生化工程學(xué)：第7-8講 色譜層析分離法

Chapter7

色譜層析分離法

Chromatography本章主要知識點(diǎn)什么是色譜分離技術(shù)？色譜分離技術(shù)的分類什么是色譜柱的理論塔板數(shù)以及如何計(jì)算？吸附色譜及其分類和基本原理什么是分配色譜？離子交換色譜的分類及應(yīng)用凝膠色譜的分離原理及分類離子交換及疏水作用層析的原理高效液相色譜的分離原理及應(yīng)用蛋白質(zhì)分離的常用色譜方法有哪些？色譜技術(shù)簡介：色譜法又稱色譜分析法、層析法，是一種制備、分離和分析方法。利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動相對固定相中的混合物進(jìn)行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會以不同的速度沿固定相移動，最終達(dá)到分離的效果。

層析現(xiàn)象層析現(xiàn)象描述將一滴含有混合色素的溶液滴在一塊布或一片紙上，隨著溶液的展開可以觀察到一個(gè)個(gè)同心圓環(huán)出現(xiàn)。色譜法的發(fā)展歷史1901年俄國植物學(xué)家Tswett，發(fā)現(xiàn)這個(gè)石油醚從碳酸鈣中分離植物色素的層析現(xiàn)象1903年提出了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法，1906年將這種方法命名為色譜法(Chromatography)，色譜法(Chromatography)是由顏色(chrom)和圖譜(graph)這兩個(gè)詞根組成

1931年德國庫恩Kuhn將茨維特的方法應(yīng)用于葉紅素和葉黃素的研究，庫恩的研究獲得了廣泛的承認(rèn)，也讓科學(xué)界接受了色譜法，色譜法的發(fā)展歷史1938年英國科學(xué)家馬?。∕artin）和辛格（Synge）準(zhǔn)備利用氨基酸在水和有機(jī)溶劑中的溶解度差異分離不同種類的氨基酸，失敗。方案更新1941年，Martin和Synge采用水分飽和的硅膠為固定相，以含有乙醇的氯仿為流動相分離乙?；被?，成功。（分配色譜產(chǎn)生）1943年馬丁以及辛格又發(fā)明了在蒸汽飽和環(huán)境下進(jìn)行的紙色譜法。1952年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)色譜法的發(fā)展歷史1951年Martin和James報(bào)道了用自動滴定儀作檢測器分析脂肪酸，創(chuàng)立了氣-液色譜法；1958年Golay首先提出了分離效能極高的毛細(xì)管柱氣相色譜法，發(fā)明了玻璃毛細(xì)管拉制機(jī)，從此氣相色譜法超過最先發(fā)明的液相色譜法而迅速發(fā)展起來，

1960年代末科克蘭、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時(shí)代。色譜經(jīng)典實(shí)驗(yàn)在一玻璃管中放入碳酸鈣，將含有植物色素（植物葉的提取液）的石油醚倒入管中。此時(shí)，玻璃管的上端立即出現(xiàn)幾種顏色的混合譜帶。然后用純石油醚沖洗，隨著石油醚的加入，譜帶不斷地向下移動，并逐漸分開成幾個(gè)不同顏色的譜帶，繼續(xù)沖洗就可分別接得各種顏色的色素，并可分別進(jìn)行鑒定。

色譜技術(shù)

概念

利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)(分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等)的不同，使各組分以不同程度分布在固定相（多孔介質(zhì)）和流動相中，當(dāng)流動相流過固定相時(shí)，根據(jù)物質(zhì)在兩相間的分配行為不同，各組分以不同的速度移動，經(jīng)過多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），而達(dá)到分離的技術(shù)。色譜分離方法的分類1、按兩相所處的狀態(tài)分類

氣相色譜法：

氣體為流動相的色譜稱為氣相色譜（GC）根據(jù)固定相是固體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機(jī)化合物液體），又可分為氣固色譜（GSC）和氣液色譜（GLC）。

