三維細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)介閆輝課件

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三維細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立4.1三維基質(zhì)膠〔2〕的種類以及常用基質(zhì)膠的介紹4.2三維模型的種類4.3常見(jiàn)三維細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立方法目前已經(jīng)知道的基質(zhì)膠主要有海藻酸鈣凝膠、瓊脂糖凝膠，這兩種凝膠主要適用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，還有一種是血纖維蛋白，將動(dòng)物細(xì)胞和血纖維蛋白原混合，然后參加凝血酶。凝血酶將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性的血纖維蛋白，將動(dòng)物細(xì)胞固定在其中。血纖維蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁，因此無(wú)論是懸浮細(xì)胞還是貼壁細(xì)胞都適合。實(shí)驗(yàn)室大量使用的基質(zhì)膠是Matrigel膠，是從小鼠腫瘤組織中提取的抽提物，在室溫下，Matrigel可自動(dòng)聚集產(chǎn)生類似于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基底膜的生物活性基質(zhì)材料。Matrigel基底膜基質(zhì)形成的三維培養(yǎng)基質(zhì)，可促進(jìn)上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、Sertoli細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞及毛囊細(xì)胞等的貼壁與分化。同時(shí)，Matrigel還能影響乳腺上皮細(xì)胞的蛋白表達(dá)，支持外周神經(jīng)的新生和牛輸卵管上皮細(xì)胞的分化。高濃度的Matrigel適用于研究體內(nèi)血管生成和腫瘤細(xì)胞遷移及腫瘤模型的建立等。4.2三維細(xì)胞培養(yǎng)模型的種類三維立體培養(yǎng)的方法有多種，常用的有膠內(nèi)培養(yǎng)模式(細(xì)胞與膠原膠混合)、膠上培養(yǎng)模式(細(xì)胞生長(zhǎng)于膠原膠外表)和三明治培養(yǎng)模式(細(xì)胞生長(zhǎng)于兩層膠原中間)。4.2常見(jiàn)三維細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立方法

膠內(nèi)培養(yǎng)模式的建立方法Matrigel母液濃度10.6mg/mL〔3〕,放置于4℃溶解(4)。消化細(xì)胞,重懸至完全培養(yǎng)基中計(jì)數(shù),細(xì)胞懸液濃度為1×106/mL。使用時(shí)置于冰上,用預(yù)冷的細(xì)胞重懸液與Matrigel等體積混勻,24孔板中每孔參加100μl。37℃放置30min使其成膠,添加完全培養(yǎng)液。置于37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育,第二日換液,此后每隔一日換液一次[1]。膠上培養(yǎng)模式的建立方法在24孔培養(yǎng)板中每孔參加75μl冰上過(guò)夜解凍的Matrigel，置于37℃孵箱中孵育15min以上使Matrigel聚集。同時(shí)胰酶消化常規(guī)培養(yǎng)的正常鼻咽細(xì)胞及其高轉(zhuǎn)移潛能亞株5-8F,計(jì)數(shù)后離心收集細(xì)胞.然后把細(xì)胞懸浮于含2%Matrigel的Keratinocyte-SFM培養(yǎng)液中，細(xì)胞濃度為2*104/ml用加樣槍吹打成單個(gè)細(xì)胞后,每孔參加400μl細(xì)胞懸液于已經(jīng)凝固的Matrigel上，置于含5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)，每3-4天換新鮮培養(yǎng)液[2]。三明治培養(yǎng)模型的建立方法三明治模式前期工作和凝膠上模式相同,不同之處在于凝膠上的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)融合至(70、80)%左右時(shí),吸去培養(yǎng)液,用無(wú)菌PBS沖洗兩次后添加第二層膠(200μl/孔),在37℃下培養(yǎng)30min使其凝固后,再在膠原凝固面上添加培養(yǎng)液[3]。