TCSTC-甘蔗梢腐病抗性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范

Q/LB.□XXXXX-XXXX前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國熱帶作物學(xué)會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：廣西大學(xué)、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)技推廣技術(shù)中心、廣東農(nóng)科院、廣西農(nóng)科院本文件主要起草人：張木清、姚偉、許譽(yù)芝、暴怡雪、史夢(mèng)雅、陳保善、姚姿婷、鄒承武、徐世強(qiáng)、王繼華、王澤平、胡琴、黃江峰、肖勝華、余凡、張積森、蔣洪濤、林鎮(zhèn)越、黃振、張桂英甘蔗梢腐病抗性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了甘蔗梢腐病抗性鑒定的術(shù)語和定義、田間鑒定和試驗(yàn)設(shè)計(jì)、室內(nèi)苗期鑒定和試驗(yàn)設(shè)定、病情調(diào)查、抗病性評(píng)價(jià)以及鑒定記載表格。本文件適用于我國非主要農(nóng)作物品種登記中甘蔗品種梢腐病抗性鑒定和抗性評(píng)價(jià)。本文件同時(shí)適用于我國甘蔗品種區(qū)域試驗(yàn)、生產(chǎn)試驗(yàn)和自然誘發(fā)鑒定中的甘蔗梢腐病的病情調(diào)查和抗性評(píng)價(jià)；適用于甘蔗品種、品系及種質(zhì)資源對(duì)甘蔗梢腐病抗性的田間鑒定和室內(nèi)鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T1784-2009農(nóng)作物品種試驗(yàn)技術(shù)規(guī)程甘蔗NY/T3925-2021農(nóng)作物品種試驗(yàn)規(guī)范糖料作物術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本部分3.1甘蔗梢腐病（Pokkahboengdisease）甘蔗梢腐病主要是由鐮刀菌復(fù)合種（Fusariumspeciescomplex）引起的，該病主要發(fā)生在梢頭的嫩葉部位，感病梢頭部位葉片扭纏在一起，嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)梢頭生長點(diǎn)腐爛，幼嫩心葉壞死，甚至整株枯死。3.2田間評(píng)價(jià)（Fieldevaluation）通過對(duì)田間種植甘蔗并在特定時(shí)期進(jìn)行田間調(diào)查評(píng)價(jià)。3.3病原分離物（Pathogenicisolate）采用人工分離培養(yǎng)的方法，從病健交界處分離獲得病原物的純培養(yǎng)物。3.4鑒別寄主（Diagnostichost）用于鑒定病原物的甘蔗品種、品系材料。3.5致病性（Pathogenicity）病原物具有破壞寄主植物引起病變的能力。3.6培養(yǎng)基（Medium）可用于培養(yǎng)病原物的人工配制基質(zhì)。3.7接種體（Inoculum）用于接種可以引起病害的病原物。3.8接種懸浮液（Inoculumsuspension）用于接種的含有定量接種體的液體。3.9自然發(fā)病(Naturalinfection)在未經(jīng)人工接種情況下發(fā)病。3.10人工接種（Artificialinoculation）在適宜條件下，通過人工操作將接種體置于植物體的適當(dāng)部位并使之發(fā)病的過程。3.11發(fā)病率（發(fā)病程度）（Diseaseincidence）發(fā)病率（或者普遍率）是指發(fā)病的普遍程度，用發(fā)病株樹占調(diào)查總株數(shù)的百分率。3.12病情級(jí)別（Diseaseratingscale）人為定量植物個(gè)體或群體發(fā)病程度的數(shù)值化描述。3.13病害指數(shù)（Diseaseindex)通過對(duì)植株個(gè)體發(fā)病程度（病情級(jí)別）數(shù)值的計(jì)算所獲得的群體發(fā)病程度的數(shù)值化描述形式。