青霉素工藝流程

青霉素生產(chǎn)工藝班級(jí):生工（2）姓名:學(xué)號(hào):080040【摘要】:青霉素是指分子中含有青霉烷,能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞繁殖期起殺菌作用一類抗生素。青霉素對(duì)溶血性鏈球菌等鏈球菌屬,肺炎鏈球菌和不產(chǎn)青霉素酶葡萄球菌含有良好抗菌作用。對(duì)腸球菌有中等度抗菌作用,淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、白喉棒狀桿菌、炭疽芽孢桿菌、牛型放線菌、念珠狀鏈桿菌、李斯特菌、鉤端螺旋體和梅毒螺旋體對(duì)本品敏感。本品對(duì)流感嗜血桿菌和百日咳鮑特氏菌亦具一定抗菌活性,其她革蘭陰性需氧或兼性厭氧菌對(duì)本品敏感性差.本品對(duì)梭狀芽孢桿菌屬、消化鏈球菌厭氧菌以及產(chǎn)黑色素?cái)M桿菌等具良好抗菌作用,對(duì)脆弱擬桿菌抗菌作用差。青霉素經(jīng)過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁四肽則鏈和五肽交連橋結(jié)合而阻礙細(xì)胞壁合成而發(fā)揮殺菌作用。對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效,因?yàn)楦锾m陰性菌缺乏五肽交連橋而青霉素對(duì)其作用不大?！娟P(guān)鍵詞】:青霉素;生產(chǎn)工藝【正文】:抗生素工業(yè)生產(chǎn)包含發(fā)酵和提取兩部分。工藝步驟大致以下:菌種保藏、孢子制備、種子制備、發(fā)酵、提取和精制。種子和發(fā)酵培養(yǎng)基常見(jiàn)碳源有:葡萄糖、淀粉、蔗糖、油脂、有機(jī)酸等,關(guān)鍵為菌體生長(zhǎng)代謝提供能源,為合成菌體細(xì)胞和目產(chǎn)物提供碳元素。有機(jī)氮源多用玉米漿、黃豆餅粉、麩質(zhì)粉、蛋白胨、酵母粉、魚(yú)粉等,硫酸銨、尿素、氨水、硝酸鈉、硝酸銨則是常見(jiàn)無(wú)機(jī)氮源。另外,培養(yǎng)基中還得添加無(wú)機(jī)鹽、微量元素以及消沫劑,部分抗生素還得加入特殊前體,如青霉素前體是苯乙酸,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素前體是丙酸鹽。發(fā)酵過(guò)程普遍補(bǔ)加一個(gè)碳源、氮源物質(zhì),如葡萄糖和硫酸銨。pH值經(jīng)過(guò)流加氨水進(jìn)行調(diào)整,很多抗生素在發(fā)酵中后期流加前體,對(duì)提升產(chǎn)量非常有益?？股匕l(fā)酵絕大多數(shù)為好氧培養(yǎng),必需連續(xù)通入大量無(wú)菌空氣,全過(guò)程大功率攪拌。發(fā)酵液預(yù)處理,通常加絮凝劑沉淀蛋白,過(guò)濾去除菌絲體,發(fā)酵濾液提取常見(jiàn)溶媒萃取法、離子交換樹(shù)脂法、沉淀法、吸附法等提純濃縮,然后結(jié)晶干燥得純品。一、青霉素概述青霉素是抗菌素一個(gè),是指從青霉菌培養(yǎng)液中提制分子中含有青霉烷、能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞繁殖期起殺菌作用一類抗生素,是第一個(gè)能夠診療人類疾病抗生素。青霉素類抗生素是β-內(nèi)酰胺類中一大類抗生素總稱。但它不能耐受耐藥菌株(如耐藥金葡)所產(chǎn)生酶,易被其破壞,且其抗菌譜較窄,關(guān)鍵對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有效。最初青霉素生產(chǎn)菌是音符型青霉菌,生產(chǎn)能力只有幾十個(gè)單位,不能滿足工業(yè)需要。隨即找到了適合于深層培養(yǎng)橄欖型青霉菌,即產(chǎn)黃青霉。二、發(fā)酵條件下生長(zhǎng)過(guò)程第1期:分生孢子萌發(fā),形成芽管,原生質(zhì)未分化,含有小泡。

