生物工程設(shè)備：第四章 植物細(xì)胞（組織）和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

第四章植物細(xì)胞（組織）和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器第一節(jié)植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)反應(yīng)器第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器第三節(jié)微藻培養(yǎng)反應(yīng)器

第一節(jié)植物組織（細(xì)胞）培養(yǎng)反應(yīng)器

植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的特點(diǎn)

植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器植物組織培養(yǎng)反應(yīng)器細(xì)胞與組織培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)都屬于體外培養(yǎng)是指生物細(xì)胞和組織在離體條件下的生長(zhǎng)和增殖，是細(xì)胞工程的最基本技術(shù)。

試管植物一、植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的特點(diǎn)柑橘的組織培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在人工控制下高密度大量培養(yǎng)有益植物細(xì)胞技術(shù)稱之為植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，其目的在于通過(guò)細(xì)胞工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)，獲得細(xì)胞、初級(jí)及次級(jí)代謝產(chǎn)物，為藥品、食品及化工行業(yè)提供服務(wù)。盡管植物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室與工業(yè)化培養(yǎng)在技術(shù)上有許多相似之處，但培養(yǎng)方式、設(shè)備及條件和培養(yǎng)基等亦有很大差別。植物細(xì)胞培養(yǎng)流程蝴蝶蘭試管苗工廠化生產(chǎn)

植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的特點(diǎn)二、植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器懸浮細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器機(jī)械攪拌式反應(yīng)器非機(jī)械攪拌式（氣體攪拌式）反應(yīng)器固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器填充床反應(yīng)器流化床反應(yīng)器膜反應(yīng)器1.懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器機(jī)械攪拌反應(yīng)器

日本最早1972培養(yǎng)煙草細(xì)胞獲取尼古??；下圖是目前最大的植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器裝置植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

一般認(rèn)為，氣體攪拌反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、傳氧速率高以及剪切力低，更適合于植物細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)需結(jié)合植物細(xì)胞生長(zhǎng)代謝特性對(duì)其加以改造更適合植物細(xì)胞的培養(yǎng)。非機(jī)械攪拌式(氣體攪拌式)反應(yīng)器非機(jī)械攪拌（氣體攪拌）反應(yīng)器類型鼓泡式反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器（內(nèi)循環(huán)和外循環(huán)）氣體攪拌式反應(yīng)器的優(yōu)缺點(diǎn)非機(jī)械攪拌反應(yīng)器的應(yīng)用

韓國(guó)KBT植物細(xì)胞反應(yīng)器

很多研究表明，氣體攪拌反應(yīng)器尤其是氣升攪拌反應(yīng)器十分適合植物細(xì)胞培養(yǎng)與次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成。我國(guó)八五期間發(fā)明氣升內(nèi)錯(cuò)流反應(yīng)器生產(chǎn)紫草寧，細(xì)胞量達(dá)12gdw/L，紫草寧含量達(dá)細(xì)胞干重的10%，是天然植株含量的2~8倍。下圖是新疆紫草細(xì)胞培養(yǎng)流程

紫草細(xì)胞培養(yǎng)紫草種子無(wú)菌幼根LS培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)懸浮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)細(xì)胞增殖培養(yǎng)一級(jí)培養(yǎng)2.固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器填充床反應(yīng)器流化床反應(yīng)器1—旋風(fēng)分離器2—筒體擴(kuò)大段3—催化劑入口4—筒體5—冷卻介質(zhì)出口6—換熱器7—冷卻介質(zhì)進(jìn)口8—?dú)怏w分布板9—催化劑出口10—反應(yīng)氣入口

流化床反應(yīng)器：固體顆粒被流體吹起呈懸浮狀態(tài)，可作上下左右劇烈運(yùn)動(dòng)和翻動(dòng)，好象是液體沸騰一樣，故流化床反應(yīng)器又稱沸騰床反應(yīng)器。通過(guò)流體的上升運(yùn)動(dòng)使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)，適合于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)。流化床反應(yīng)器示意圖膜反應(yīng)器中空纖維生物反應(yīng)器中空纖維反應(yīng)器的構(gòu)造中空纖維生物反應(yīng)器的用途用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。螺旋式卷繞反應(yīng)器三、植物組織培養(yǎng)反應(yīng)器發(fā)狀根大規(guī)模培養(yǎng)小植物的大規(guī)?？焖俜敝嘲l(fā)狀根大規(guī)模培養(yǎng)