3.14抗病性（Diseaseresistance）植物體所具有的能夠減輕或克服病原物致病作用的可遺傳形狀。3.15抗病性鑒定（Diseaseresistanceidentification）通過適宜技術(shù)方法鑒定植物對(duì)特定病害的抵抗水平。3.16抗性評(píng)價(jià)（Evaluationfordiseaseresistance）根據(jù)采用的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)判別植物對(duì)特定病害反應(yīng)的程度和抵抗水平的描述。4病原物4.1病原物來源從我國甘蔗梢腐病的發(fā)病菌源地采集，或者我國甘蔗主產(chǎn)區(qū)不同生態(tài)區(qū)采集病株，經(jīng)分離、純化、分子鑒定后，藤倉鐮孢菌種復(fù)合體（FusariumfujikuroiComplex，F(xiàn)FC）的四個(gè)種：甘蔗鐮孢菌（F.sacchari，F(xiàn)s）、層出鐮孢菌（F.proliferatum,Fp）、輪枝鐮孢菌（F.verticillioides,Fv）和新知鐮孢菌（F.andiyazi,Fa）組成梢腐病菌的菌種庫。其中甘蔗鐮孢菌是我國梢腐病的優(yōu)勢(shì)種，新知鐮孢菌主要集中在云南，層出鐮孢菌主要集中在冷涼地區(qū)和季節(jié)（冬季）。4.2接種體組成從我國甘蔗梢腐病的發(fā)病菌源地采集并經(jīng)分離、純化和鑒定后的甘蔗鐮孢菌（F.sacchari，F(xiàn)s）、層出鐮孢菌（F.proliferatum,Fp）、輪枝鐮孢菌（F.verticillioides,Fv）和新知鐮孢菌（F.andiyazi,Fa）的優(yōu)勢(shì)種單獨(dú)接種或者混合接種。也可以根據(jù)委托單位要求從菌種庫中制備。沒有特定要求的情況下，接種體為菌種庫中最新的病原分離物。4.3.病原物分離和確定從發(fā)病植株葉片的典型病斑上進(jìn)行分離純化，形態(tài)學(xué)、分子和致病性鑒定確認(rèn)為藤倉鐮孢菌種復(fù)合體（FusariumfujikuroiComplex，F(xiàn)FC）的一種：甘蔗鐮孢菌（F.sacchari，F(xiàn)s）、層出鐮孢菌（F.proliferatum,Fp）、輪枝鐮孢菌（F.verticillioides,Fv）和新知鐮孢菌（F.andiyazi,Fa）。4.4甘蔗梢腐病病原菌的繁殖和保存4.4.1甘蔗梢腐病病原菌的繁殖將保存的菌株接種于直徑為90mm、含有20mL經(jīng)高壓滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，28℃下黑暗培養(yǎng)2-3d，在無菌條件下挑取新活化的菌株邊緣菌絲接種到滅菌的馬鈴薯葡萄糖液體（PDW）培養(yǎng)基中，28℃，220r/min搖床震蕩暗培養(yǎng)5-7d，將菌液用四層紗布過濾去除大部分菌絲，過濾后的菌液在4000rpm下離心10min，去除廢液，收集菌體，用少量無菌水將孢子重懸。用無菌水將孢子濃度稀釋至約1×106cfu/mL，用于接種。4.4.2甘蔗梢腐病病原菌的采集和保存梢腐病病原菌采集可在采菌操作臺(tái)中用玻璃罩法進(jìn)行，也可用孢子收集吸器采集。采集的梢腐病病原菌先用冷凍干燥器處理后裝安培管中密封，置于液氮罐或超低溫冰箱中進(jìn)行長期保存?；蛘呤占糠志w于2ml凍存管中，加入1ml的50%甘油于-80℃下保存。5鑒定5.1室內(nèi)苗期抗性鑒定5.1.1苗期抗性鑒定在溫室中進(jìn)行，溫室溫度控制在25-30℃之間，自然光照。將待測(cè)品種（系）和感病對(duì)照播種于60cm×40cm×15cm的塑料方盒內(nèi)，每品種（系）30個(gè)單芽種植一盆，播后給塑料盒套上用鐵絲架撐開的透明塑料袋以防污染，置于溫室培養(yǎng)，幼苗長至4-5葉期進(jìn)行針刺法接種。使用無菌接種注射器吸取加入適量吐溫20的100μl孢子懸浮液（1×106cfu/mL）在幼苗基部葉鞘0.5-1cm處進(jìn)行注射接種，3-5個(gè)重復(fù)，接種實(shí)驗(yàn)在傍晚進(jìn)行。接種后置于溫室培養(yǎng)7-10d，隨后開始第一次發(fā)病情況跟蹤調(diào)查，此后每24h調(diào)查一次，記錄新葉的發(fā)病情況。5.1.2離體葉段法抗性鑒定取田間生長健康的待測(cè)品種（系）、對(duì)照的感病和抗病品種葉片，超凈臺(tái)上剪取6.8cm整齊對(duì)稱無裂痕葉段，每品種（系）剪3個(gè)葉片，75%酒精消毒。