第2期:菌絲繁殖,原生質(zhì)體含有嗜堿性,類脂肪小顆粒。

第3期:形成脂肪包涵體,機(jī)理貯藏物,沒(méi)有空泡,嗜堿性很強(qiáng)。

第4期:脂肪包涵體形成小滴并降低,中小空泡,原生質(zhì)體嗜堿性減弱,開(kāi)始產(chǎn)生抗生素。

第5期:形成大空泡,有中性染色大顆粒,菌絲呈桶狀,脂肪包涵體消失,青霉素產(chǎn)量最高。

第6期:出現(xiàn)部分自溶細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)無(wú)顆粒,仍然桶狀。釋放游離氨,pH上升。

第7期:菌絲完全自溶,僅有空細(xì)胞壁。

鏡檢:要求時(shí)間取樣,顯微鏡觀察7個(gè)時(shí)期形態(tài)改變,控制發(fā)酵。

1－4期為菌絲生長(zhǎng)久,3期菌體適宜為種子。

4－5期為生產(chǎn)期,生產(chǎn)能力最強(qiáng),經(jīng)過(guò)工程方法,延長(zhǎng)此期,取得高產(chǎn)。

在第六期到來(lái)之前結(jié)束發(fā)酵。

三、青霉素發(fā)酵工藝過(guò)程青霉素生產(chǎn)步驟:

1、發(fā)酵工藝過(guò)程

（1）生產(chǎn)孢子制備將砂土保藏孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成培養(yǎng)基進(jìn)行斜面培養(yǎng),經(jīng)傳代活化。最適生長(zhǎng)溫度在25~26℃,培養(yǎng)6~8天,得單菌落,再傳斜面,培養(yǎng)7天,得斜面孢子。

移植到優(yōu)質(zhì)小米或大米固體培養(yǎng)基上,生長(zhǎng)7天,25℃,制得小米孢子。

每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn),測(cè)定效價(jià)及雜菌情況。

（2）種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝種子培養(yǎng)要求產(chǎn)生大量健壯菌絲體,所以,培養(yǎng)基應(yīng)加入比較豐富易利用碳源和有機(jī)氮源。青霉素采取三級(jí)發(fā)酵

一級(jí)種子發(fā)酵:發(fā)芽罐.小罐,接入小米孢子后,孢子萌發(fā),形成菌絲。培養(yǎng)基成份:葡萄糖,蔗糖,乳糖,玉米漿,碳酸鈣,玉米油,消沫劑等。通無(wú)菌空氣,空氣流量1:3（體積比）;充足攪拌300－350r/min;40~50小時(shí);pH自然,溫度27±1℃。

二級(jí)發(fā)酵罐:繁殖罐.大量繁殖。玉米漿、葡萄糖等。1:1－1.5;250－280r/min;pH自然,25±1℃;0－14h。

三級(jí)發(fā)酵罐:生產(chǎn)罐?；ㄉ灧郏ǜ邷兀?麩質(zhì)粉、玉米漿、葡萄糖,尿素,硫酸銨,硫酸鈉、硫代硫酸鈉,磷酸二氫鈉,苯乙酰胺及消泡劑,CaCO3等。接種量為12-15%。青霉素發(fā)酵對(duì)溶氧要求極高,通氣量偏大,通氣比控制0.7-1.8;150－200r/min;要求高功率攪拌,100m3發(fā)酵罐攪拌功率在200-300Kw,罐壓控制0.04-0.05MPa,于25-26℃下培養(yǎng),發(fā)酵周期在200h左右。前60h,pH5.7-6.3,后6.3-6.6;前60h為26℃,以后24℃。

四、發(fā)酵過(guò)程控制在青霉素生產(chǎn)中,讓培養(yǎng)基中關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物只夠維持青霉菌在前40h生長(zhǎng),而在40h后,靠低速連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖和氮源等,使菌半饑餓,延長(zhǎng)青霉素合成期,大大提升了產(chǎn)量。所需營(yíng)養(yǎng)物限量補(bǔ)加常見(jiàn)來(lái)控制營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型突變菌種,使代謝產(chǎn)物積累到最大。