相色譜法：液體為流動相的色譜稱液相色譜（LC）液相色譜亦可分為液固色譜（LSC）和液液色譜（LLC）。超臨界流體為流動相的色譜為超臨界流體色譜（SFC）。通過化學(xué)反應(yīng)將固定液鍵合到載體表面，這種化學(xué)鍵合固定相的色譜又稱化學(xué)鍵合相色譜（CBPC）.高效液相色譜（HPLC）稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇；線性梯度淋洗，2%/min流速：1ml/min柱溫：50℃柱壓：70×104Pa檢測器：紫外檢測器高效液相色譜法分離組分(HPLC)

高效液相色譜（HPLC）/液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）/核磁

（NMR）在藥物檢測中的應(yīng)用HPLCLC/MSNMR色譜分離方法的分類2、按固定相的幾何形式分類1.柱色譜法(columnchromatography)柱色譜法是將固定相裝在一金屬或玻璃柱中或是將固定相附著在毛細(xì)管內(nèi)壁上做成色譜柱，試樣從柱頭到柱尾沿一個(gè)方向移動而進(jìn)行分離的色譜法。2.紙色譜法（paperchromatography）

紙色譜法是利用濾紙作固定液的載體，把試樣點(diǎn)在濾紙上，然后用溶劑展開，各組分在濾紙的不同位置以斑點(diǎn)形式顯現(xiàn)，根據(jù)濾紙上斑點(diǎn)位置及大小進(jìn)行定性和定量分析。3.薄層色譜法(thin-layerchromatography,TLC)

薄層色譜法是將適當(dāng)粒度的吸附劑作為固定相涂布在平板上形成薄層，然后用與紙色譜法類似的方法操作以達(dá)到分離目的。

紙色譜法紙層析是一種常用的快速分離、鑒定方法，可用于定性分析以及確定分離方案，但一般不用于定量分析介質(zhì)：濾紙操作方法：將試樣溶于適當(dāng)溶劑中，點(diǎn)樣于濾紙的一端；選用適當(dāng)?shù)恼归_劑，借助毛細(xì)管現(xiàn)象從點(diǎn)樣的一端向另一端流動，展開結(jié)束后，取下濾紙，晾干，染色顯跡薄層色譜儀

薄層色譜法將固定相涂布在惰性固體上，形成薄層進(jìn)行色譜分離的方法常用的固定相有：硅膠和氧化鋁優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單、操作方便快速顯色方式多，如可以選用濃硫酸等進(jìn)行顯色靈敏度高（較紙層析）可以大量制備常用的吸附劑：氧化鋁、硅膠、活性炭纖維素、聚酰胺、硅藻土展開劑的選擇展開劑可以是單一溶劑，也可以是混合溶劑常用的氨基酸紙層析體系中使用的展開劑為：正丁醇-甲酸-水（15：3：2）展開方式：上行色譜；下行色譜；徑向色譜展開劑極性越大，對同一化合物的洗脫能力越大因此，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整展開劑的極性以獲得最佳的分離的效果展開劑選擇的原則：（1）對被分離組分應(yīng)具有一定的解吸附能力，極性應(yīng)比被分離物質(zhì)的極性略?。?）展開劑應(yīng)對被分離物質(zhì)具有一定的溶解能力色譜分離方法的分類3、按分離原理分類

1.吸附色譜法(adsorptionchromatography)

利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分離的方法，稱為吸附色譜法。

2.分配色譜法(partitionchromatography)

利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法稱為分配色譜法。3.離子交換色譜法

利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法，即離子交換色譜法。

4.尺寸排阻色譜法

利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達(dá)到分離的方法，稱為凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法。

5.親和色譜法

利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進(jìn)行分離的技術(shù)稱為親和色譜法，常用于蛋白質(zhì)的分離。色譜分離過程（1）加樣，混合物進(jìn)入填充柱。（2）展開，用移動相將通過固定相的滲濾液帶出，各組分隨流經(jīng)的距離或時(shí)間分開。（3）分部收集，把流出的液體按照一定的記數(shù)方式分次收集?；驈谋又泄蜗隆ＩV分離方法的分類1。洗脫法也稱沖洗法（1）將樣品加到色譜柱頭上，（2）用吸附或溶解能力比試樣組分弱得多的氣體或液體作沖洗劑。由于各組分在固定相上的吸附或溶解能力不同.被沖洗劑帶出的先后次序也不同，從而使各組分分層且分離完全，層與層之間隔著一層溶劑。色譜分離方法的分類頂替法（1）將樣品加到色譜柱頭，（2）在惰性流動相中加入對固定相的吸附或溶解能力比所有試樣組分強(qiáng)的物質(zhì)為頂替劑（或直接用頂替劑作流動相），（3）通過色譜柱，將各組分按吸附或溶解能力的強(qiáng)弱順序，依次頂替出固定相。