用消毒后的剪刀蘸取事先繁殖的選定菌株的孢子懸浮液在葉脈一側(cè)剪開1cm切口，對(duì)應(yīng)的葉片另一側(cè)用無菌水剪開作為對(duì)照，置于含有三層消毒濕潤濾紙的直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，25-30℃（±1℃）光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（16h光照，8h黑暗），3-5個(gè)重復(fù)，接種24h后開始連續(xù)跟蹤調(diào)查，記載切口處的受害情況。5.2田間鑒定5.2.1田間鑒定圃田間鑒定圃設(shè)置在甘蔗梢腐病人工營造抗性鑒定圃或病害常發(fā)區(qū)域。田間鑒定病圃的栽培條件（品種、土壤類型及施肥）須均勻一致，且符合科學(xué)的農(nóng)業(yè)實(shí)踐（GAP），設(shè)立保護(hù)區(qū)?；诖瞬『Πl(fā)病特點(diǎn)，在田間管理上要保持高濕度、多灌水、高氮肥（最好施用氨態(tài)氮化肥，如硫酸銨、碳酸氫銨），營造易發(fā)病的環(huán)境。5.2.2鑒定設(shè)計(jì)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，4-5行/區(qū)，行長7-10m，行距1.0-1.2m，小區(qū)面積33.5-50.0m2。甘蔗以春植蔗（2-3月）種植為佳。5.2.3鑒定對(duì)照材料利用已知抗性的標(biāo)準(zhǔn)參考品種，將待測(cè)無性系抗性與其相比較，詳見表1。表1甘蔗梢腐病抗性參考品種抗性等級(jí)參考品種高抗（HR）桂柳05-136,新臺(tái)糖4,海蔗28抗（R）新臺(tái)糖22,新臺(tái)糖23,中糖12-02中抗（MR）CP89-2143,CP94-1100,新臺(tái)糖26感（S）NCo310,CP81-1254,新臺(tái)糖25高感（HS）中蔗9,Co1001,CP94-13405.2.4調(diào)查時(shí)間病害調(diào)查時(shí)間為6-9月份。5.2.5調(diào)查方法每小區(qū)調(diào)查中間2行，用目測(cè)法評(píng)估葉片和蔗莖的發(fā)病程度，記錄調(diào)查的總株數(shù)、病株數(shù)及病級(jí)。6病害調(diào)查6.1調(diào)查時(shí)期和方法在甘蔗伸長初期（6月）、中期（7月）和盛期（8月）各調(diào)查一次；調(diào)查時(shí)目測(cè)每份鑒定品種群體的發(fā)病狀況，調(diào)查發(fā)病率，根據(jù)6.5病情級(jí)別劃分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)調(diào)查材料逐株進(jìn)行調(diào)查并記載病情級(jí)別（發(fā)病率及嚴(yán)重度）。6.2最高病情級(jí)別個(gè)體確認(rèn)每個(gè)品種（系）取三次調(diào)查結(jié)果的最大值。根據(jù)病害癥狀描述，逐份材料進(jìn)行調(diào)查并記載病情級(jí)別。如每個(gè)重復(fù)最高病情級(jí)別植株只有少數(shù)幾株，則需要對(duì)該株甘蔗主要特征特性與本品種典型特征特性進(jìn)行比較，在確認(rèn)符合本品種典型性后，該株甘蔗所表現(xiàn)的病情級(jí)別就作為劃分該品種（材料）抗性類別的主要依據(jù)。如該株甘蔗不符合本品種典型性，則不記載病情。按上述規(guī)定逐株向下確認(rèn)，直至某病情級(jí)別被確認(rèn)為止。6.3鑒定調(diào)查記載表需要鑒定人員和復(fù)核人員簽字在開展鑒定調(diào)查時(shí)，鑒定人員與復(fù)核人員一同進(jìn)行，鑒定人員對(duì)鑒定植株病情級(jí)別進(jìn)行判斷，經(jīng)復(fù)核人員簽字確認(rèn)后進(jìn)行記錄。6.4抗性分離記載若鑒定群體中出現(xiàn)明顯的抗、感類型，應(yīng)在調(diào)查表中注明“抗性分離”，用/表示。6.5病情級(jí)別劃分標(biāo)準(zhǔn)甘蔗梢腐病田間調(diào)查和離體鑒定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)詳見表2和表3。