（1）培養(yǎng)基青霉素發(fā)酵中采取補(bǔ)料分批操作法,對(duì)葡萄糖、銨、苯乙酸進(jìn)行緩慢流加,維持一定最適濃度。葡萄糖流加,波動(dòng)范圍較窄,濃度過(guò)低使抗生素合成速度減慢或停止,過(guò)高則造成呼吸活性下降,甚至引發(fā)自溶,葡萄糖濃度調(diào)整是依據(jù)pH,溶氧或CO2釋放率給予調(diào)整。碳源選擇:生產(chǎn)菌能利用多個(gè)碳源,乳糖,蔗糖,葡萄糖,阿拉伯糖,甘露糖,淀粉和天然油脂。經(jīng)濟(jì)核實(shí)問(wèn)題,生產(chǎn)成本中碳源占12％以上,對(duì)工藝影響很大;糖與6-APA結(jié)合形成糖基-6-APA,影響青霉素產(chǎn)量。葡萄糖、乳糖結(jié)合能力強(qiáng),而且隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。通常采取葡萄糖和乳糖。發(fā)酵早期,利用快效葡萄糖進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)。當(dāng)葡萄糖耗竭后,利用緩效乳糖,使pH穩(wěn)定,分泌青霉素?？梢罁?jù)形態(tài)改變,滴加葡萄糖,替換乳糖。現(xiàn)在普遍采取淀粉酶水解產(chǎn)物,葡萄糖化液流加。降低成本。

氮源:玉米漿是最好,是玉米淀粉生產(chǎn)時(shí)副產(chǎn)品,含有多個(gè)氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。玉米漿質(zhì)量不穩(wěn)定,可用花生餅粉或棉籽餅粉替換。補(bǔ)加無(wú)機(jī)氮源。

無(wú)機(jī)鹽:硫、磷、鎂、鉀等。鐵有毒,控制在30μg/ml以下。

流加控制:補(bǔ)糖,依據(jù)殘?zhí)恰H、尾氣中CO2和O2含量。殘?zhí)窃?.6％左右,pH開(kāi)始升高時(shí)加糖。補(bǔ)氮:流加酸酸銨、氨水、尿素,控制氨基氮0.05%。

添加前體:合成階段,苯乙酸及其衍生物,苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可為青霉素側(cè)鏈前體,直接摻入青霉素分子中。也含有刺激青霉素合成作用。但濃度大于0.19％時(shí)對(duì)細(xì)胞和合成有毒性。還能被細(xì)胞氧化。策略是流加低濃度前體,一次加入量低于0.1%,保持供給速率略大于生物合成需要。

（2）溫度一生長(zhǎng)適宜溫度30℃,分泌青霉素溫度20℃。但20℃青霉素破壞少,周期很長(zhǎng)。生產(chǎn)中采取變溫控制,不一樣階段不一樣溫度。前期控制25－26℃左右,后期降溫控制23℃。過(guò)高則會(huì)降低發(fā)酵產(chǎn)率,增加葡萄糖維持消耗,降低葡萄糖至青霉素轉(zhuǎn)化得率。有發(fā)酵過(guò)程在菌絲生長(zhǎng)階段采取較高溫度,以縮短生長(zhǎng)時(shí)間,生產(chǎn)階段合適降低溫度,以利于青霉素合成。