由根農(nóng)桿菌感染雙子葉雙子葉植物形成的發(fā)狀根—新的培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)狀根生長(zhǎng)迅速、遺傳性穩(wěn)定、生化特性不易改變、易于遺傳操作

傳統(tǒng)藥材（根部）：人參、丹參、甘草等。發(fā)狀根大規(guī)模培養(yǎng)流化床反應(yīng)器培養(yǎng)黃花蒿發(fā)狀根內(nèi)環(huán)噴霧生物反應(yīng)器培養(yǎng)馬鈴薯無(wú)菌芽小植物的大規(guī)?？焖倥囵B(yǎng)從兩條不同途徑考慮采用組織培養(yǎng)反應(yīng)器進(jìn)行植物的快速繁殖。形成不定芽的途徑從植株莖尖誘導(dǎo)不定芽后，在反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)不定芽或不定根。形成胚狀體的途徑從植株外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織得到體胚，然后在反應(yīng)器內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)體胚，最終制成人工種子。自1981年報(bào)道培養(yǎng)矮牽牛后，已進(jìn)行草莓、香蕉苗、百合、蘭花、唐菖蒲等的莖、芽、微小塊莖、球莖、體細(xì)胞、小植物和合成種子的大規(guī)模培養(yǎng)，規(guī)模達(dá)1000L。應(yīng)用大規(guī)模懸浮培養(yǎng)來(lái)快速繁殖植物是繼試管繁殖后又一十分有用的技術(shù)

華南理工大學(xué)和中科院華南植物所合作開發(fā)適合香蕉高經(jīng)濟(jì)作物的淺層循環(huán)式植株快速繁殖器，獲得實(shí)用新型專利。淺層循環(huán)式植株快速繁殖器雙層板徑向流生物反應(yīng)器培養(yǎng)唐菖蒲原球莖發(fā)菜管道光生物反應(yīng)器第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

20世紀(jì)70年代以來(lái)基因工程和雜交瘤技術(shù)的迅速發(fā)展，通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)可得到許多與人類健康和生存有關(guān)的生物技術(shù)產(chǎn)品如病毒疫苗、干擾素，診斷試劑、治療蛋白等高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)。

動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)有明顯的優(yōu)勢(shì)。為傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵技術(shù)無(wú)法代替。應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)各種生物活性物質(zhì)是一種比較經(jīng)濟(jì)可靠的技術(shù)。不完全統(tǒng)計(jì)，世界上有10000多個(gè)實(shí)驗(yàn)室，400家工廠生產(chǎn)生物技術(shù)產(chǎn)品的研究代表性培養(yǎng)裝置：氣升式深層培養(yǎng)系統(tǒng)、微載體、大載體、微囊以及中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)。擴(kuò)大

貼壁依賴性細(xì)胞：

大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞，需附著在帶正電荷的固體或半固體表面生長(zhǎng)（多采用貼壁培養(yǎng)）

非貼壁依賴性細(xì)胞：

源于血液、淋巴、腫瘤細(xì)胞（多采用懸浮培養(yǎng)）

體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞類型

貼壁依賴性細(xì)胞非貼壁依賴性細(xì)胞（懸浮細(xì)胞）高密度低密度一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法1.貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)裝置

大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞如Hela,Vero,BHK,CHO等常采用的細(xì)胞系的常用培養(yǎng)設(shè)備：滾瓶

滾瓶培養(yǎng)裝置優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，投資少，技術(shù)成熟，重現(xiàn)性好，擴(kuò)大培養(yǎng)簡(jiǎn)單，增瓶。缺點(diǎn)：勞動(dòng)強(qiáng)度大，表面積小，占用空間大，體積細(xì)胞產(chǎn)率低，監(jiān)控環(huán)境條件限制。2.懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長(zhǎng)的過(guò)程.

非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)（雜交瘤細(xì)胞）

懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：?傳代時(shí)不需要再分散，只需按比例稀釋后即可繼續(xù)培養(yǎng)。?細(xì)胞增殖快，產(chǎn)量高，培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單，是大規(guī)模

養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的理想模式。在動(dòng)物體中只有少數(shù)種類的細(xì)胞適于懸浮培養(yǎng)(沒(méi)有細(xì)胞壁、不耐劇烈的通氣和攪拌)3.固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)特點(diǎn)采用包埋培養(yǎng)，適合兩類細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度高,抗剪切力和抗污染力強(qiáng)對(duì)非貼壁依賴性細(xì)胞,采用海藻酸鈣包埋對(duì)貼壁依賴性細(xì)胞,采用膠原包埋.無(wú)論懸浮培養(yǎng)還是貼壁培養(yǎng)，從操作方式可分為：分批式操作流加式操作半連續(xù)式操作:

