豬鏈球菌9型PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

DB32/T××××—2019PAGE4豬鏈球菌9型PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬鏈球菌9型PCR檢測(cè)技術(shù)所用的儀器設(shè)備和主要試劑、引物、方法步驟、結(jié)果判定、廢棄物處理和防止污染的措施等要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬鏈球菌9型的PCR檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

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分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范《病死及病害動(dòng)物無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)范》（農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2017〕25號(hào)）術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1豬鏈球菌9型Streptococcussuisserotype9屬于鏈球菌屬的一種細(xì)菌，根據(jù)其莢膜多糖抗原的差異，可分為1-31、33及1/2共33個(gè)血清型。豬鏈球菌9型是豬鏈球菌的一個(gè)血清型，不僅對(duì)豬致病性很強(qiáng)，而且可以感染特定的人群，是一種人獸共患病病原菌。4儀器設(shè)備和主要試劑4.1儀器設(shè)備高速離心機(jī)、水浴鍋、PCR儀、核酸電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。4.2主要試劑生理鹽水、超純水、蛋白酶K、2×PCRMix、瓊脂糖（電泳級(jí)）、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000Marker）。5引物5.1上游引物：5′-GGCTACATATAATGGAAGCCC-3′。5.2下游引物：5′-CCGAAGTATCTGGGCTACTG-3′。6方法步驟6.1樣品處理6.1.1病料樣品處理采用差速離心法，取約5g病料（肝或肺或腦組織），剪碎研磨，用5mL生理鹽水混懸，先2000r/min離心2min，去除大組織塊，取上清液，后10000r/min離心5min，棄上清液，沉淀以200μL超純水重懸，備用。6.1.2待檢培養(yǎng)物樣品處理取待檢液體培養(yǎng)物（純培養(yǎng)物或混合培養(yǎng)物）1mL10000r/min離心5min，棄上清，沉淀以200μL超純水重懸，備用。陰性對(duì)照：THB培養(yǎng)基。陽(yáng)性對(duì)照：豬鏈球菌9型標(biāo)準(zhǔn)菌株（22083）的THB培養(yǎng)物。陰性、陽(yáng)性對(duì)照也同樣處理，對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記。6.2DNA提取取6.1獲得的樣品及對(duì)照，每200μL加入3μL蛋白酶K（20mg/mL），42℃作用1h，煮沸5min，10000r／min離心5min，上清作為模板DNA。6.3PCR擴(kuò)增6.3.1反應(yīng)條件按25μL體系進(jìn)行，2×PCRMix12.5μL，上游引物（10pmol/μL）1.0μL，下游引物（10pmol/μL）1.0μL，模板DNA2.0μL，超純水8.5μL。按如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。95℃5min，然后進(jìn)入循環(huán)94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35個(gè)循環(huán)，于72℃延伸10min，4℃保存。6.3.2電泳將PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓為120V，時(shí)間30min。6.3.3結(jié)果觀(guān)察用凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察結(jié)果，并進(jìn)行拍照。7結(jié)果判定7.1檢測(cè)結(jié)果成立條件陽(yáng)性對(duì)照的PCR產(chǎn)物電泳后在389bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，陰性對(duì)照PCR產(chǎn)物電泳后沒(méi)有條帶（見(jiàn)附錄A），檢測(cè)結(jié)果成立；否則，結(jié)果不成立。7.2結(jié)果判定7.2.1在檢測(cè)結(jié)果成立的前提下，如果檢測(cè)樣品中PCR產(chǎn)物電泳后在389bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，判為陽(yáng)性，即該樣品為豬鏈球菌9型核酸陽(yáng)性。7.2.2在檢測(cè)結(jié)果成立的前提下，如果檢測(cè)樣品中PCR產(chǎn)物電泳后在389bp的位置上未出現(xiàn)一條特異性條帶，判為陰性，即該樣品為豬鏈球菌9型核酸陰性。7.2.3如果陽(yáng)性對(duì)照無(wú)相應(yīng)的目的條帶，可能是存在操作失誤，該檢測(cè)需要重復(fù)進(jìn)行；如果陰性對(duì)照有相應(yīng)的目的條帶，可能是陰性對(duì)照存在污染或是操作失誤，該檢測(cè)需要重復(fù)進(jìn)行。8廢棄物處理和防止污染的措施檢測(cè)過(guò)程中的廢棄物，應(yīng)做好無(wú)害化處理。檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施見(jiàn)附錄B。附錄A(資料性附錄)豬鏈球菌9型PCR產(chǎn)物電泳圖M12M122000bp——1000bp2000bp——1000bp——750bp——500bp——250bp——100bp————389bpM——DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000Marker）；1——陽(yáng)性對(duì)照；2——陰性對(duì)照。圖A.1豬鏈球菌9型PCR產(chǎn)物電泳圖

附錄B(規(guī)范性附錄)檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施B.1抽樣和制樣過(guò)程抽樣和制樣工具，應(yīng)清洗干凈，121℃，15min～20min滅菌，一套清潔工具限于一個(gè)樣品使用。存放樣品的容器應(yīng)該經(jīng)過(guò)清洗、滅菌，或?yàn)橐淮涡詼缇萜?。B.2檢測(cè)過(guò)程B.2.1PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分為樣品制備區(qū)、前PCR區(qū)、PCR區(qū)、后PCR區(qū)。將模板提取、PCR反應(yīng)液配制、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)作應(yīng)從“凈區(qū)”到“臟區(qū)”單方向進(jìn)行。B.2.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)穿實(shí)驗(yàn)服和戴手套，手套要經(jīng)常更換。各區(qū)要有專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)服，經(jīng)常清洗。B.2.3各區(qū)所有的試劑、器材(尤其是移液器)、儀器都應(yīng)專(zhuān)用，不得帶出該區(qū)。B.2.4所有溶液、水、耗材和器具要121℃，15min～20min滅菌，避免核酸和(或)核酸酶污染。每種溶液應(yīng)使用高質(zhì)量的成分和超純水。所有試劑應(yīng)該以大體積配制，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。B.2.5裝有DNA模板或