生物化學(xué)古練權(quán)版省公開(kāi)課一等獎(jiǎng)全國(guó)示范課微課金獎(jiǎng)?wù)n件

非水溶劑中酶促反應(yīng)有機(jī)介質(zhì)中酶促反應(yīng)概述有機(jī)介質(zhì)中反應(yīng)條件有機(jī)介質(zhì)對(duì)酶性質(zhì)影響有機(jī)介質(zhì)中酶催化應(yīng)用1/92長(zhǎng)久觀點(diǎn)認(rèn)為:有機(jī)溶劑是酶變性劑、失活劑這一傳統(tǒng)酶學(xué)思想影響下，酶在有機(jī)介質(zhì)中催化作用研究以前幾乎毫無(wú)進(jìn)展。這一觀點(diǎn)直到1984年，非水溶劑中酶催化研究才取得了突破性進(jìn)展。1984年美國(guó)Klibanov,A.M.在Science上發(fā)表了一篇關(guān)于酶在有機(jī)介質(zhì)中催化條件和特點(diǎn)綜述。Klibanov等工作——在僅含微量水有機(jī)介質(zhì)(Microaqueousmedia)中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等許多有機(jī)化合物。基于研究工作，Ｋlibanov等提出只要條件適當(dāng)，酶能夠在非生物體系疏水介質(zhì)中催化天然或非天然疏水性底物和產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，酶不但能夠在水與有機(jī)溶劑互溶體系，也能夠在水與有機(jī)溶劑組成雙液相體系，甚至在僅含微量水或幾乎無(wú)水有機(jī)溶劑中表現(xiàn)出催化活性。這一觀點(diǎn)無(wú)疑是對(duì)酶只能在水溶液中起作用傳統(tǒng)酶學(xué)思想挑戰(zhàn)有機(jī)介質(zhì)中酶促反應(yīng)概述2/92有機(jī)相酶反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)有利于疏水性底物反應(yīng)。可提升酶熱穩(wěn)定性。能催化在水中不能進(jìn)行反應(yīng)?？筛淖兎磻?yīng)平衡移動(dòng)方向。可控制底物專一性。可預(yù)防由水引發(fā)副反應(yīng)?？蓴U(kuò)大反應(yīng)pH值適應(yīng)性。酶易于實(shí)現(xiàn)固定化。酶和產(chǎn)物易于回收?？煞乐刮⑸镂廴?。3/92有機(jī)相酶反應(yīng)具備條件確保必需水含量。選擇適當(dāng)酶及酶形式。選擇適當(dāng)溶劑及反應(yīng)體系。選擇最正確pH值。4/92有機(jī)相酶反應(yīng)研究進(jìn)展超臨界流體中酶反應(yīng)仿水溶劑和印跡技術(shù)5/92超臨界流體中酶反應(yīng)指溫度和壓力均在本身臨界點(diǎn)以上高密度流體，含有和液體一樣凝聚力、溶解力；然而其擴(kuò)散系數(shù)又靠近于氣體，是通常液體近百倍。6/92超臨界流體相關(guān)性質(zhì)超臨界流體P-V-T性質(zhì)7/92所謂超臨界CO2是指純凈CO2被加熱或壓縮到高于其臨界點(diǎn)（臨界溫度31.1℃，臨界壓力7.28Mpa)時(shí)狀態(tài)。該流體含有沒(méi)有毒、無(wú)臭、不燃等優(yōu)點(diǎn)。提升溶劑選擇性基本標(biāo)準(zhǔn)操作溫度和超臨界流體臨界溫度靠近超臨界流體化學(xué)選擇和待分離溶質(zhì)化學(xué)性質(zhì)靠近超臨界流體相關(guān)性質(zhì)8/92超臨界流體萃取應(yīng)用實(shí)例9/92有機(jī)相酶反應(yīng)研究進(jìn)展超臨界流體中酶反應(yīng)仿水溶劑和印跡技術(shù)10/92仿水溶劑和印跡技術(shù)仿水溶劑體系原理分子印跡技術(shù)11/92仿水溶劑體系原理可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等極性添加劑部分或全部替換系統(tǒng)中輔助溶劑水，從而影響酶活性和立體選擇性。極性添加劑對(duì)體系影響對(duì)反應(yīng)體系內(nèi)水分配影響與蛋白質(zhì)直接作用對(duì)產(chǎn)物分配影響應(yīng)用舉例：經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)靥砑由僭SDMF（二甲基酰胺），脂肪酶催化布洛芬與正丁醇酯化反應(yīng)產(chǎn)物得率從51%提升到91%，且反應(yīng)活性也有所提升。12/92分子印跡技術(shù)當(dāng)枯草桿菌蛋白酶從含有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑（N-Ac-Tyr-NH2）水溶液中凍干出來(lái)后，再將抑制劑除去，該酶在辛烷中催化酯化反應(yīng)速度比不含抑制劑水溶液中凍干出來(lái)酶高100倍，但這么處理酶在水溶液中其活性與未處理酶相同。原理：競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑誘導(dǎo)酶活性中心構(gòu)象發(fā)生改變，形成一個(gè)高活性構(gòu)象形式，而此種構(gòu)象形式在除去抑制劑后，因酶在有機(jī)介質(zhì)中高度剛性而得到保持。酶蛋白分子在有機(jī)相中含有對(duì)配體“記憶”功效。13/92非水溶劑中酶促反應(yīng)有機(jī)介質(zhì)中酶促反應(yīng)概述有機(jī)介質(zhì)中反應(yīng)條件有機(jī)介質(zhì)對(duì)酶性質(zhì)影響有機(jī)介質(zhì)中酶催化應(yīng)用14/92有機(jī)介質(zhì)中酶促反應(yīng)條件必需水酶選擇溶劑及反應(yīng)體系選擇pH選擇和離子強(qiáng)度影響15/921.必需水概念緊緊吸附在酶分子表面，維持酶催化活性所必需最少許水。16/921.必需水影響酶反應(yīng)體系中需水含量原因不一樣酶需水量不一樣。同一個(gè)酶在不一樣有機(jī)溶劑中需水量不一樣，溶劑疏水性越強(qiáng)，需水量越少17/922.酶選擇酶種類選擇：脂肪酶、蛋白酶、次黃嘌呤氧化酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶等。除與酶相關(guān)，還與酶-底物、產(chǎn)物-溶劑間關(guān)系相關(guān)。酶形式選擇酶粉比如：有些人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，發(fā)覺(jué)催化活性隨反應(yīng)體系中酶量降低而顯著增加。化學(xué)修飾酶比如：SOD酶經(jīng)糖脂修飾后變成脂溶性，它對(duì)溫度、pH、蛋白酶水解穩(wěn)定性均高于天然SOD。固定化酶把酶吸附在不溶性載體上（如硅膠、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其反抗有機(jī)介質(zhì)變性能力、反應(yīng)速度、熱穩(wěn)定性等都可提升。18/923.溶劑及反應(yīng)體系選擇

