實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 猴免疫缺陷病毒檢驗(yàn)方法 征求意見(jiàn)稿

2GB/T14926.62—202X本文件規(guī)定了猴免疫缺陷病毒（SIV）的檢測(cè)方法。本文件適用于猴免疫缺陷病毒抗體檢測(cè)，以及懷疑本病發(fā)生，實(shí)驗(yàn)猴環(huán)境和猴源性生物制品中SIV病毒核酸的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14926.50實(shí)驗(yàn)動(dòng)物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)GB/T14926.52實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫熒光試驗(yàn)GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3原理3.1抗體檢測(cè)原理根據(jù)免疫學(xué)原理，采用SIV抗原檢測(cè)猴血清中SIV抗體。3.2核酸檢測(cè)原理根據(jù)猴免疫缺陷病毒保守序列SIVmac251株gag基因設(shè)計(jì)特異的引物和探針序列，擴(kuò)增目的片段，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)樣品中是否含有病毒核酸成分。4主要試劑和器材4.1試劑：4.1.1ELISA抗原4.1.1.1特異性抗原用SIV感染CM-174細(xì)胞，接種10～14d，細(xì)胞融合明顯時(shí)，收獲培養(yǎng)液。凍融三次或超聲波處理后，低速離心去除細(xì)胞碎片，上清液再經(jīng)超速離心濃縮后制成ELISA抗原。4.1.1.2正常抗原CM-174細(xì)胞凍融破碎后，經(jīng)低速離心去除細(xì)胞碎片而獲得的上清液。4.1.2抗原片SIV感染CM-174細(xì)胞，接種10-14d,病變達(dá)時(shí)，800r/min離心5~3GB/T14926.62—202Xl0min，PBS洗滌涂片。室溫干燥的同時(shí)，在紫外線下20cm處照射30min,冷丙酮固定10min。-20℃保存。4.1.3陽(yáng)性血清SIV抗原免疫的猴血清。4.1.4陰性血清無(wú)SIV感染的猴血清。4.1.5酶結(jié)合物辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊或兔抗猴IgG抗體。4.1.6異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊或兔抗猴IgG抗體4.1.7核酸檢測(cè)試劑4.1.7.1經(jīng)DEPC處理的無(wú)RNA酶水或商品無(wú)RNA酶水。4.1.7.2RNA抽提試劑：市售商品化試劑。4.1.7.3逆轉(zhuǎn)錄試劑：市售商品化試劑。4.1.7.4實(shí)時(shí)熒光PCR基礎(chǔ)反應(yīng)液：市售商品化試劑4.1.7.5陽(yáng)性對(duì)照：含有SIV病毒核酸的組織樣本或細(xì)胞培養(yǎng)物。4.1.7.6陰性對(duì)照：不含SIV病毒核酸的組織樣本或細(xì)胞培養(yǎng)物。4.1.7.7引物和探針：根據(jù)表1的序列合成，引物和探針配制成10μmol/L儲(chǔ)備液，-20℃保存。表1SIV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增引物和探針注：探針也可選用具有與FAM和BHQ-1熒光基團(tuán)相同檢測(cè)效果的其他合適的熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基4.2器材4.2.1酶標(biāo)儀。4.2.2熒光顯微鏡。4.2.337℃培養(yǎng)箱或水浴箱。4GB/T14926.62—202X4.2.4PCR儀。4.2.5實(shí)時(shí)熒光PCR儀。4.2.6高速冷凍離心機(jī)。4.2.7普通離心機(jī)。4.2.8恒溫孵育器。4.2.9漩渦振蕩器。4.2.10組織勻漿器。4.2.11生物安全柜。4.2.12PCR超凈工作臺(tái)。4.2.13微量移液器（0.1～2μL，1～10μL，10～100μL，100～1000μL）。200μL，1mL），無(wú)RNase的PCR擴(kuò)增反應(yīng)管（八連管或96孔板）。4.2.15采樣工具：剪刀、鑷子和注射器等。5檢測(cè)方法5.1生物安全措施實(shí)驗(yàn)操作及處理按照GB19489的規(guī)定，由具備相關(guān)資質(zhì)的工作人員進(jìn)行相應(yīng)操作。5.2采用ELISA方法（見(jiàn)GB/T14926.50）進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，或使用經(jīng)驗(yàn)證的等效商品化試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。5.3采用IFA方法（見(jiàn)GB/T14926.52）進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，或使用經(jīng)驗(yàn)證的等效商品化試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。5.4采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行SIV核酸檢測(cè)（見(jiàn)附錄A），或使用經(jīng)驗(yàn)證的等效商品化試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。6結(jié)果判定6.6.1抗體檢測(cè)結(jié)果判定對(duì)陽(yáng)性或可疑結(jié)果，選用同一種抗體檢測(cè)方法或另一種抗體檢測(cè)方法復(fù)測(cè)。如仍為陽(yáng)性則判為陽(yáng)性。6.26.2核酸檢測(cè)結(jié)果判定對(duì)陽(yáng)性或可疑結(jié)果，用同一種核酸檢測(cè)方法復(fù)測(cè)，或取可疑陽(yáng)性樣本PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測(cè)定，如仍為陽(yáng)性，則判為陽(yáng)性。5GB/T14926.62—202X7結(jié)果報(bào)告根據(jù)判定結(jié)果，作出報(bào)告。6GB/T14926.62—202X（規(guī)范性附錄）猴免疫缺陷病毒核酸檢測(cè)方法A.1采樣及樣本的處理A.1.1血液抗凝血：無(wú)菌采集動(dòng)物血液1~2mL，加入枸櫞酸鈉抗凝管中，編號(hào)備用。血漿：將抗凝血3000r/min離心10min，取上清，轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，編號(hào)備A.1.2臟器組織死亡動(dòng)物可無(wú)菌采集動(dòng)物的淋巴結(jié)和脾臟，剪取待檢樣品2.0g于研缽中充分研磨，再加4ml滅菌PBS混勻，或置于組織勻漿器中，加入4mlPBS勻漿，然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無(wú)菌5mL離心管中3000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌5mL離心管中，編號(hào)備用。