反復(fù)分批式培養(yǎng),換液培養(yǎng)連續(xù)式操作灌注式操作二、細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式三、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器類型通氣攪拌式細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器氣升式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器微囊培養(yǎng)系統(tǒng)大載體系統(tǒng)微載體系統(tǒng)通氣攪拌式細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器傳統(tǒng)機(jī)械攪拌懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器優(yōu)點(diǎn)：混合性能好傳氧效率高操作彈性大可用于細(xì)胞高密度培養(yǎng)；缺點(diǎn)：剪切力大。原始籠式通氣攪拌器氣泡用絲網(wǎng)隔開，避免在向培養(yǎng)基通氣時(shí)損傷細(xì)胞。同時(shí)采用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)，微載體不會(huì)被由于通氣所產(chǎn)生的泡沫滯留氣液界面?；\式通氣攪拌細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

工作原理:反應(yīng)器運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，圓筒以30-60r/min的速度轉(zhuǎn)動(dòng)，由于離心力的作用，攪拌器中心管內(nèi)產(chǎn)生負(fù)壓，使攪拌器外培養(yǎng)基流入中心管，沿管螺旋上升，再?gòu)膶?dǎo)流筒口排出，從攪拌器外沿下降，形成循環(huán)流動(dòng)。在氣腔內(nèi)氣體由分布管鼓泡，氣體溶于液體中，依靠氣腔絲網(wǎng)外液體的循環(huán)流動(dòng)及擴(kuò)散作用，使溶于液體中的氣體成分均勻地分布到反應(yīng)器內(nèi)?；\式通氣攪拌細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器籠式通氣攪拌反應(yīng)器的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：避免向培養(yǎng)基直接通氣時(shí)氣泡損傷細(xì)胞，沒(méi)有移動(dòng)部件，密封好，氧轉(zhuǎn)換率較高，便于放大。缺點(diǎn)：氧傳遞系數(shù)小，不能滿足高密度培養(yǎng)的耗氧；氣路系統(tǒng)不能就地滅菌。

反應(yīng)器適用范圍:

懸浮培養(yǎng)：非貼壁依賴性細(xì)胞和貼壁于微載體的貼壁細(xì)胞氣升式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器與微生物及植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器結(jié)構(gòu)相同階梯式培養(yǎng)系統(tǒng)：滾瓶1L接種10L罐，2~3d，106/ml，接種100L，為1000L罐準(zhǔn)備種子從10~1000L需17天時(shí)間，生產(chǎn)單克隆抗體100g。英國(guó)的Celltech公司首先采用氣升式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體，工藝流程如圖：氣升式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器優(yōu)點(diǎn)沒(méi)有移動(dòng)部件完全密封便于無(wú)菌操作不易污染設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單便于放大生產(chǎn)氧的轉(zhuǎn)換率高等較好滿足了該培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)所需的要求。中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)培養(yǎng)體積小，細(xì)胞高密度生長(zhǎng)有濃縮產(chǎn)品的功能產(chǎn)物純度高自動(dòng)化程度高，細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)缺點(diǎn)

中空纖維價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本高。微囊培養(yǎng)系統(tǒng)上世紀(jì)70年代，lin和Sun把生物活性物質(zhì)、完整活細(xì)胞或組織包在薄的半透膜中，即稱為微膠囊技術(shù)。

操作過(guò)程如下：

1.4%海藻酸鈉氯化鈣囊內(nèi)細(xì)胞得到充分的營(yíng)養(yǎng)，獲得高達(dá)1.4x108/ml的細(xì)胞密度。細(xì)胞密度大，分泌物產(chǎn)量高。培養(yǎng)周期為2～3周?？贵w濃度達(dá)110mg/ml，為常規(guī)培養(yǎng)的50～100倍微囊培養(yǎng)系統(tǒng)的特點(diǎn)細(xì)胞密度大；產(chǎn)物單位體積濃度高；分離純化操作經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便；抗體活性、純度好。

但微囊技術(shù)成功率一般只有50％左右，培養(yǎng)液用量大；囊內(nèi)部分死亡細(xì)胞對(duì)產(chǎn)物的污染；這些問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究改進(jìn)。大載體系統(tǒng)美國(guó)Bellco生物工程公司新設(shè)計(jì)的大載休培養(yǎng)系統(tǒng)如圖：配有先進(jìn)的主要部件．如溶解氧、pH測(cè)定以及培養(yǎng)液輸入和產(chǎn)物的收獲均由微機(jī)程控調(diào)節(jié)。制作過(guò)程：