水溶性有機(jī)溶劑：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙晴等水不溶性有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等酶促反應(yīng)有機(jī)介質(zhì)體系：?jiǎn)蜗喙踩軇w系（水/水溶性有機(jī)熔劑）兩相體系（水/水不溶性有機(jī)溶劑）低水有機(jī)溶劑體系（有機(jī)溶劑體系）反膠束體系19/92反膠束體系概念和表面活性劑反膠束體系概念表面活性劑分散于連續(xù)有機(jī)相中自發(fā)形成納米尺度一個(gè)聚集體。反膠束溶液是透明熱力學(xué)穩(wěn)定系統(tǒng)。表面活性劑：表面活性劑是由親水憎油極性基團(tuán)和親油憎水非極性基團(tuán)兩部分組成兩性分子。在有機(jī)相酶反應(yīng)中用得最多是陰離子表面活性劑：AOT(AerosolOT)，其化學(xué)名為丁二酸-2-乙基酯磺酸鈉。20/92有機(jī)溶劑影響酶催化方式有機(jī)溶劑能經(jīng)過(guò)直接與酶相互作用引發(fā)抑制或失活增大酶反應(yīng)活化能來(lái)降低酶反應(yīng)速度。降低中心內(nèi)部極性并加強(qiáng)底物與酶之間形成氫鍵，使酶活性下降。酶三級(jí)結(jié)構(gòu)改變，間接改變酶活性中心結(jié)構(gòu)影響失活。有機(jī)溶劑與擴(kuò)散底物或產(chǎn)物相互作用而影響酶活有機(jī)溶劑直接與酶附近必需水相互作用21/924.pH選擇和離子強(qiáng)度影響pH選擇：在有機(jī)溶劑環(huán)境中，不會(huì)發(fā)生質(zhì)子化及脫質(zhì)子化現(xiàn)象。酶在水相pH值可在有機(jī)相中保持，同一個(gè)酶不一樣起源，對(duì)pH值敏感程度大不相同。離子強(qiáng)度影響：隨凍干時(shí)用緩沖溶液離子強(qiáng)度增大，酶活會(huì)增大。22/92非水溶劑中酶促反應(yīng)有機(jī)介質(zhì)中酶促反應(yīng)概述有機(jī)介質(zhì)中反應(yīng)條件有機(jī)介質(zhì)對(duì)酶性質(zhì)影響有機(jī)介質(zhì)中酶催化應(yīng)用23/92有機(jī)介質(zhì)對(duì)酶性質(zhì)影響穩(wěn)定性活性專一性反應(yīng)平衡方向24/921.穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性提升和儲(chǔ)存穩(wěn)定性提升結(jié)論：在低水有機(jī)溶劑體系中，酶穩(wěn)定性與含水量親密相關(guān)；普通在低于臨界含水量范圍內(nèi)，酶很穩(wěn)定；含水量超出臨界含水量后酶穩(wěn)定性隨含水量增加而急劇下降。25/922.活性剛-柔并存剛性：生物大分子結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性柔性：生物大分子局部區(qū)域含有一定可運(yùn)動(dòng)性。（1）單相共溶劑體系中，有機(jī)溶劑對(duì)酶活性影響有機(jī)溶劑直接作用于酶。有些酶活性會(huì)伴隨一些有機(jī)溶劑濃度升高而增大，在某一濃度（最適濃度）到達(dá)最大值；若濃度再升高，則活性下降。（2）低水有機(jī)溶劑體系中，大部分酶活性得以保留，但也有一些酶活性亦改變。例有些人對(duì)吸附在不一樣載體上胰凝乳蛋白酶或乙酸脫氫酶在各種水活度下酶活性研究表明，酶活性隨水活度大小而改變，在一定水活度下，酶活性隨載體不一樣而改變。26/922.活性（3）在反向微團(tuán)體系中，微團(tuán)效應(yīng)使一些酶活性增加超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值活性稱為超活性（Super-activity）。認(rèn)為：超活性是由圍繞在酶分子外面表面活性劑這一外殼之較大剛性所引發(fā)。依據(jù)：微團(tuán)水化程度（W）（W=[H2O]/[表面活性劑]）最正確值和酶活性最大值呈正相關(guān)W值最正確時(shí)，微團(tuán)內(nèi)徑總是相當(dāng)于被包裹酶分子直徑27/923.專一性一些有機(jī)介質(zhì)可能使一些酶專一性發(fā)生改變，這是酶活性中心構(gòu)象剛性增強(qiáng)結(jié)果。有些在水中不能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)路徑，在有機(jī)介質(zhì)中卻成為主導(dǎo)反應(yīng)。28/92酶活性喪失可能原因29/924.反應(yīng)平衡方向酶合成產(chǎn)物有機(jī)溶劑使用濃度（%）合成收率（%）枯草桿菌蛋白酶核糖核酸酶甘油9050無(wú)色桿菌蛋白酶人胰島素DMF和乙醇3080羧肽酶牛胰核糖核酸酶甘油9050凝血酶人生長(zhǎng)激素甘油8020嗜熱桿菌蛋白酶天冬甜味素乙酸乙酯