處理量較大，且各組分分層清楚，但層與層相互連接，不能將組分完全分離。

2）頂替法（displacementdevelopment）混合樣加樣頂替劑分離結(jié)果

將混合物樣品加到分離柱后，然后用親和力大的頂替劑流過分離柱，試樣中的各組分按親和力由小到大順序依次被頂替出分離柱。

3）迎頭法（frontalmethod）

樣品液分離柱

讓待分離的混合物連續(xù)地通過分離柱，開始各組分被留在柱上，待飽和后就流出分離柱。開始出現(xiàn)的是親和力最小的，各得到一部分純物質(zhì)。然后各組分依親和力逐步增加的順序出現(xiàn)，最終各組分的濃度與樣品中相同。迎頭法可用于那些分離場合？色譜系統(tǒng)的基本組成色譜分離的參數(shù)分配系數(shù)（Kd)：溶質(zhì)在固定相中的濃度q與移動相中的濃度c之比?？捎蒐angmuir方程得出Kd分配系數(shù)q、c溶質(zhì)在固相和液相中的濃度保留時(shí)間（tR）和保留體積（VR）反應(yīng)樣品在柱子中的保留或阻滯能力，是色譜過程的基本熱力學(xué)參數(shù)之一色譜分離的基本概念阻滯因子Rf在色譜系統(tǒng)中溶質(zhì)的遷移速度和標(biāo)準(zhǔn)物（與固定相沒有親和力的流動相Kd=0）的遷移速度之比。Rf=tm/ts+tm

(marker，solut)其意義在于體現(xiàn)某一種溶質(zhì)與固定相之間的親和力大小色譜固相的阻滯作用產(chǎn)生的機(jī)理：相的變化溶質(zhì)從液相傳遞到固相相的分配-在不同液相中的分配差異溶液中的分子篩效應(yīng)電場作用等色譜分離的基本概念洗脫體積(或溶出體積Ve）色譜柱中，溶質(zhì)的最大濃度區(qū)從柱中流出時(shí)已流出的流動相的體積，或者使溶質(zhì)從柱中流出所需流動相體積，為洗脫體積不同的溶質(zhì)，由于和固定相的親和力的不同，洗脫體積也有所差異。色譜分離的基本概念色譜柱的理論塔板數(shù)、塔板高度反應(yīng)不同時(shí)刻溶質(zhì)在色譜柱中的分布以及分離度與柱高之間的關(guān)系理論塔板數(shù)的計(jì)算方法：N理論塔板數(shù)tR保留時(shí)間W1/2半峰寬Wb峰底寬度理論塔板高度：L柱長1、吸附色譜Adsorptionchromatography原理:利用溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力(范德華力，包括色散力、誘導(dǎo)力、定向力以及氫鍵)的差異而實(shí)現(xiàn)分離關(guān)鍵要素：吸附劑和展開劑的選擇吸附劑：氧化鋁、硅膠、聚酰胺等，均含有不飽和的氧原子或氮原子以及能夠形成氫鍵的基團(tuán)，如-OH和-NH2吸附色譜

吸附柱層析

將吸附劑填裝在玻璃或不銹鋼管中，構(gòu)成層析柱，層析時(shí)欲分離的樣品自柱頂加入，當(dāng)樣品溶液全部流入吸附層析柱后，再加入溶劑沖洗。沖洗的過程稱為洗脫，加入的溶劑稱為洗脫劑。一般吸附色譜的操作程序（1）根據(jù)要分離組分的性質(zhì)（包括極性、分子量、分子結(jié)構(gòu)）選擇合適的固定相和流動相（2）吸附操作：選擇合適的操作條件（溫度、pH值、流速），進(jìn)行裝柱、平衡、上樣，測定穿透樣品含量以調(diào)整操作參數(shù)（3）洗脫：采用有機(jī)溶劑洗滌、調(diào)節(jié)pH值以及體系離子強(qiáng)度，最大限度地回收目標(biāo)產(chǎn)物理想的洗脫曲線