（3）pH合成適宜pH6.4－6.6左右,避免超出7.0,青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定,易水解。緩沖能力弱培養(yǎng)基,pH降低,意味著加糖率過(guò)高造成酸性中間產(chǎn)物積累。（4）溶氧溶氧＜30％飽和度,產(chǎn)率急劇下降,低于10％,則造成不可逆損害。所以不能低于30％飽和溶氧濃度。通氣比通常為1:0.8VVM。溶氧過(guò)高,菌絲生長(zhǎng)不良或加糖率過(guò)低,呼吸強(qiáng)度下降,影響生產(chǎn)能力發(fā)揮。適宜攪拌速度,確保氣液混合,提升溶氧,依據(jù)各階段生長(zhǎng)和耗氧量不一樣,對(duì)攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整。（5）菌絲生長(zhǎng)速度與形態(tài)、濃度對(duì)于每個(gè)有固定通氣和攪拌條件發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行特定好氧過(guò)程,都有一個(gè)使氧傳輸速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上達(dá)成平衡臨界菌絲濃,超出此濃度,OUR＞OTR,溶氧水平下降,發(fā)酵產(chǎn)率下降。在發(fā)酵穩(wěn)定時(shí),濕菌濃可達(dá)15~20%,絲狀菌干重約3%,球狀菌干重在5%左右。另外,因補(bǔ)入物料較多,在發(fā)酵中后期通常天天帶放一次,每次放掉總發(fā)酵液10%左右。有絲狀生長(zhǎng)和球狀生長(zhǎng)兩種。前者因?yàn)槿烤z體都能充足和發(fā)酵液中基質(zhì)及氧接觸,比生產(chǎn)率高,發(fā)酵粘度低,氣/液兩相中氧傳輸率提升,許可更多菌絲生長(zhǎng)。球狀菌絲形態(tài)控制,與碳、氮源流加情況,攪拌剪切強(qiáng)度及稀釋度相關(guān)。

（6）消沫發(fā)酵過(guò)程泡沫較多,需補(bǔ)入消沫劑。天然油脂:玉米油;化學(xué)消沫劑:泡敵。少許數(shù)次。不適在前期多加入,影響呼吸代謝。青霉素發(fā)酵過(guò)程控制十分精細(xì),通常2h取樣一次,測(cè)定發(fā)酵液pH、菌濃、殘?zhí)?、殘氮、苯乙酸濃度、青霉素效價(jià)等指標(biāo),同時(shí)取樣做無(wú)菌檢驗(yàn),發(fā)覺(jué)染菌立刻結(jié)束發(fā)酵,視情況放過(guò)濾提取,因?yàn)槿揪髉H值波動(dòng)大,青霉素在多個(gè)小時(shí)內(nèi)就會(huì)被全部破壞。五、青霉素提煉工藝過(guò)程青霉素提純工藝步驟簡(jiǎn)圖:

青霉素不穩(wěn)定,發(fā)酵液預(yù)處理、提取和精制過(guò)程要條件溫和、快速,預(yù)防降解。

1.預(yù)處理發(fā)酵液結(jié)束后,目標(biāo)產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中,而且濃度較低,如抗生素只有10－30Kg/m3,含有大量雜質(zhì),它們影響后續(xù)工藝有效提取,所以必需對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理,目在于濃縮目產(chǎn)物,去除大部分雜質(zhì),改變發(fā)酵液流變學(xué)特征,利于后續(xù)分離純化過(guò)程。是進(jìn)行分離純化一個(gè)工序。

2.過(guò)濾發(fā)酵液在萃取之前需預(yù)處理,發(fā)酵液加少許絮凝劑沉淀蛋白,然后經(jīng)真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾或板框過(guò)濾,除掉菌絲體及部分蛋白。青霉素易降解,發(fā)酵液及濾液應(yīng)冷至10℃以下,過(guò)濾收率通常90%左右。

（1）菌絲體粗長(zhǎng)10μm,采取鼓式真空過(guò)濾機(jī)過(guò)濾,濾渣形成緊密餅狀,輕易從濾布上刮下。濾液pH6.27-7.2,蛋白質(zhì)含量0.05-0.2%。需要深入除去蛋白質(zhì)。

（2）改善過(guò)濾和除去蛋白質(zhì)方法:硫酸調(diào)整pH4.5-5.0,加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB,0.7%硅藻土為助濾劑。再經(jīng)過(guò)板框式過(guò)濾機(jī)。濾液澄清透明,進(jìn)行萃取。

