《本科生分子生物學(xué)》課件

本科生分子生物學(xué)揭示生命奧秘的分子基礎(chǔ)探索核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能課程目標(biāo)和學(xué)習(xí)要求掌握核心概念理解分子生物學(xué)基本理論和原理實驗技能培養(yǎng)熟悉主要實驗技術(shù)和操作方法分析能力提升培養(yǎng)科學(xué)思維和問題解決能力應(yīng)用能力發(fā)展分子生物學(xué)的發(fā)展歷史1早期探索階段1869年：米歇爾發(fā)現(xiàn)DNA2基礎(chǔ)奠定階段1953年：沃森和克里克提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)3分子機制階段1961年：遺傳密碼破譯開始4技術(shù)革命階段1975年：DNA測序和重組DNA技術(shù)興起5基因組學(xué)時代2003年：人類基因組計劃完成核酸的化學(xué)組成五碳糖DNA含2-脫氧核糖RNA含核糖含氮堿基嘌呤：A和G嘧啶：C、T(DNA)和U(RNA)磷酸基團連接核苷酸形成骨架提供負電荷核苷酸堿基+糖+磷酸核酸的基本單位DNA的結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)兩條多核苷酸鏈圍繞同一軸盤旋堿基配對A-T配對（雙氫鍵）G-C配對（三氫鍵）反向平行排列兩鏈方向相反：5'→3'和3'→5'結(jié)構(gòu)參數(shù)每轉(zhuǎn)34?，含10個堿基對RNA的結(jié)構(gòu)和類型mRNA信使RNA，攜帶遺傳信息提供蛋白質(zhì)合成的模板tRNA轉(zhuǎn)運RNA，運送氨基酸具有獨特的三葉草結(jié)構(gòu)rRNA核糖體RNA，構(gòu)成核糖體參與蛋白質(zhì)合成其他RNAmiRNA、siRNA、lncRNA等參與基因表達調(diào)控核酸的理化特性紫外吸收特性最大吸收波長260nm變性后吸光度增加（增色效應(yīng)）熱變性特性高溫導(dǎo)致雙鏈分離Tm值與GC含量正相關(guān)復(fù)性特性溫度降低可重新形成雙鏈?zhǔn)呛怂犭s交技術(shù)的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能酶催化功能催化生化反應(yīng)防御功能抗體參與免疫防御運輸功能血紅蛋白運輸氧氣結(jié)構(gòu)功能膠原蛋白提供結(jié)構(gòu)支持信號傳導(dǎo)激素和受體介導(dǎo)信號傳遞氨基酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)氨基酸基本結(jié)構(gòu)：α-碳原子連接氨基、羧基和R基團按R基團分類：非極性、極性不帶電、帶正電、帶負電肽鍵的形成與蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)氨基酸游離狀態(tài)的氨基酸分子縮合反應(yīng)羧基與氨基縮合失水肽鍵形成C-N共價鍵連接氨基酸一級結(jié)構(gòu)氨基酸線性排列順序蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)α螺旋骨架原子排列成右手螺旋每圈3.6個氨基酸殘基相隔4個殘基的NH和CO形成氫鍵β折疊肽鏈呈鋸齒狀排列相鄰肽鏈間形成氫鍵分為平行和反平行兩種無規(guī)則卷曲不規(guī)則排列區(qū)域常在蛋白質(zhì)表面具有較高柔性蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)整個多肽鏈的三維折疊構(gòu)象由多種化學(xué)鍵和作用力穩(wěn)定：疏水作用氫鍵鹽橋二硫鍵四級結(jié)構(gòu)多個亞基的空間排列組合亞基間相互作用形式：非共價鍵相互作用同源或異源多聚體對稱或非對稱排列結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性影響因素包括：溫度pH值離子強度變性劑DNA復(fù)制的基本概念復(fù)制起始DNA解旋，形成復(fù)制起始點鏈延伸DNA聚合酶合成新鏈校對修復(fù)檢查并糾正錯誤配對復(fù)制終止完成DNA分子復(fù)制原核生物DNA復(fù)制1復(fù)制起點單一環(huán)狀染色體上只有一個oriC2復(fù)制方向雙向復(fù)制，形成兩個復(fù)制叉3復(fù)制速度約1000個核苷酸/秒30完成時間約30-40分鐘完成整個基因組復(fù)制真核生物DNA復(fù)制