A峰和B峰均呈對稱形，二者沒有重疊，這表明樣品液中的組分已完全分開。層析峰的面積(FEG)、峰高(BE)和半峰高寬度(HI)等參數(shù)是定性、定量洗脫物的依據(jù)。2、分配色譜（分配層析）原理：利用溶質(zhì)各組分在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同而分離的方法要素：固定相、載體、流動相典型類型：紙層析分配系數(shù)(K)指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度比值：

K=固定相中溶質(zhì)的濃度/流動相中溶質(zhì)的濃度載體：通常為惰性材料，能吸附液體固定相載體種類：硅膠硅藻土纖維素葡聚糖凝膠分配色譜（分配層析）固定相：通常選取各組分溶解度大的溶劑作為固定相流動相可以是極性的（反相色譜法SiO2），也可以是非極性的（正相色譜）*反相色譜固定相是非極性的,流動相是極性的反相液相色譜反相液相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)使基于蛋白質(zhì)的疏水性，因此通常采用非極性的烷基固定相作為填料，其表面化學(xué)性質(zhì)和流動相的選擇應(yīng)最大限度地滿足疏水的要求通常在流動相中加入離子對試劑（三氟乙酸）來增大蛋白質(zhì)和多肽的疏水性載體：微粒多孔硅膠（粒徑5μm~20μm）HypersilSpherosilXOB075固定相：C18、C8烷基鏈，C8適于分離蛋白質(zhì)C18適于分離核酸，苯基。流動相的選擇通常采用有機(jī)溶劑，甲醇、乙腈、異丙醇、正丙醇和四氫呋喃30μm15μm5μmInfluenceofParticleSizeontheSeparationeffectSourceRPC3.離子交換色譜以離子交換樹脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為流動相，使溶質(zhì)按照其離子交換親合力的不同而得到分離的方法。在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。離子交換色譜基本原理

離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)(或功能基團(tuán))和反離子構(gòu)成的，基質(zhì)與電荷基團(tuán)以共價(jià)鍵連接，電荷基團(tuán)與反離子以離子鍵結(jié)合。離子交換劑與分離液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，假設(shè)以RA+代表陽離子交換劑，其中A+為反離子，A+能夠與溶液中的陽離子B+發(fā)生可逆的交換反應(yīng)，反應(yīng)式為：RA++B+RB++A+氨基酸的離子交換分離原理X＋X＋X＋X＋X＋X＋Y＋X＋Z＋X＋Y＋Z＋Z＋Y＋Y＋Y＋X＋Z＋X＋Z＋X＋Z＋Z＋X＋X＋X＋Y＋Z＋Y＋Z＋Ｘ＋Ｘ＋X＋X＋X＋X＋Ｚ＋X＋Ｚ＋X＋X＋OH－nX＋平衡上樣吸附洗雜洗脫離子交換法離子交換色譜離子交換劑對溶液中不同離子具有不同的結(jié)合力，這種結(jié)合力的大小是由離子交換劑的選擇性決定的。強(qiáng)酸性(陽性)離子交換劑對H+的結(jié)合力比對Na+的?。粡?qiáng)堿性(陰性)離子交換劑對OH-的結(jié)合力比對Cl-的小得多；弱酸性離子交換劑對H+的結(jié)合力遠(yuǎn)比對Na+的大；弱堿性離子交換劑對OH-的結(jié)合力比對Cl-的大。離子交換色譜離子交換劑應(yīng)滿足的基本條件有：

①有高度的不溶性。即在各種溶劑中不發(fā)生溶解；②有疏松的多孔結(jié)構(gòu)或巨大的表面積，使交換離子能在交換劑中進(jìn)行自由擴(kuò)散和交換；③有較多的交換基團(tuán)；④有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)。在使用過程中，不因物理或化學(xué)因子的變化而發(fā)生分解和變形等現(xiàn)象。

