2609—2017AA附錄A（規(guī)范性附錄）相關(guān)試劑的配制A.11.0%瓊脂糖凝膠稱取瓊脂糖1.0g，放入100mL1×TAE電泳緩沖液中，加熱融化，溫度降至60℃時，加入5μL核酸染料，均勻鋪板，厚度為3mm～5mm。A.250×TAE電泳緩沖液A.2.10.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）稱取EDTA18.61g，加滅菌雙蒸水至100mL，后用氫氧化鈉調(diào)pH至8.0。A.2.2TAE電泳緩沖液（50×）Tris242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA100mL，加滅菌雙蒸水至1000mL。A.3溴化乙錠（EB）溶液溴化乙錠20mg，加滅菌雙蒸水至20mL。A.4DEPC水焦碳酸二乙酯（DEPC）50μL，加滅菌雙蒸水至100mL，室溫放置6h～8h，121℃±2℃高壓滅菌20min，分裝到1.5mLDEPC處理過的離心管。A.5.1A液（0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液）：NaH2PO4·H2O27.6g先用適量蒸餾水溶解，最后用蒸餾水稀釋至1000mL。A.5.2B液（0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液）：Na2HPO4·7H2O53.6g，（或Na2HPO4·127H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g）先用適量蒸餾水溶解，最后用蒸餾水稀釋至1000mL。A.5.30.01mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液的配制：A液14mL，B液36mL，加氯化鈉（NaCl）8.5g，最后用蒸餾水稀釋至1000mL。5DB13/T2609—2017BB附錄B（規(guī)范性附錄）引物表B.1規(guī)定了引物的濃度和序列。表B.1引物的濃度和序列引物名稱引物濃度10μmol/L10μmol/L10μmol/L10μmol/L10μmol/L序列（5'-3'）AIV-decFCGTAGACGCTTTGTCCAGAATGCAIV-decRNDV-decFNDV-decRAIV/NDV-RTGTCCTC