表2甘蔗梢腐病田間調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)病等級(jí)發(fā)病癥狀0無癥狀11~2張葉片有癥狀，即葉片基部或其他部分褪綠；輕微皺縮呈波紋狀；有少許紅褐色斑點(diǎn)或條紋。23~4張葉片有以下癥狀，即心葉皺縮呈階梯狀，顯著黃化、扭曲、糾纏且有紅褐色條紋；葉片纏繞扭曲或缺刻，出現(xiàn)褐色病斑。34張葉片以上有以上癥狀，或多片葉明顯褶皺、扭曲、纏繞，有明顯的紅褐色條病斑，葉子變短并呈匕首狀，生長受阻，但蔗株尚未出現(xiàn)頂腐4心葉和生長點(diǎn)腐爛死亡，梢部幼嫩組織形成頂腐狀，整個(gè)頂端死亡或長出側(cè)芽表3甘蔗梢腐病離體鑒定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)病等級(jí)發(fā)病癥狀0基本無癥狀1葉片剪接處出現(xiàn)輕微褪綠癥狀2葉片出現(xiàn)褪綠黃化病斑，蔓延約為1cm左右3葉片褪綠黃化面積迅速加大，并出現(xiàn)明顯的紅褐色條病斑4整個(gè)葉片幾乎均為紅褐色條病斑，出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象6.6病情記載及病情指數(shù)調(diào)查記錄每一鑒定的植株的病情級(jí)別，并計(jì)算病害嚴(yán)重等級(jí)。病情指數(shù)按公式計(jì)算：DI=S為劃分的等級(jí)數(shù)；N為調(diào)查的甘蔗株數(shù)；n為各級(jí)病株數(shù)；s為該病級(jí)值；7抗病性評(píng)價(jià)7.1抗性類別劃分標(biāo)準(zhǔn)7.1.1田間抗病類別依據(jù)鑒定材料多年多次的最高發(fā)病率和病情指數(shù)確定抗性水平，劃分標(biāo)準(zhǔn)見表4。表4甘蔗梢腐病田間抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)病等級(jí)發(fā)病率（%）發(fā)病指數(shù)抗性類別00-10.00-5.0高抗（HR）110-20.05-10.0抗（R）220-35.010-15.0中抗（MR）335-45.015-25.0感（S）4﹥45.0﹥25.0高感（HS）7.1.2室內(nèi)抗性類別依據(jù)苗期針刺法接種，新葉的發(fā)病程度確定抗性水平，劃分標(biāo)準(zhǔn)見表5。表5苗期針刺法抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)抗性類別發(fā)病程度抗性類別0基本無癥狀高抗（HR）1針刺部位輕微皺縮呈波紋狀，有少許紅褐色斑點(diǎn)抗（R）2傷口處出現(xiàn)顯著褪綠黃化和扭曲，葉片出現(xiàn)褐色病斑中抗（MR）3葉片受害面積加大，出現(xiàn)明顯褶皺、扭曲、纏繞，有明顯的紅褐色條病斑感（S）4心葉和生長點(diǎn)腐爛，直至蔗株死亡高感（HS）依據(jù)葉片離體鑒定，切口處葉片的病害擴(kuò)展程度確定抗性水平，劃分標(biāo)準(zhǔn)見表6。表6離體鑒定法抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)抗性類別發(fā)病程度抗性類別0基本無癥狀高抗（HR）1剪接處出現(xiàn)輕微退綠抗（R）2葉片出現(xiàn)退綠黃化病斑，并小范圍蔓延中抗（MR）3葉片受害面積迅速加大，出現(xiàn)明顯的紅褐色條病斑感（S）4整個(gè)葉片幾乎均為紅褐色條病斑，且出現(xiàn)腐爛高感（HS）7.2有效性判別對(duì)照感病品種或任一鑒定品種的抗性級(jí)別達(dá)到高感級(jí)別（4），該批次鑒定有效。7.3重復(fù)鑒定參考鑒定品種的抗性級(jí)別，同一鑒定品種的抗性級(jí)別一年為感（3），另一年在抗或者高抗，如果兩年抗性級(jí)別相差2個(gè)級(jí)別以上（包括2個(gè)級(jí)別），需要做第三次抗性鑒定；或一年在高感（4），另一年在抗或高抗，需要做第三次抗性鑒定。7.4抗性評(píng)價(jià)7.4.1在3年（次）鑒定結(jié)果中，如有2年的抗性類別是一致的，則此抗性類別作為最終鑒定結(jié)論。