決定吸附容量的重要因子采用何種反離子進(jìn)行電荷平衡離子交換劑與各種水合離子(離子在水溶液中發(fā)生水化作用形成的)的結(jié)合力與離子的電荷量成正比，而與水合離子半徑的平方成反比。所以，離子價(jià)數(shù)越高，結(jié)合力越大。在離子間電荷相同時(shí)，則離子的原子序數(shù)越高，水合離子半徑越小，結(jié)合力亦越大。離子交換色譜兩性離子（如蛋白質(zhì)、和核苷酸等）與離子交換劑的結(jié)合力主要取決于它們的物理化學(xué)性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。當(dāng)pH低于等電點(diǎn)(pI)時(shí)，它們帶正電荷能與陽離子交換劑結(jié)合；pH高于pI時(shí)，它們帶負(fù)電荷能與陰離子交換劑結(jié)合。pH與pI的差值越大，帶電量越大，與交換劑的結(jié)合力越強(qiáng)。

離子交換層析本質(zhì)

主要依據(jù)是離子交換劑對各種離子或離子化合物有不同的結(jié)合力。離子交換劑的種類

根據(jù)離子交換劑中基質(zhì)的組成和性質(zhì)，可將其分成兩大類：

1.疏水性離子交換劑

疏水性離子交換劑中的基質(zhì)是人工合成的與水結(jié)合力較小的樹脂。常用樹脂由苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物，其中二乙烯苯是交聯(lián)劑，能把聚乙烯苯直鏈化合物連接成類似海綿狀的結(jié)構(gòu)，在此結(jié)構(gòu)中以共價(jià)鍵引入不同的電荷基團(tuán)。離子交換樹脂以電荷基團(tuán)的性質(zhì)分則有：陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂(分別包括強(qiáng)、中、弱三種電荷基團(tuán))螯合離子交換樹脂(對金屬離子有較強(qiáng)的選擇性)。陽離子交換劑

(1)陽離子交換劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電，反離子帶正電。因此，可以與溶液中的正電荷化合物或陽離子進(jìn)行交換反應(yīng)。根據(jù)電荷基團(tuán)的強(qiáng)弱，又可將陽離子交換劑分為強(qiáng)酸型(帶磺酸基團(tuán))、中強(qiáng)酸型(帶磷酸基團(tuán)或亞磷酸基團(tuán))和弱酸型(帶羧基的或酚基)三種。常用的離子交換樹脂葡聚糖凝膠型

DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25纖維素系列離子交換劑

DEAE-SephacelCellex系列瓊脂糖系列離子交換劑

Sepharose系列SepharoseCL-6B,SepharoseFastFlowBio-GelA系列交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑MiniQPC3.2/3:GlutathionesynthetaseSDSStartingmaterialPeak2ExpandedBed

影響交換作用的因素：樹脂顆粒的大小、樹脂內(nèi)部空隙大小，擴(kuò)散速率，樹脂容量，反應(yīng)基團(tuán)種類，樹脂壽命。例子：鏈霉素的回收。

關(guān)于色譜柱的再生陰離子交換劑

(2)陰離子交換劑是在樹脂中分別引入季胺〔-N(CH3)3〕、叔胺〔-N(CH3)2〕、仲胺〔-NHCH3〕和伯胺〔-NH2〕基團(tuán)構(gòu)成的。當(dāng)引入季胺和叔胺基團(tuán)時(shí)，分別為強(qiáng)陰性和中強(qiáng)陰性離子交換劑。當(dāng)引入仲胺和伯胺基團(tuán)時(shí)，為弱陰性離子交換劑。4.凝膠過濾色層分離法凝膠層析，又稱為凝膠過濾、分子排阻層析或分子篩層析。是以各種凝膠為固定相，利用流動相中所含各物質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。分子篩和排阻的效應(yīng)！凝膠過濾色層分離法基本原理當(dāng)含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，向下移動的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。適用水溶性高分子物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn) 操作簡便 分離效果好，重復(fù)性高，回收率高 分離條件溫和 應(yīng)用廣泛適用于生物大分子的初級分離，脫鹽 分辨率低分子篩凝膠色譜原理凝膠過濾色層分離法樣品中各組分的流出順序，可用分配系統(tǒng)Ka來量度：