胰凝乳蛋白酶腦啡肽乙醇或DMF

30/92非水溶劑中酶促反應(yīng)有機(jī)介質(zhì)中酶促反應(yīng)概述有機(jī)介質(zhì)中反應(yīng)條件有機(jī)介質(zhì)對(duì)酶性質(zhì)影響有機(jī)介質(zhì)中酶催化應(yīng)用31/92有機(jī)介質(zhì)中酶催化應(yīng)用酶催化反應(yīng)應(yīng)用蛋白酶 肽合成?；?合成多肽糖類?；u基化酶氧化 甾體轉(zhuǎn)化過(guò)氧化物酶 聚合酚類、胺類化合物聚合膽固醇氧化酶 氧化膽固醇測(cè)定 醇脫氫酶酯化有機(jī)硅醇酯化脂肪酶 肽合成酯合成轉(zhuǎn)酯聚合?；?青霉素G前體肽合成醇與有機(jī)酸合成酯類各類酯類生產(chǎn)二酯選擇性聚合甘醇?；?2/92手性藥品拆分概念：手性化合物是指化學(xué)組成相同，而其立體結(jié)構(gòu)互為對(duì)映體兩種異構(gòu)體化合物。手性藥品兩種對(duì)映體藥效差異一個(gè)有顯著療效，另一個(gè)有療效弱或無(wú)效