A.1.3細(xì)胞培養(yǎng)物將樣品樣本接種后出現(xiàn)CPE或可疑的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融三次，細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移于15mL離心管中，12000r/min離心10min，去細(xì)胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌15mL離心管中，編號(hào)備用。A.1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境A.1.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料、墊料和飲水取適量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料和墊料置于無(wú)菌容器中，加入適量滅菌PBS（飼料和墊料需全部浸泡于液體中）。密封后浸泡5~10min，充分混勻，將混懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，4℃,12,000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌5mL離心管中，編號(hào)備用。取適量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲水直接轉(zhuǎn)移到無(wú)菌5mL離心管中，編號(hào)備用。A.1.4.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施設(shè)備用滅菌棉拭子拭取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施設(shè)備出風(fēng)口初效濾膜表面沉積物，將拭子置入滅菌15mL離心管，加入適量滅菌PBS，浸泡5~10min，充分混勻，取出棉拭子，將離心管于4℃,12000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌5mL離心管中，編號(hào)備用。A.1.5樣本的存放7GB/T14926.62—202X采集或處理的樣本在2～8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h，若需長(zhǎng)期保存，須放置-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過(guò)3次）。A.2病毒核酸提取選擇市售商品化RNA提取試劑盒（檢測(cè)前病毒時(shí)，選擇DNA提取試劑盒）。按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取樣品中的核酸。在提取核酸時(shí)應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣品，按同樣方法提取核酸。核酸提取操作應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，避免溶膠的污染。制備好的核酸應(yīng)盡快進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)，若暫時(shí)不能進(jìn)行PCR反應(yīng)，應(yīng)于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩.3實(shí)時(shí)熒光RT-PCRA.3.1反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。反應(yīng)液的配制在冰上操作，每次反應(yīng)同時(shí)設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，其中陽(yáng)性對(duì)照以含有猴免疫缺陷病毒的組織或細(xì)胞培養(yǎng)物提取的RNA作為陽(yáng)性對(duì)照模板，其中陰性對(duì)照以不含有猴免疫缺陷病毒RNA樣品（可以是正常動(dòng)物組織或正常細(xì)胞培養(yǎng)物）作為陰性對(duì)照模板，空白對(duì)照即為不加模板對(duì)照（NoTemplateControl，NTC即在反應(yīng)中用水來(lái)代替模板。表2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系配制表11215A.3.2反應(yīng)參數(shù)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)見(jiàn)表3：8GB/T14926.62—202X表3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)否1否1否是試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。A.4結(jié)果判定A.4.1結(jié)果分析和條件設(shè)定直接讀取檢測(cè)結(jié)果，基線和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器的噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性樣品樣本擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。A.4.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)空白對(duì)照無(wú)Ct值，并且無(wú)熒光擴(kuò)增曲線。陰性對(duì)照無(wú)Ct值，并且無(wú)熒光擴(kuò)增曲線。陽(yáng)性對(duì)照Ct值應(yīng)≤35，并且有明顯的熒光擴(kuò)增曲線，則表明反應(yīng)體系運(yùn)行正常，否則此次試驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增。A.4.3結(jié)果判定質(zhì)控成立條件下，若待檢測(cè)樣品樣本無(wú)熒光擴(kuò)增曲線，則判定樣品樣本未檢出猴免疫缺陷病毒核酸陰性。質(zhì)控成立條件下，若待檢測(cè)樣品樣本有熒光擴(kuò)增曲線，且Ct值應(yīng)≤35時(shí)，則判斷樣品樣本中檢出猴免疫缺陷病毒核酸陽(yáng)性。質(zhì)控成立條件下，若待檢測(cè)樣品樣本Ct值介于35和40之間時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)。重新檢測(cè)后，若Ct值≥40時(shí)，則判定樣品樣本未檢出猴免疫缺陷病毒核酸陰性。重新檢測(cè)后的Ct值仍介于35和40之間，則判定樣品樣本檢出猴免疫缺陷病毒核酸