大載體制作大載體培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)操作控制方便，可隨機(jī)取樣檢測(cè)；附著細(xì)胞密度高；消耗用品價(jià)格低廉，產(chǎn)物收獲量大，有明顯經(jīng)濟(jì)效益。但該系統(tǒng)不具有細(xì)胞分泌產(chǎn)物的濃縮裝置。我國(guó)1987年引進(jìn)上述大載體培養(yǎng)系統(tǒng)，生產(chǎn)單克隆抗體作為人血型定型。微載體培養(yǎng)方法將動(dòng)物細(xì)胞吸附于微載體表面，在培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，使細(xì)胞在微載體表面長(zhǎng)成單層的培養(yǎng)方法稱為微載體培養(yǎng)法或微珠培養(yǎng)法。制備微載體的材料主要有：–葡聚糖（DEAE-SephadexA50及A25）–塑料–明膠–玻璃–纖維素不同微載體微載體培養(yǎng)系統(tǒng)原理用固體小顆粒作為載體，細(xì)胞在載體的表面附著，通過(guò)連續(xù)攪拌懸浮于培養(yǎng)液中，并形成單層生長(zhǎng)、繁殖。隨著細(xì)胞附著面的擴(kuò)大，細(xì)胞能充分利用生長(zhǎng)空間和營(yíng)養(yǎng)液，提高細(xì)胞生產(chǎn)效率和產(chǎn)量。微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)動(dòng)物細(xì)胞微珠培養(yǎng)裝置微載體懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器

微載體細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器微載體培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)具有較高的表面積體積比生長(zhǎng)環(huán)境均一，條件易于控制，放大容易；兼具貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，而且是均相培養(yǎng)；取樣和細(xì)胞汁數(shù)簡(jiǎn)單；細(xì)胞和培養(yǎng)液易于分離；大規(guī)模培養(yǎng)只需對(duì)微生物攪拌式或氣升式培養(yǎng)系統(tǒng)稍加改進(jìn)即可適合于培養(yǎng)原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞株，它對(duì)生產(chǎn)重組產(chǎn)品來(lái)說(shuō)是必不可少的有效方法。流感疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)(A)細(xì)胞培養(yǎng)(B)離心分離(C)超濾、洗濾。大規(guī)模微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗四、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的應(yīng)用疫苗干擾素單克隆抗體其他基因重組產(chǎn)品動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)存在的問(wèn)題?細(xì)胞密度低，細(xì)胞生產(chǎn)率低，產(chǎn)物濃度也很低?細(xì)胞群體在大規(guī)模、長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中分泌產(chǎn)物能力的丟失或產(chǎn)物活性的降低依然是細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域深感棘手的問(wèn)題。?動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體頗為昂貴，限制了細(xì)胞培養(yǎng)工程在發(fā)展中國(guó)家的開展。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展的總方向大型化、自動(dòng)化、精巧化、低成本、高細(xì)胞密度、高目的產(chǎn)品產(chǎn)量。–開發(fā)能高密度生長(zhǎng)、能分泌大量目標(biāo)產(chǎn)品的細(xì)胞系–開發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)性能優(yōu)良、解離細(xì)胞容易，并能重復(fù)

使用的新型廉價(jià)微載體。–研制更大規(guī)模的高無(wú)菌條件的生物反應(yīng)器和剪切力小、混合性能良好的新型攪拌系統(tǒng)。–傳感器、自動(dòng)控制技術(shù)的應(yīng)用–開發(fā)新型無(wú)血清培養(yǎng)基第三節(jié)微藻培養(yǎng)反應(yīng)器螺旋藻(Spirulina)小球藻(Chlorella)杜氏藻(Dunaliella)

一、微藻生物技術(shù)的優(yōu)越性光能利用率高；易收獲和加工；商品價(jià)值高；繁殖快螺旋藻小球藻杜氏藻螺旋藻商品二、微藻大規(guī)模培養(yǎng)的特點(diǎn)微藻培養(yǎng)過(guò)程要有足夠的光照；必須供應(yīng)大量的CO2，同時(shí)要把產(chǎn)生的O2排出；其除了要進(jìn)行氣液、液固傳遞外，還需

在軸向充分混合，以保證受光均勻；因大多為海水培養(yǎng)，對(duì)設(shè)備的腐蝕嚴(yán)重。三、微藻大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器跑道池池深10~3