Ka=(Ve-Vo)/Vi

式中Ve：為洗脫體積(elutionvolume)，表示某一組分從層析柱洗出到最高峰出現(xiàn)時(shí)，所需的洗脫液體積；

Vo：外體積(outervolume)，為層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積；

Vi：內(nèi)體積(innervolume)，為層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部微孔的體積。凝膠過濾色層分離法當(dāng)某組分的Ka=0時(shí)(即Ve=Vo)，說明該組分完全不進(jìn)入凝膠顆粒微孔，洗脫時(shí)最先流出；

若某組分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)時(shí)，說明該組分可自由地?cái)U(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的微孔中，洗脫時(shí)，最后流出；

Ka在0-1之間的組分，洗脫時(shí)Ka值小的先流出，Ka值大的后流出。凝膠過濾色層分離法Vo=Vt-Vi-Vg

式中Vg：凝膠基質(zhì)本身的體積；Vi：內(nèi)體積；Vt：層析柱內(nèi)凝膠床的總體積。

Vt可通過測量柱內(nèi)徑和凝膠床高度計(jì)算出來，即

Vt=（1/4）πR2h

洗脫體積Ve可通過加進(jìn)某一組分后實(shí)際測量而得，也可以在已知Ka后計(jì)算出來。即

Ve=Vo+KaVi凝膠過濾色層分離法一般情況下，凝膠對組分沒有吸附作用。當(dāng)洗脫液的體積等于Vo+Vi時(shí)，所有組分都應(yīng)該被洗脫出來，即Ka的最大值為1。某種情況下Ka值會大于1。說明這一層析過程不是單純的凝膠層析，其中可能還夾雜有吸附或離子交換等過程。凝膠過濾色層分離法同一類型的化合物而言，組分的洗脫體積Ve與相對分子質(zhì)量(Mr)的關(guān)系可用下式表示：

Ve=K1-K2lgMr式中K1，K2為常數(shù)。凝膠色譜填料葡聚糖凝膠SephadexG-系列聚丙烯酰胺凝膠 Sephacryl系列瓊脂糖凝膠Sepharose系列Superose系列聚苯乙烯凝膠的共同特點(diǎn)內(nèi)部具有微細(xì)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其孔徑的大小與被分離物質(zhì)的相對分子質(zhì)量大小有相應(yīng)的關(guān)系。凝膠的選擇(1)聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，由丙烯酰胺(CH3=CH-CONH2)與甲叉雙丙烯酰胺(CH3=CH-CONH-CH2-NHCO-CH=CH2)共聚而成。商品名稱為生物膠P(Bio-Ge1P)。聚丙烯酰胺凝膠優(yōu)點(diǎn)：完全惰性的，適宜于各種蛋白質(zhì)、核苷及核苷酸等的分離純化。缺點(diǎn)：遇強(qiáng)酸時(shí)酰胺鍵會水解，一般在pH2-11的范圍內(nèi)使用。凝膠的選擇(2)葡聚糖凝膠（Glucosan）由相對分子質(zhì)量為4╳104-20╳104的葡聚糖交聯(lián)聚合而成。葡聚糖凝膠優(yōu)點(diǎn)：由Pharmacia(GE)公司生產(chǎn)的商品Sephadex的，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性等，為最常用的凝膠之一。Sephadex耐堿，在0.01mol/L鹽酸中放置半年不受影響，故廣泛用于各種物質(zhì)的分離純化。凝膠的選擇Sephadex的型號:G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200等多種型號、區(qū)別:G后面的數(shù)字越大，膠粒內(nèi)的孔經(jīng)越大，越適合于大分子的分離，但顆粒的機(jī)械強(qiáng)度隨孔經(jīng)的增大而降低，較高的操作壓會使G75、G100、G150、G200等顆粒變形而使洗脫液的流速下降，使用技巧:故用上述型號的Sephadex進(jìn)行層析時(shí)，流速慢，時(shí)間長。同型號的Sephadex，顆粒越細(xì)，在同樣柱長的柱子中分辨力越好，但流速也越慢。(3)瓊脂糖凝膠從瓊脂中除去帶電荷的瓊脂膠導(dǎo)致不帶電荷，用瓊脂糖制成顆粒內(nèi)孔徑不等的多種型號層析用瓊脂糖凝膠，商品為Sepharose。Sepharose的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)孔經(jīng)大，機(jī)械強(qiáng)度好，層析時(shí)流速較快，但只能分離相對分子質(zhì)量較大的分子。凝膠的選擇