一個(gè)有顯著療效，另一個(gè)有毒副作用

兩種對(duì)映體藥效相反

兩種對(duì)映體含有各自不一樣藥效

兩種消旋體作用含有互補(bǔ)性33/92手性藥品拆分方法分為：非生物法、生物法非生物法（機(jī)械分離法、形成和分離對(duì)映體異構(gòu)法、色譜分離法、動(dòng)力學(xué)拆分）生物拆分法原理實(shí)質(zhì)即兩個(gè)對(duì)映體競(jìng)爭(zhēng)酶同一個(gè)活性中心位置，二者反應(yīng)速率不一樣，產(chǎn)生選擇性，從而使反應(yīng)產(chǎn)物含有光學(xué)活性。青霉素?；讣捌浯呋饔茫豪闷涞孜飳Ｒ恍约皩?duì)映體選擇性進(jìn)行光學(xué)異構(gòu)體合成與拆分。34/922、手性高分子聚合物制備(1)可生物降解聚酯合成(2)糖脂合成3、酚樹(shù)脂合成如辣根過(guò)氧化物酶在二氧六環(huán)與水混溶均一介質(zhì)體系中，能夠催化苯酚等酚類物質(zhì)聚合，生成酚類聚合物。4、導(dǎo)電有機(jī)聚合物合成如辣根過(guò)氧化物酶能夠在與水混溶有機(jī)介質(zhì)（如丙酮、乙醇、二氧六環(huán)等）中，催化苯胺聚合生成聚苯胺。5、發(fā)光有機(jī)聚合物合成如辣根過(guò)氧化物酶能夠在有機(jī)介質(zhì)中催化對(duì)苯基苯酚合成聚對(duì)苯基苯酚，將這種聚合物制成二極管，能夠發(fā)出藍(lán)光。6、食品添加劑生產(chǎn)如利用芳香醛脫氫酶生成香蘭素。7、甾體轉(zhuǎn)化如可松轉(zhuǎn)化為氫化可松酶促反應(yīng)，在水-乙酸丁酯或水-乙酸乙酯組成系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化率高達(dá)100%和90%。8、生物能源如生物柴油。35/92有機(jī)溶劑中酶促反應(yīng)C-O鍵形成C--N鍵反應(yīng)，肽合成C-C鍵形成還原反應(yīng)氧化反應(yīng)異構(gòu)化反應(yīng)

C-X反應(yīng)鹵化反應(yīng)36/92C-O鍵形成酯類：酯酶和脂肪酶可催化酯合成反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯反應(yīng)和酸酐水解反應(yīng)。環(huán)氧化合物糖苷鍵水解和形成加氧氧化反應(yīng)37/92酯合成反應(yīng)38/92轉(zhuǎn)酯反應(yīng)39/92酸酐水解40/92環(huán)氧化合反應(yīng)41/92糖焦磷酸化，糖異構(gòu)化42/92糖衍生物43/92醇解44/92加氧氧化反應(yīng)45/92有機(jī)溶劑中酶促反應(yīng)C-O鍵形成C--N鍵反應(yīng)，肽合成C-C鍵形成還原反應(yīng)氧化反應(yīng)異構(gòu)化反應(yīng)

C-X反應(yīng)鹵化反應(yīng)46/92C--N鍵反應(yīng)，肽合成47/92有機(jī)溶劑中酶促反應(yīng)C-O鍵形成C--N鍵反應(yīng)，肽合成C-C鍵形成還原反應(yīng)氧化反應(yīng)異構(gòu)化反應(yīng)