三種模型的簡(jiǎn)單解釋4.3不同模型的比較對(duì)于膠上培養(yǎng)模式，細(xì)胞可以黏附于細(xì)胞外基質(zhì)外表并向再造基質(zhì)膠中生長(zhǎng)，但是只有貼近Matrigel膠的細(xì)胞才能得到固體細(xì)胞外基質(zhì)的支撐，其他不能貼近再造基質(zhì)膠的細(xì)胞仍然處于2D培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)過(guò)程中不能形成完全的立體克?。粚?duì)于膠內(nèi)培養(yǎng)模式，細(xì)胞直接重懸于完全融化的Matrigel膠條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)于完全固態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)中，可以很好地模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境，在培養(yǎng)過(guò)程中形成了巨大的、無(wú)極性的球狀細(xì)胞克隆。所以大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)建立三維模型采用膠內(nèi)培養(yǎng)模式，但相對(duì)來(lái)說(shuō)膠上培養(yǎng)模式簡(jiǎn)單一些，對(duì)于操作的要求低一些。三種模型共同的缺點(diǎn)是無(wú)法對(duì)細(xì)胞直接利用顯微鏡進(jìn)行連續(xù)的觀察，需要對(duì)某一特定時(shí)間的膠原塊進(jìn)行固定制作電鏡標(biāo)本。BCA2D細(xì)胞培養(yǎng)模型B細(xì)胞生長(zhǎng)于Matrigel膠外表C細(xì)胞重懸于Matrigel膠中[4]5.1腫瘤生物學(xué)三維細(xì)胞培養(yǎng)已被廣泛運(yùn)用到腫瘤學(xué)研究,在腫瘤的實(shí)驗(yàn)性治療、腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移和中心壞死的機(jī)制、腫瘤的血管形成和營(yíng)養(yǎng)供給、體內(nèi)基因表達(dá)的模擬等方面發(fā)揮了不可替代的作用[5]。同時(shí)可以研究不同細(xì)胞間的相互作用，觀察兩種不同的細(xì)胞類型是否融合或是不相關(guān)地各自生長(zhǎng)5.2軟骨和骨組織成熟的軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞被廣泛用于三維細(xì)胞培養(yǎng),以再生損傷的軟骨、骨、韌帶、肌腱和膝關(guān)節(jié)半月板。在培養(yǎng)系統(tǒng)中常參加一些生長(zhǎng)因子,以刺激分化,產(chǎn)生組織.5.3循環(huán)系統(tǒng)和心臟各組織都配備有大小各異的血管。如何在成熟的組織中及時(shí)產(chǎn)生血管網(wǎng)絡(luò)是組織工程的重要課題;在治療領(lǐng)域,所關(guān)心的也是如何有目的地改變血管形成,利用三維培養(yǎng)可以清楚地觀察到細(xì)胞通過(guò)空間增殖、遷移和錨定,最終形成管狀結(jié)構(gòu)。注釋〔2〕基質(zhì)膠可認(rèn)為是一種可溶性的基底膜基質(zhì)。主要成分包括：層黏連蛋白、膠原IV等，同時(shí)含TGF-β成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、組織纖維酶原活化因子以及其它在EHS腫瘤中自然表達(dá)的生長(zhǎng)因子等?！?〕三維膠的最終濃度，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)一步確實(shí)定，濃度的上下不僅影響到凝膠的時(shí)間，同時(shí)影響到細(xì)胞在膠內(nèi)存在的狀態(tài)?！?〕Matrigel在22-35℃溫度環(huán)境下快速成膠，因此溶解時(shí)在4℃冰上過(guò)夜凍融〔4度時(shí)會(huì)隨著溫度的上升局部成膠〕。所有用品在使用前需置于冰浴，必須使用預(yù)冷的移液管、吸頭及小管操作Matrigel。成膠后的Matrigel可以在4℃24－48小時(shí)后重新呈液態(tài)。(5)Matrigel基底膜基質(zhì)在室溫條件下，聚合形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能,基底膜是細(xì)胞外基質(zhì)特化而形成的一種柔軟、堅(jiān)韌的網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。參考文獻(xiàn)[1]馮志華,米坤.Matrigel膠的肺腺癌細(xì)胞株A549體外三維培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[J].西部醫(yī)學(xué),2021,21(9):[2]廖雯婷,汪慧民,李滿枝等.鼻咽癌變不同時(shí)期的體外三維培養(yǎng)模型建立的實(shí)驗(yàn)研究[J].ChineseJournalofCancer,2005,24(11):1317-1321.[3]王銘潔,蔡文杰,姚泰,朱依純.血管內(nèi)皮細(xì)胞和心臟組織塊