高三 人教版 生物學(xué)選擇性必修3 第3章《基因工程的基本操作程序》一輪復(fù)習(xí)課件

基因工程的基本操作程序(一輪復(fù)習(xí))高三—人教版—生物學(xué)選擇性必修3—第3章

現(xiàn)有某個(gè)品系的玉米不抗病。香蕉NPR

1基因是植物抗病信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵基因，該基因在植物中的過量表達(dá)促使植物內(nèi)源水楊酸含量升高，從而能誘導(dǎo)植物過敏性反應(yīng)和系統(tǒng)獲得抗病性的發(fā)生，達(dá)到廣譜抗病的目的。

科學(xué)家擬將NPR

1基因作為目的基因培育抗病的玉米新品種?！緩纳鐣?huì)中來】如何培育轉(zhuǎn)基因抗病玉米？3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞抗病香蕉與載體拼接普通玉米（無抗病特性）

體細(xì)胞或受精卵（含NPR

1抗病基因）轉(zhuǎn)基因抗病玉米（有抗病特性）提取表達(dá)NPR1抗病基因?qū)隢PR1抗病基因重組DNA分子1.目的基因的

篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建4.目的基因的

檢測與鑒定如何培育轉(zhuǎn)基因抗病玉米？(一)目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞

或獲得預(yù)期

等的基因。(二)篩選合適的目的基因1.從相關(guān)的已知

的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。2.利用

（如GenBank）和序列比對工具（如BLAST）進(jìn)行篩選。(三)獲取目的基因性狀表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能清晰序列數(shù)據(jù)庫1.人工合成目的基因。2.通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因。3.利用______________目的基因（常用）。PCR獲取和擴(kuò)增主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定如：香蕉的NPR

1抗病基因。(三)獲取目的基因3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因。目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定DNA粗提取NPR1抗病基因PCR快速獲得大量抗蟲基因①PCR的中文全稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)②原理：DNA半保留復(fù)制③操作環(huán)境：體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）④目的：⑤優(yōu)點(diǎn)：對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制?？梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因。PCR擴(kuò)增儀⑥PCR反應(yīng)所需的基本條件項(xiàng)目體內(nèi)DNA復(fù)制體外PCR擴(kuò)增在PCR中的作用場所細(xì)胞內(nèi)(主要在細(xì)胞核內(nèi))PCR擴(kuò)增儀內(nèi)一定的緩沖溶液(Mg2＋)DNA聚合酶需要Mg2＋激活模板DNA母鏈含目的基因的DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板解旋解旋酶高溫打開DNA雙鏈原料4種脫氧核苷酸dNTP(4種脫氧核苷酸三磷酸)合成DNA子鏈的原料，并提供能量子鏈延伸DNA聚合酶催化耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)催化合成DNA子鏈引物能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸2種引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸⑦PCR擴(kuò)增的過程：90單鏈50引物72耐高溫的DNA聚合酶⑧PCR擴(kuò)增的結(jié)果：呈

擴(kuò)增(約為

，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。指數(shù)形式⑨PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用

來鑒定。瓊脂糖凝膠電泳2n目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定延伸后得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，如此重復(fù)循環(huán)多次。NPR1抗病基因3’5’5’3’5’3’引物13’5’引物2

設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請分別說明理由。【對點(diǎn)練習(xí)】第1組：

；第2組：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對而失效引物Ⅰ′自身內(nèi)部部分堿基發(fā)生互補(bǔ)配對而失效兩種引物的要求：①引物自身不能環(huán)化或折疊；②兩種引物之間不能互補(bǔ)配對；③引物長度不宜過短，防止引物隨機(jī)結(jié)合。1.目的：2.基因表達(dá)載體的組成：基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取核心步驟①使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代；②使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。位于基因的上游，RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。位于基因的下游，終止轉(zhuǎn)錄。一般是抗生素抗性基因或熒光蛋白基因，用來鑒別或篩選含重組DNA分子的細(xì)胞。能控制表達(dá)所需要的特殊性狀。注意：目的基因必須插入到啟動(dòng)子與終止子之間。DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)。啟動(dòng)子：終止子：標(biāo)記基因：目的基因：復(fù)制原點(diǎn)：3.構(gòu)建過程：基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取核心步驟用同種或產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有NPR

1基因的DNA片段。限制酶限制酶用一定的限制酶切割載體，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出黏性末端。DNA連接酶利用DNA連接酶將NPR

1基因片段拼接到載體的切口處，形成一個(gè)重組DNA分子?；虮磉_(dá)載體【深度思考】1.使用一種限制酶進(jìn)行切割，是否只會(huì)得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？①目的基因能否自連？②質(zhì)粒能否自連？③目的基因與質(zhì)粒能否反向連接？DNA連接酶能能能【深度思考】1.使用一種限制酶進(jìn)行切割，是否只會(huì)得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接

