RNA在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

RNA在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

摘要主要分子檢測(cè)技術(shù)原理及差異RNA擴(kuò)增技術(shù)用于病原體檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)國(guó)內(nèi)外病原體檢測(cè)現(xiàn)狀RNA擴(kuò)增技術(shù)在臨床中應(yīng)用小結(jié)摘要主要分子檢測(cè)技術(shù)原理及差異RNA擴(kuò)增技術(shù)用于病原體檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)國(guó)內(nèi)外病原體檢測(cè)現(xiàn)狀RNA擴(kuò)增技術(shù)在臨床中應(yīng)用小結(jié)

病原體檢測(cè)方法分類以看到“整個(gè)病原體”為基礎(chǔ)的方法鏡檢，培養(yǎng)以直接或間接看到“病原體組分－蛋白質(zhì)”為基礎(chǔ)的方法免疫學(xué)膠體金，Elisa,化學(xué)發(fā)光，etc以看到“病原體組分－核酸”為基礎(chǔ)的方法

分子生物學(xué)分子診斷概念和特點(diǎn)概念：利用標(biāo)本中的核酸作為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)感染性疾病、腫瘤、遺傳性疾病等進(jìn)行診斷和預(yù)后判斷的方法。特點(diǎn)：特異性高、靈敏度高診斷范圍廣、適應(yīng)性強(qiáng)什么是核酸？鏈狀分子DNA(脫氧核糖核酸)

貯存遺傳信息RNA(核糖核酸)

傳遞遺傳信息遺傳信息的傳遞途徑DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄DNAvs.RNA（一）DNA是雙螺旋結(jié)構(gòu)，RNA是單鏈結(jié)構(gòu)DNA很穩(wěn)定，RNA很不穩(wěn)定DNAvs.RNA（二）有些RNA在細(xì)胞中拷貝數(shù)很多

一個(gè)或幾個(gè)拷貝DNA104核糖體RNA(rRNA)16SrRNA23SrRNA使用rRNA為靶標(biāo)，可以大大提高了取樣效率和檢測(cè)靈敏度。常見(jiàn)的RNA檢測(cè)技術(shù)NASBA（國(guó)外）TMA（國(guó)外）SAT（國(guó)內(nèi)）SAT技術(shù)原理①②③④同一溫度下，首先通過(guò)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo)核酸（RNA）的一個(gè)雙鏈DNA拷貝。然后利用T7RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)（100～1000個(gè)）RNA拷貝；帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號(hào)可由熒光檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)捕獲，直觀反映擴(kuò)增循環(huán)情況；同時(shí)，每一個(gè)RNA拷貝再?gòu)姆崔D(zhuǎn)錄開(kāi)始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。

SAT與PCR技術(shù)原理比較

RTRNAcDNART~1000copiesT7SATDNATaqTaqPCR30分鐘內(nèi)擴(kuò)增1010倍RNADNASAT配套儀器(全自動(dòng)工作站)樣本---提取純化RNA---酶反應(yīng)混合液（一體化）全封閉生物安全性好快（48個(gè)樣本/2.5小時(shí)）摘要主要分子檢測(cè)技術(shù)原理及差異RNA擴(kuò)增技術(shù)用于病原體檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)國(guó)內(nèi)外病原體檢測(cè)現(xiàn)狀RNA擴(kuò)增技術(shù)在臨床中應(yīng)用小結(jié)DNA用于臨床檢驗(yàn)的不足“死菌檢測(cè)也陽(yáng)性”，與臨床相關(guān)性差基因型與表型不吻合(耐藥檢測(cè))

不能區(qū)分“潛伏感染”“活動(dòng)性感性”

易交叉污染

反應(yīng)易受抑制SAT檢測(cè)靶標(biāo)為16SrRNA靈敏度更高

RNA在細(xì)胞中拷貝數(shù)很多，細(xì)菌中16srRNA多達(dá)10000-20000個(gè)

一個(gè)或幾個(gè)拷貝DNA10416srRNAJensen,1994-16SrRNA具有高度保守性不同來(lái)源MG的16SrRNA區(qū)域，PCR產(chǎn)物序列同源性100%，準(zhǔn)確區(qū)別不同病原體SAT檢測(cè)靶標(biāo)為16SrRNA檢測(cè)特異性高16SrRNA長(zhǎng)度適中，適合做探針，檢測(cè)更準(zhǔn)確其編碼基因長(zhǎng)度約為1500bp,包含50個(gè)左右功能域RNA診斷（TMA、SAT）具有非常高的靈敏度和準(zhǔn)確度Gen-probe:RNA檢測(cè)羅氏:DNA檢測(cè)與DNA相比，RNA檢測(cè)更利于療效評(píng)估及判愈DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，較穩(wěn)定，不易降解。治愈后仍有“死菌”殘留，人體內(nèi)完全代謝需2-3周時(shí)間