多起點復(fù)制每條染色體上有多個復(fù)制起點特定時間復(fù)制S期完成DNA復(fù)制復(fù)制單位復(fù)制子是獨立復(fù)制的DNA片段端粒復(fù)制需要特殊的端粒酶DNA復(fù)制的酶系統(tǒng)拓撲異構(gòu)酶解除DNA超螺旋解旋酶解開DNA雙鏈單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定單鏈DNA引物酶合成RNA引物DNA聚合酶合成新DNA鏈連接酶連接DNA片段DNA復(fù)制的起始識別起點起始蛋白識別特定DNA序列DNA解旋解旋酶打開雙螺旋引物合成引物酶合成短RNA引物復(fù)制起始DNA聚合酶開始鏈延伸DNA復(fù)制的延伸領(lǐng)先鏈：連續(xù)合成，5'→3'方向滯后鏈：不連續(xù)合成，形成岡崎片段DNA聚合酶僅能從3'端添加核苷酸DNA復(fù)制的終止復(fù)制叉會合兩個復(fù)制叉相遇DNA解旋停止解旋酶活性終止連接末端連接酶連接DNA末端分子分離兩個完整DNA分子分開DNA修復(fù)機制堿基切除修復(fù)識別并切除錯誤堿基修復(fù)小型DNA損傷核苷酸切除修復(fù)切除含損傷的DNA片段修復(fù)紫外線損傷錯配修復(fù)識別并修復(fù)堿基錯配提高復(fù)制準(zhǔn)確性雙鏈斷裂修復(fù)連接斷裂的DNA雙鏈修復(fù)放射線損傷轉(zhuǎn)錄的基本概念轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶結(jié)合啟動子鏈延伸按DNA模板合成RNA轉(zhuǎn)錄終止RNA聚合酶脫離模板RNA加工轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行修飾RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能原核生物RNA聚合酶核心酶(α2ββ')加σ因子RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄rRNA前體RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄mRNA和大多數(shù)snRNARNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄tRNA和5SrRNA原核生物的轉(zhuǎn)錄過程啟動子識別σ因子識別-10和-35區(qū)DNA解鏈形成轉(zhuǎn)錄泡核苷酸添加5'→3'方向延伸RNA鏈終止信號Rho依賴或非依賴終止真核生物的轉(zhuǎn)錄過程轉(zhuǎn)錄前起始組裝前起始復(fù)合物招募基本轉(zhuǎn)錄因子形成閉合復(fù)合物轉(zhuǎn)錄起始形成開放復(fù)合物合成短鏈RNA脫離啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄延伸RNA聚合酶II活性增強延伸因子參與同時進行RNA加工轉(zhuǎn)錄終止識別多聚A信號終止因子結(jié)合RNA和DNA模板分離轉(zhuǎn)錄后加工：RNA剪接識別剪接位點5'和3'剪接位點序列特異性剪接體組裝snRNP和蛋白質(zhì)形成剪接體內(nèi)含子切除兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)切除內(nèi)含子外顯子連接相鄰?fù)怙@子連接形成成熟RNA轉(zhuǎn)錄后加工：RNA修飾5'帽子結(jié)構(gòu)加入7-甲基鳥苷酸帽RNA甲基化特定位點甲基化修飾RNA編輯堿基插入、刪除或替換3'聚A尾添加多聚腺苷酸尾巴遺傳密碼及其特點三聯(lián)體：每三個核苷酸編碼一個氨基酸簡并性：多個密碼子可編碼同一氨基酸無重疊：密碼子之間無重疊通用性：大多數(shù)生物共用相同密碼翻譯的基本概念密碼解讀將核酸語言轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)語言參與分子mRNA、tRNA、核糖體和輔助因子基本過程起始、延伸、終止三個階段能量需求需要GTP水解提供能量tRNA和氨基酰-tRNA合成酶tRNA結(jié)構(gòu)三葉草二級結(jié)構(gòu)L形三級結(jié)構(gòu)功能區(qū)域反密碼子：識別mRNA密碼子接受臂：連接氨基酸合成酶特異性每種氨基酸對應(yīng)特定合成酶高度識別特異性反應(yīng)過程兩步反應(yīng)消耗ATP能量核糖體的結(jié)構(gòu)和功能原核生物核糖體70S核糖體30S小亞