反向連接11’22’122’1’22’1’1①質(zhì)粒、目的基因自身環(huán)化；②質(zhì)粒與目的基因反向連接。單酶切缺點(diǎn)：【深度思考】2.如何防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接？選擇兩種不同的限制酶同時(shí)對目的基因和載體切割，防止目的基因和載體的自身環(huán)化和反向連接?；顒?dòng)：用EcoRⅠ限制酶（識別GAATTC，切割GA之間）和BgIⅡ限制酶（識別AGATCT，切割A(yù)G之間），切割載體和目的基因，并將其連接。雙酶切-G-CTTAA-A-TCTAG如圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，可用PstⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNAB.在酶切過程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因C.若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段，無法避免自身環(huán)化和反向連接D.導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長D【對點(diǎn)練習(xí)】1.轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)

的過程。2.過程：兩次拼接和兩次導(dǎo)入拼接1拼接2導(dǎo)入1導(dǎo)入2Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞將目的基因

插入染色體DNA中轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的轉(zhuǎn)基因植株植物組織培養(yǎng)基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法細(xì)胞種類植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法

、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程花粉管通道法受精卵或體細(xì)胞目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA中→表達(dá)顯微注射法受精卵目的基因表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2＋處理法原核細(xì)胞（常用大腸桿菌）Ca2+處理細(xì)胞→能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)細(xì)胞→重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取分子水平的檢測個(gè)體水平的鑒定（選擇性必修3p83</m>---到社會(huì)中去）轉(zhuǎn)基因抗蟲棉培育過程中,檢測目的基因是否成功表達(dá)的常見方法有哪兩種？__________________________________?？乖贵w雜交法、用棉葉飼喂棉鈴蟲基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取探究·實(shí)踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（一）體外DNA片段的擴(kuò)增——PCR1.PCR原理：

2.PCR反應(yīng)體系：DNA半保留復(fù)制、DNA的熱變性。模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制PCR反應(yīng)體系：1.DNA模板；2.原料：4種脫氧核苷酸；3.引物：2種；4.TaqDNA聚合酶；5.合適的反應(yīng)條件：pH、Mg2+等。模板DNA5～10μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實(shí)際為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μL1—5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μLH2O（無菌水）28～33μL總體積50μL注：模板DNA的用量為1pg-1μg。PCR反應(yīng)體系的配方探究·實(shí)踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（一）體外DNA片段的擴(kuò)增——PCR3.PCR方法步驟：移液用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分

離心待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）反應(yīng)參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min可根據(jù)目的片段長度適當(dāng)調(diào)整延伸時(shí)間預(yù)變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。（二）PCR產(chǎn)物的鑒定——電泳1.電泳原理：

①電泳的DNA分子具有可解離的基團(tuán)，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的

作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷

的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳。

②PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的

濃度、DNA分子的

等有關(guān)。

③凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的

下被檢測出來。相反大小和構(gòu)象紫外燈探究·實(shí)踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（二）PCR產(chǎn)物的鑒定——電泳1.電泳方法步驟：

用電泳緩沖液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%—1.2%的瓊脂糖溶液，加熱至瓊脂糖熔化，稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子。凝膠溶液完全凝固后拔出梳子，形成加樣孔。取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。配制瓊脂糖溶液制備凝膠加樣電泳、觀察接通電源，待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。探究·實(shí)踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（三）結(jié)果分析與評價(jià)

P85·1.你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來評價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。轉(zhuǎn)NPR

1基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(M：marker；1-陽性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)NPR1基因品系；)DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液(Marker)陽性對照陰性對照待測樣品陽性對照：用于檢測PCR效率；陰性對照：用于檢測是否存在含有其他序列的DNA污染。探究·實(shí)踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（三）結(jié)果分析與評價(jià)

P85·2.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因？如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：①漏加了PCR的反應(yīng)成分；②各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)；③PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：①引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；②退火溫度過低；③DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。探究·實(shí)踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定謝謝觀看！基因工程的基本操作程序(一輪復(fù)習(xí)答疑)高三—人教版—生物學(xué)選擇性必修3—第3章【真題演練體驗(yàn)感悟】1.(2021·湖北)某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是A.增加模板DNA的量

B.延長熱變性的時(shí)間C.延長延伸的時(shí)間

D.提高復(fù)性的溫度√【真題演練體驗(yàn)感悟】2.(2020·北京)為了對重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中(如圖)。A.①＋③ B.①＋② C.③＋② D.③＋④為檢