<<中國(guó)性病診療指南>>中指出，如用PCR方法進(jìn)行判愈，需在療程結(jié)束后3-4周。RNA單鏈結(jié)構(gòu)，易降解，病原體死亡后2-3天后完全降解與臨床相關(guān)性好，=“培養(yǎng)”，有利于療效評(píng)估和及時(shí)判愈有些情況下，可以直接診斷“活動(dòng)性感染”

活動(dòng)性感染：指示RNA轉(zhuǎn)錄活躍潛伏感染：指示RNA不轉(zhuǎn)錄能檢測(cè)多種樣本類型，比如尿液等，取樣方便。數(shù)據(jù)來(lái)源：M.Chernesky,D.Jang,K.Luinstra,etal.2006.HighAnalyticalSensitivityandLowRatesofInhibitionMayContributetoDetectionofChlamydiatrachomatisinSignificantlyMoreWomenbytheAPTIMACOMBO2Assay.J.Clin.Microbiology44(2):400-405.反應(yīng)不易受抑制SAT診斷技術(shù)對(duì)于病原體檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)SAT產(chǎn)品特點(diǎn)SAT的優(yōu)勢(shì)帶給臨床的益處檢測(cè)靶標(biāo)：16SrRNA靈敏度高,特異性更強(qiáng)活菌檢測(cè)反映臨床用藥的療效結(jié)果準(zhǔn)確度高早期診斷檢出率高用藥治療后準(zhǔn)確及時(shí)的判愈擴(kuò)增產(chǎn)物：RNA產(chǎn)物易降解，減少實(shí)驗(yàn)室污染風(fēng)險(xiǎn)維護(hù)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控水平反應(yīng)不易受抑制檢測(cè)樣本多樣化（拭子、尿液）取樣方便提高了醫(yī)生的工作效率減輕了病人取樣帶來(lái)的痛苦擴(kuò)增方式：42℃恒溫降低實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求縮短檢測(cè)時(shí)間自動(dòng)化操作更易實(shí)現(xiàn)報(bào)告更快速、更準(zhǔn)確避免了人工操作帶來(lái)的誤差摘要主要分子檢測(cè)技術(shù)原理及差異RNA擴(kuò)增技術(shù)用于病原體檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)國(guó)內(nèi)外病原體檢測(cè)現(xiàn)狀RNA擴(kuò)增技術(shù)在臨床中應(yīng)用小結(jié)

國(guó)內(nèi)外RNA診斷產(chǎn)品監(jiān)管機(jī)構(gòu)認(rèn)可情況國(guó)外：FDA或CE認(rèn)證產(chǎn)品（TMA）國(guó)內(nèi)：SFDA認(rèn)證產(chǎn)品（SAT）沙眼衣原體（CT）核酸檢測(cè)試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增）淋病奈瑟菌（NG）核酸檢測(cè)試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增）解脲脲原體（UU）核酸檢測(cè)試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增）生殖支原體（MG)核酸檢測(cè)試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增）結(jié)核分枝桿菌（TB）核酸檢測(cè)試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增）腸道病毒71型（EV71）核酸檢測(cè)試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增）柯薩奇病毒A16型（CA16）核酸檢測(cè)試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增）腸道病毒（EV）通用型核酸檢測(cè)試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增）肺炎支原體（MP）核酸檢測(cè)試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增）......為什么我們必須熟悉和了解RNA檢測(cè)技術(shù)？（一）

為什么我們必須熟悉和了解RNA檢測(cè)技術(shù)？（二）血液篩查市場(chǎng)美國(guó)中國(guó)RNA診斷RNA診斷傳統(tǒng)技術(shù)傳統(tǒng)技術(shù)其他傳染病市場(chǎng)（優(yōu)生優(yōu)育：CT/NG為例）RNA診斷傳統(tǒng)技術(shù)傳統(tǒng)技術(shù)美國(guó)中國(guó)100%進(jìn)口！有部分國(guó)產(chǎn)

國(guó)內(nèi)外RNA診斷產(chǎn)品應(yīng)用情況RNA用于CT/NG的檢測(cè)（TMA）是目前行業(yè)公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”