基：16SrRNA和21種蛋白50S大亞基：23S和5SrRNA及34種蛋白真核生物核糖體80S核糖體40S小亞基：18SrRNA和33種蛋白60S大亞基：28S、5.8S和5SrRNA及49種蛋白功能位點A位：接受位點P位：肽基位點E位：退出位點PTC：肽基轉(zhuǎn)移中心翻譯的起始起始復(fù)合物形成原核生物：30S亞基結(jié)合mRNA和起始tRNAIF1、IF2和IF3參與識別SD序列和AUG密碼子起始復(fù)合物形成真核生物：43S前起始復(fù)合物形成結(jié)合mRNA形成48S復(fù)合物掃描機制尋找AUG密碼子多種eIF因子參與完整核糖體組裝大亞基結(jié)合，形成完整核糖體起始因子釋放準(zhǔn)備進入延伸階段翻譯的延伸氨基酰-tRNA結(jié)合EF-Tu/eEF1A攜帶tRNA進入A位肽鍵形成P位多肽鏈轉(zhuǎn)移至A位氨基酸移位EF-G/eEF2促進核糖體移位循環(huán)A位空出準(zhǔn)備接受下一個tRNA翻譯的終止1終止密碼子UAA、UAG或UGA進入A位2釋放因子結(jié)合RF1/RF2(原核)或eRF1(真核)識別終止密碼子3多肽鏈釋放催化酯鍵水解，釋放新合成蛋白質(zhì)4核糖體解離核糖體亞基分離，可重新參與翻譯翻譯后修飾蛋白質(zhì)剪切去除信號肽或前導(dǎo)序列化學(xué)基團添加磷酸化、糖基化、甲基化等二硫鍵形成穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)亞基組裝多亞基蛋白質(zhì)的組裝成熟定位運輸轉(zhuǎn)運至正確細胞位置原核生物基因表達調(diào)控：操縱子模型操縱子組成啟動子：RNA聚合酶結(jié)合位點操作子：調(diào)控蛋白結(jié)合位點結(jié)構(gòu)基因：編碼蛋白質(zhì)負調(diào)控模式抑制物阻斷基因表達誘導(dǎo)物解除抑制例如：乳糖操縱子正調(diào)控模式激活蛋白激活轉(zhuǎn)錄通常響應(yīng)環(huán)境信號例如：阿拉伯糖操縱子乳糖操縱子抑制狀態(tài)無乳糖環(huán)境下抑制物結(jié)合操作子RNA聚合酶無法轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)狀態(tài)乳糖存在環(huán)境下乳糖與抑制物結(jié)合抑制物構(gòu)象改變無法結(jié)合操作子基因產(chǎn)物β-半乳糖苷酶透酶硫代半乳糖苷酰轉(zhuǎn)移酶色氨酸操縱子抑制狀態(tài)激活狀態(tài)色氨酸過多時：抑制物與色氨酸結(jié)合，抑制物活化，結(jié)合操作子，阻止轉(zhuǎn)錄色氨酸缺乏時：抑制物無活性，不能結(jié)合操作子，允許轉(zhuǎn)錄負反饋機制：產(chǎn)物過多時抑制自身合成真核生物基因表達調(diào)控：轉(zhuǎn)錄水平順式作用元件DNA上的調(diào)控序列：核心啟動子近端啟動子增強子沉默子應(yīng)答元件反式作用因子調(diào)控蛋白質(zhì)：基本轉(zhuǎn)錄因子特異性轉(zhuǎn)錄因子輔激活因子輔抑制因子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控影響DNA可及性：染色質(zhì)重塑組蛋白修飾DNA甲基化真核生物基因表達調(diào)控：轉(zhuǎn)錄后水平可變剪接一個基因產(chǎn)生多種mRNAmRNA穩(wěn)定性調(diào)控RNA降解速率mRNA定位控制RNA轉(zhuǎn)運和亞細胞定位翻譯抑制miRNA和siRNA調(diào)控機制表觀遺傳學(xué)調(diào)控定義特點不改變DNA序列的遺傳現(xiàn)象可遺傳至子代細胞受環(huán)境因素影響可逆性修飾主要機制DNA甲基化組蛋白修飾非編碼RNA調(diào)控染色質(zhì)重塑生物學(xué)意義基因表達精細調(diào)控細胞分化和發(fā)育基因組穩(wěn)定性維持環(huán)境適應(yīng)性反應(yīng)DNA甲基化甲基化建立DNMT3催化從頭甲基化甲基化維持DNMT1維持DNA復(fù)制后甲基化模式甲基化去除TET酶催化主動去甲基化基因沉默啟動子甲基化抑制基因表達組蛋白修飾乙?；褐泻唾嚢彼嵴姾?