瓊脂糖凝膠商品

Pharmacia(GE)公司推出商品名為Supersose，主要有含瓊脂糖6%的Superose6和含瓊脂脂糖12%的Superose12及其衍生物。

Superose特點(diǎn)剛性特好，理化穩(wěn)定性高，在高黏度液體(如8mol/L尿素)下能保持較好的流速，適合于糖類、核酸、病毒和包含體蛋白在促溶劑中的純化。Desaltingproteinsproteinssalts5.親和色譜（特異配基層析法Affinitychromatography）親和層析簡介

利用生物分子間所具有的專一而又可逆的親和力而使生物分子分離純化的層析技術(shù)。物理或化學(xué)的過程。常用專一而又可逆的親和力的生物分子具有是成對互配的主要的有：酶和底物、酶與競爭性抑制劑、酶和輔酶、抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體、DNA與結(jié)合蛋白等。

注意在成對互配的生物分子中，可把任何一方作為固定相，而對樣品溶液中的另一方分子進(jìn)行親和層析，達(dá)到分離純化目的。親和層析的示意圖親和色譜（Affinitychromatography）載體活化、配基固相化、親和、解離親和色譜（Affinitychromatography）配基與偶聯(lián)凝膠的選擇與處理

在親和層析中，作為固定相的一方稱為配基(ligand)。配基必須偶聯(lián)于不溶性母體(matrix)(又稱載體或擔(dān)體)上，常用的載體主要有：瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、纖維素等。親和色譜（Affinitychromatography）當(dāng)用小分子作為配基時(shí)，由于空間位阻不易與載體偶聯(lián)，或不易與配對分子載體結(jié)合。為此通常在載體和配基之間接入不同長度的連接臂(spacearm)。偶聯(lián)時(shí)，必須首先使載體活化。即通過某種方法(如溴化氰法、疊氮法等)為載體引入某一活潑的基團(tuán)。親和色譜（Affinitychromatography）活化載體(包括帶連接臂的)常用的有：

(1)溴化氰活化的瓊脂糖凝膠4B(CNBr-activatedsepharose4B)：通過自發(fā)反應(yīng)可安全、簡便、快速地與含有伯胺基的配基偶聯(lián)。

(2)氨基瓊脂糖凝膠4B(AH-sepharose4B)：含有六碳(C6)長度的連接臂，可與含有羧基的配基偶聯(lián)。

(3)羧基瓊脂糖凝膠4B(CH-sepharose4B)：含有六碳(C6)長度的連接臂，可與含有氨基的配基偶聯(lián)。親和色譜（Affinitychromatography）(4)活化的羧基瓊脂糖凝膠4B(ActivatedCH-sepharose4B)：含有六碳連接臂和一個(gè)活化的酯化基團(tuán)，可自發(fā)地與含有氨基的配基偶聯(lián)

(5)環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠6B(Epoxy-activatedsepharose6B)：含有一條長的親水連接臂，可與含有羥基、氨基或巰基的配基偶聯(lián)。

(6)活化的巰基瓊脂糖凝膠4B(ActivatedThiolsepharose4B)：含有一分子谷胱甘肽作為連接臂，可與含有游離巰基的蛋白質(zhì)配基可逆偶聯(lián)。

(7)巰丙基瓊糖凝膠6B(Thiopropylsepharose6B)：含有一個(gè)較短的親水連接臂(2-巰丙基)，可與含有巰基的蛋白質(zhì)或其他小分子配基可逆偶聯(lián)，也可以與重金屬離子、烷基和芳香基反應(yīng)，并且進(jìn)一步與含有：C＝，—C=C—，—N=N—鍵的化合物反應(yīng)。親和色譜（Affinitychromatography）親和層析預(yù)處理（1）根據(jù)目的物質(zhì)的特性，選擇與之配對的分子作為配基，（2