為什么我們必須熟悉和了解RNA檢測(cè)技術(shù)？（三）TMA（APTIMACombo2）被廣泛的應(yīng)用于CT/NG檢測(cè)。在美國(guó)，85%的頂級(jí)醫(yī)院使用TMA進(jìn)行CT/NG檢測(cè)沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手可以超過(guò)TMA，是目前市場(chǎng)上最好的CT/NG檢測(cè)產(chǎn)品新方法學(xué)CT/NG的產(chǎn)品臨床試驗(yàn)都必須選擇TMA（APTIMACombo2）做參比試劑數(shù)據(jù)來(lái)源于Internaltraining，Gen-probeRNA用于TB的檢測(cè)（TMA）進(jìn)入多國(guó)診療指南2009：美國(guó)CDC更新NAAT法在TB實(shí)驗(yàn)室診斷中應(yīng)用的指南——所有疑似TB的初診病人，除了做涂片之外，都必須用TMA檢測(cè)至少一份樣本。（TMA獲得FDA認(rèn)證可檢測(cè)涂陰、涂陽(yáng)標(biāo)本，PCR只獲得FDA認(rèn)證可檢測(cè)涂陽(yáng)標(biāo)本）為什么我們必須熟悉和了解RNA擴(kuò)增技術(shù)？（四）UpdatedGuidelinesfortheUseofNucleicAcidAmpflicationTestintheDiagnosisofTuberculosis(2009)UnitedStates

摘要主要分子檢測(cè)技術(shù)原理及差異RNA擴(kuò)增技術(shù)用于病原體檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)國(guó)內(nèi)外病原體檢測(cè)現(xiàn)狀SAT擴(kuò)增技術(shù)在生殖道支原體檢測(cè)優(yōu)勢(shì)結(jié)論國(guó)內(nèi)唯一上市MG診斷試劑結(jié)果準(zhǔn)確

檢測(cè)靶標(biāo)—16SrRNA，靈敏度高，特異性強(qiáng)取樣方便女性：陰道拭子、宮頸拭子、尿液

男性：尿道拭子、尿液療效判愈

檢測(cè)靶標(biāo)為RNA

只有“活菌”RNA才能被檢測(cè)

治愈后2-3天，RNA在體內(nèi)完全降解

上市時(shí)間—2014年4月SAT檢測(cè)MG陽(yáng)性的患者與測(cè)序基本一致對(duì)女性尿液和宮頸拭子同時(shí)檢測(cè)進(jìn)行

SAT檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果分析如下測(cè)序結(jié)果合計(jì)陽(yáng)性陰性尿液和宮頸拭子SAT結(jié)果陽(yáng)性43043陰性5249254合計(jì)48249297陽(yáng)性符合率=43/（43+5）*100%=89.58%陰性符合率=297/（297+0）*100%=100%準(zhǔn)確度=（43+249）/297*100%=98.32%SFDA唯一批準(zhǔn)可用于尿液檢測(cè)的核酸試劑對(duì)女性同一患者的尿液樣本和宮頸拭子樣本同時(shí)檢測(cè)與尿液和陰道拭同時(shí)檢測(cè)SAT檢測(cè)結(jié)果對(duì)比分析如下尿液和陰道拭子MG-SAT結(jié)果合計(jì)陽(yáng)性陰性尿液和宮頸拭子MG-SAT結(jié)果陽(yáng)性39443陰性5249254合計(jì)44253297女性同一患者樣本一致性符合率=(39+249)/297*100%=96.97%SAT檢測(cè)利于用藥監(jiān)測(cè)與判愈RNA很快降解用藥監(jiān)測(cè)和判愈提高醫(yī)院診療水平降低患者診治成本檢測(cè)方法可否監(jiān)測(cè)原因鏡檢法否不能判斷是否活菌培養(yǎng)法是盡管活菌才能培養(yǎng)，但靈敏不足金標(biāo)法否假陰性率偏高PCR否有效治療后,細(xì)菌DNA至少需要3周降解SAT是有效治療后,細(xì)菌SAT—MG檢測(cè)給臨床帶來(lái)意義

特點(diǎn)獲益兼顧拭子及尿液樣本檢測(cè)1擴(kuò)大了患者類型（孕婦、未婚女性及未成年人）2減輕病人痛苦，保護(hù)隱私（男性患者）3降低了醫(yī)生的工作量4無(wú)創(chuàng)式取樣，減少取樣帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)靶標(biāo)為16SrRNA靈敏度高、特異性強(qiáng)，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性，提高了醫(yī)院的診療水平，避免了診斷錯(cuò)誤帶來(lái)的醫(yī)療糾紛病原體死亡，RNA很