7.4.2達(dá)到高抗-抗或感-高感類別的鑒定品種，當(dāng)兩年抗性類別不一致時(shí)，以記載的被確認(rèn)的最高病情級(jí)別所對(duì)應(yīng)的抗性類別為準(zhǔn)。7.4.3參考感病鑒定品種，人工接種同一鑒定品種，若兩年抗性級(jí)別相差1個(gè)等級(jí)，取抗性級(jí)數(shù)值別較大的鑒定結(jié)果，對(duì)照7.1標(biāo)準(zhǔn)重新劃分抗性類別；若兩年抗性級(jí)別相差2個(gè)級(jí)別以上（包括2個(gè)級(jí)別）的，則需要做第三次抗性鑒定，取位于中間的抗性級(jí)別，重新劃分抗性類別。8鑒定報(bào)告8.1人工接種鑒定一般以鑒定品種對(duì)特定生態(tài)區(qū)內(nèi)優(yōu)勢(shì)種或不同產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢(shì)種的混合接種體的反應(yīng)出具鑒定報(bào)告。鑒定報(bào)告一般單個(gè)品種單獨(dú)出具，如集中批量送樣的，也可以多個(gè)品種出具一份報(bào)告。8.2鑒定報(bào)告要蓋鑒定單位公章，要有制表人、復(fù)核人和簽發(fā)人簽字。

附錄A（資料性）A.1甘蔗梢腐病病原菌1.1學(xué)名和形態(tài)描述甘蔗梢腐病病原菌為藤倉鐮孢菌種復(fù)合體（FusariumfujikuroiComplex，F(xiàn)FC）的四個(gè)不同種：甘蔗鐮孢菌（F.sacchari，F(xiàn)s）、層出鐮孢菌（F.proliferatum，F(xiàn)p）、輪枝鐮孢菌（F.verticillioides，F(xiàn)v）和新知鐮孢菌（F.andiyazi，F(xiàn)a）。其形態(tài)特征大體相似，表現(xiàn)為菌絲絮凝豐富，具有不規(guī)則邊緣，隨時(shí)間推移菌絲顏色從白色到淡紫色不等，大分生孢子通常有3~5個(gè)分隔，較細(xì)，呈鐮刀狀，壁??；小分生孢子呈棒狀或卵球形，基部扁平，通常為0~1個(gè)隔膜；獨(dú)有特征表現(xiàn)為：甘蔗鐮刀菌（Fs）分生孢子由多個(gè)假頭組成，唯有新知鐮刀菌（Fa）含有假厚垣孢子（類似于厚垣孢子，但有一個(gè)光滑的、更薄的壁），層出鐮刀菌（Fp）分生孢子鏈通常短于輪枝鐮刀菌，輪枝鐮刀菌（Fv）產(chǎn)生的分生孢子座以“v”形成對(duì)出現(xiàn)，呈“兔耳”狀（圖1）。單位為μm圖1甘蔗鐮孢菌（Fs）、新知鐮孢菌（Fa）、層出鐮孢菌（Fp）和輪枝鐮孢菌（Fv）的菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)特征1.2病原菌鑒定方法1.2.1分離病原菌取病健交界處（病斑與健康部分的交界處）的甘蔗葉片，剪成邊長為0.3-1.5cm大小的長方形葉片，在超凈工作臺(tái)中，將葉片置于0.1%的升汞水溶液中洗滌表面雜質(zhì)，30s后取出放入70%的酒精水溶液中攪拌洗滌30s，無菌水洗2-3次去除表面殘留的升汞和酒精，反復(fù)三次。用鑷子將3-5片葉片接種于含100μg/mL氨芐青霉素的PDA培養(yǎng)基上，28℃倒置暗培養(yǎng)3-4d。1.2.2培養(yǎng)純化待菌落長出后，挑取不同形態(tài)特征的菌落進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)，28℃倒置培養(yǎng)2-3天后，純化3-4代。1.2.3單胞分離無菌操作條件下，接種環(huán)挑取純化后的單菌落邊緣菌絲置于1mL無菌水，按10倍濃度梯度稀釋2-3次，隨后用移液槍吸取10-20μL菌液均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，28℃倒置暗培養(yǎng)2-3d，挑取單菌落邊緣菌絲接至PDW培養(yǎng)基中，28℃200r/min搖床培養(yǎng)3-4d。1.2.4菌株保存及病原菌基因組DNA提取無菌操作條件下，吸取帶菌絲的菌液300~500μL于2ml凍存管中，加入等體積50%的甘油混勻，封口膜密封并編號(hào)，置于-80℃冷凍保存?；蚪MDNA使用真菌基因組試劑盒提取。1.2.5PCR鑒定以基因組DNA為模板，利用真菌特異引物ITS1/ITS4和EF1/EF2進(jìn)行PCR鑒定（ITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS45’-TCCTCCGCTTA