3.萃取青霉素提取采取溶媒萃取法。青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑,而青霉素鹽易溶于水。利用這一性質(zhì),在酸性條件下青霉素轉(zhuǎn)入有機(jī)溶媒中,調(diào)整pH,再轉(zhuǎn)入中性水相,反復(fù)幾次萃取,即可提純濃縮。選擇對(duì)青霉素分配系數(shù)高有機(jī)溶劑。工業(yè)上通常見(jiàn)醋酸丁酯和戊酯。萃取2－3次。從發(fā)酵液萃取到乙酸丁酯時(shí),pH選擇1.8-2.0,從乙酸丁酯反萃到水相時(shí),pH選擇6.8-7.4。發(fā)酵濾液與乙酸丁酯體積比為1.5-2.1,即一次濃縮倍數(shù)為1.5-2.1。為了避免pH波動(dòng),采取硫酸鹽、碳酸鹽緩沖液進(jìn)行反萃。發(fā)酵液與溶劑百分比為3－4。幾次萃取后,濃縮10倍,濃度幾乎達(dá)成結(jié)晶要求。萃取總收率在85％左右。

所得濾液多采取二次萃取,用10%硫酸調(diào)pH2.0~3.0,加入醋酸丁酯,用量為濾液體積三分之一,反萃取時(shí)常見(jiàn)碳酸氫鈉溶液調(diào)pH7.0~8.0。在一次丁酯萃取時(shí),因?yàn)闉V液含有大量蛋白,通常加入破乳劑預(yù)防乳化。第一次萃取,存在蛋白質(zhì),加0.05-0.1%乳化劑PPB。

萃取條件:為降低青霉素降解,整個(gè)萃取過(guò)程應(yīng)在低溫下進(jìn)行（10℃以下）。萃取罐冷凍鹽水冷卻。

4.脫色萃取液中添加活性炭,除去色素、熱源,過(guò)濾,除去活性炭。

5.結(jié)晶萃取液通常經(jīng)過(guò)結(jié)晶提純。青霉素鉀鹽在醋酸丁酯中溶解度很小,在二次丁酯萃取液中加入醋酸鉀-乙醇溶液,青霉素鉀鹽就結(jié)晶析出。然后采取重結(jié)晶方法,深入提升純度,將鉀鹽溶于KOH溶液,調(diào)pH至中性,加無(wú)水丁醇,在真空條件下,共沸蒸餾結(jié)晶得純品。

直接結(jié)晶:在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸鈉－乙醇溶液反應(yīng),得到結(jié)晶鈉鹽。加醋酸鉀－乙醇溶液,得到青霉素鉀鹽。

共沸蒸餾結(jié)晶:萃取液,再用0.5MNaOH萃取,pH6.4-4.8下得到鈉鹽水濃縮液。加2.5倍體積丁醇,16－26℃,0.67-1.3KPa下蒸餾。水和丁醇形成共沸物而蒸出。鈉鹽結(jié)晶析出。結(jié)晶經(jīng)過(guò)洗滌、干燥后,得到青霉素產(chǎn)品。六、用藥相關(guān)1青霉素類毒性很低,但較易發(fā)生變態(tài)反應(yīng),發(fā)生率約為5%10%。多見(jiàn)為皮疹、哮喘、藥品熱、嚴(yán)重可致過(guò)敏性休克而引發(fā)死亡。2大劑量應(yīng)用青霉素抗感染時(shí),可出現(xiàn)神經(jīng)精神癥狀,如反射亢進(jìn)、知覺(jué)障礙、抽搐、昏睡等,停藥或降低劑量可恢復(fù)。3使用青霉素前必需作皮膚過(guò)敏試驗(yàn)。假如發(fā)生過(guò)敏性休克,應(yīng)立刻皮下或肌內(nèi)注射0.1%腎上腺素0.5ml～1ml,同時(shí)給氧并使用抗組胺藥品及腎上腺皮質(zhì)激素等。4肌注鉀鹽時(shí)局部疼痛較顯著,用苯甲醇溶液作為稀釋劑溶解,則可消除疼痛?！緟⒖嘉募?【1】長(zhǎng)久有效青霉素不一樣注射方法效果比較中國(guó)誤診學(xué)雜志/02中