，松弛染色質(zhì)，激活轉(zhuǎn)錄甲基化：可激活或抑制轉(zhuǎn)錄，取決于位點和程度磷酸化：參與染色質(zhì)凝聚和DNA修復(fù)泛素化：調(diào)控蛋白穩(wěn)定性和活性非編碼RNA調(diào)控miRNA21-23nt，轉(zhuǎn)錄后抑制siRNA21-25nt，靶向mRNA降解piRNA26-31nt，沉默轉(zhuǎn)座子lncRNA>200nt，多種調(diào)控功能circRNA環(huán)狀RNA，miRNA海綿基因重組的基本概念1遺傳多樣性產(chǎn)生新的基因組合DNA修復(fù)修復(fù)受損DNA3基因組穩(wěn)定性維持染色體完整性進化動力加速物種適應(yīng)和進化同源重組雙鏈斷裂DNA雙鏈斷裂形成同源序列搜索RecA/Rad51介導(dǎo)搜索配對鏈侵入與置換形成D-loop結(jié)構(gòu)Holliday結(jié)構(gòu)形成形成十字結(jié)構(gòu)中間體解析與連接切割解析重組產(chǎn)物位點特異性重組1特異位點識別重組酶識別特定DNA序列2DNA斷裂切割特定識別位點DNA交換DNA片段交換位置4DNA連接DNA末端重新連接轉(zhuǎn)座子和基因重排DNA轉(zhuǎn)座子"剪切-粘貼"機制完全離開原位置例如：Tn5，Tn10RNA轉(zhuǎn)座子"復(fù)制-粘貼"機制通過RNA中間體例如：反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子生物學(xué)意義基因組多樣性基因表達調(diào)控染色體結(jié)構(gòu)改變基因工程的基本原理目的基因獲取PCR擴增或合成DNA酶切限制性內(nèi)切酶切割DNA連接連接酶催化連接轉(zhuǎn)化宿主重組DNA導(dǎo)入宿主細胞篩選鑒定鑒定目的克隆限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶限制性內(nèi)切酶特點：識別特定DNA序列在特定位點切割產(chǎn)生平端或粘性末端分類：I型：復(fù)雜、隨機切割I(lǐng)I型：簡單、特定位點切割I(lǐng)II型：需ATP，切割識別序列附近DNA連接酶功能：催化DNA片段連接形成磷酸二酯鍵修復(fù)DNA斷裂種類：T4DNA連接酶：需ATPE.coliDNA連接酶：需NAD+克隆載體系統(tǒng)3質(zhì)粒載體復(fù)制起點抗性標(biāo)記多克隆位點噬菌體載體容量較大高效包裝λ或M13噬菌體人工染色體BAC、YAC、PAC可容納大片段穩(wěn)定傳遞穿梭載體多宿主復(fù)制多種選擇標(biāo)記便于表達檢測PCR技術(shù)原理及應(yīng)用變性95℃使DNA雙鏈分離退火50-65℃引物與模板結(jié)合延伸72℃DNA聚合酶合成互補鏈循環(huán)30-40次循環(huán)指數(shù)擴增目標(biāo)序列基因表達系統(tǒng)原核表達系統(tǒng)：高效但無翻譯后修飾真核表達系統(tǒng)：翻譯后修飾完善但成本高誘導(dǎo)性表達：通過誘導(dǎo)劑控制表達水平基因組學(xué)概述結(jié)構(gòu)基因組學(xué)DNA序列測定和分析功能基因組學(xué)基因功能和表達研究比較基因組學(xué)不同物種基因組比較計算基因組學(xué)基因組數(shù)據(jù)計算分析轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究對象：全部RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄水平基因表達主要技術(shù)：RNA-Seq芯片雜交單細胞測序蛋白質(zhì)組學(xué)研究對象：全部蛋白質(zhì)產(chǎn)物蛋白質(zhì)表達與修飾主要技術(shù)：質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)互作組生物信息學(xué)基礎(chǔ)序列分析：比對、搜索和進化分析結(jié)構(gòu)預(yù)測：蛋白質(zhì)和RNA二級、三級結(jié)構(gòu)功能注釋：預(yù)測基因和蛋白質(zhì)功能系統(tǒng)生物學(xué)：整合多組學(xué)數(shù)據(jù)分析CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)組成Cas9核酸酶sgRNA引導(dǎo)分子工作原理sgRNA識別目標(biāo)序列Cas9切割DNA雙鏈細胞修復(fù)機制修復(fù)斷裂編輯方式非同源末端連接：基因敲除同源定向修復(fù)：精確編輯堿基編輯：單堿基修改分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用分子診斷核酸檢測技術(shù)診斷疾病基因治療導(dǎo)入功能基因修復(fù)缺陷精準(zhǔn)醫(yī)療基于基因組信息個體化治療疫苗開