C-X反應(yīng)鹵化反應(yīng)48/92C-C鍵形成羥醛反應(yīng)酮醛和羥醛轉(zhuǎn)移反應(yīng)醛縮合反應(yīng)乙酰輔酶A參加C-C鍵組成反應(yīng)醛加成反應(yīng)49/92（1）羥醛反應(yīng)50/9251/92（2）酮醛和羥醛轉(zhuǎn)移反應(yīng)52/92（3）醛縮合反應(yīng)53/92（4）乙酰輔酶A參加C-C鍵組成反應(yīng)54/92（5）醛加成反應(yīng)55/92有機(jī)溶劑中酶促反應(yīng)C-O鍵形成C--N鍵反應(yīng)，肽合成C-C鍵形成還原反應(yīng)氧化反應(yīng)異構(gòu)化反應(yīng)

C-X反應(yīng)鹵化反應(yīng)56/92還原反應(yīng)57/92有機(jī)溶劑中酶促反應(yīng)C-O鍵形成C--N鍵反應(yīng)，肽合成C-C鍵形成還原反應(yīng)氧化反應(yīng)異構(gòu)化反應(yīng)

C-X反應(yīng)鹵化反應(yīng)58/92氧化反應(yīng)（1）C-H,C=C氧化（2）醇氧化（3）苯酚氧化（4）羧酸氧化（5）C-N氧化59/92（１）C-H,C=C氧化60/92（２）醇氧化61/92（3）苯酚氧化62/92（４）羧酸氧化63/92（5）C-N氧化64/92有機(jī)溶劑中酶促反應(yīng)C-O鍵形成C--N鍵反應(yīng)，肽合成C-C鍵形成還原反應(yīng)氧化反應(yīng)異構(gòu)化反應(yīng)

C-X反應(yīng)鹵化反應(yīng)65/92異構(gòu)化反應(yīng)

66/92有機(jī)溶劑中酶促反應(yīng)C-O鍵形成C--N鍵反應(yīng)，肽合成C-C鍵形成還原反應(yīng)氧化反應(yīng)異構(gòu)化反應(yīng)

C-X反應(yīng)鹵化反應(yīng)67/92C-X反應(yīng)鹵化反應(yīng)68/92酶工程酶工程定義化學(xué)酶工程固定化酶生物酶工程酶工程應(yīng)用范圍69/92酶工程定義酶工程即利用酶催化作用，在一定生物反應(yīng)器中，將對(duì)應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成所需產(chǎn)品。酶工程是當(dāng)代酶學(xué)理論與化工技術(shù)交叉技術(shù)，它應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域。70/92酶工程酶工程主要研究酶生產(chǎn)、純化、固定化技術(shù)、酶分子結(jié)構(gòu)修飾和改造以及在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和理論研究等方面應(yīng)用。酶工程主要采取兩種方法。一是化學(xué)酶工程，即經(jīng)過(guò)對(duì)酶化學(xué)修飾或固定化處理，改進(jìn)酶性質(zhì)以提升酶效率和減低成本，甚至經(jīng)過(guò)化學(xué)合成法制造人工酶；另一個(gè)是生物酶工程，即用基因重組技術(shù)生產(chǎn)酶以及對(duì)酶基因進(jìn)行修飾或設(shè)計(jì)新基因，從而聲查性能穩(wěn)定，含有新生物活性及催化效率更高酶。所以酶工程能夠說(shuō)是把酶學(xué)基本原理與化學(xué)工程技術(shù)及重組技術(shù)有機(jī)結(jié)合而形成新型應(yīng)用技術(shù)。71/92酶工程酶工程定義化學(xué)酶工程固定化酶生物酶工程酶工程應(yīng)用范圍72/92化學(xué)酶工程1．天然酶工業(yè)用酶制劑大多是經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵而取得粗酶，價(jià)格低，應(yīng)用方式簡(jiǎn)單，產(chǎn)品種類少，使用范圍窄。比如洗滌劑、皮革生產(chǎn)等用蛋白酶；紙張制造、棉布退漿等用淀粉酶；漆生產(chǎn)用多酚氧化酶；乳制品中凝乳酶等。天然酶分離純化伴隨各種層析技術(shù)及電泳技術(shù)發(fā)展，得到長(zhǎng)足進(jìn)展，當(dāng)前醫(yī)藥及科研用酶多數(shù)是從生物材料中分離純化得到。73/92化學(xué)酶工程2．化學(xué)修飾酶經(jīng)過(guò)對(duì)酶分子化學(xué)修飾能夠改進(jìn)酶性能，以適合用于醫(yī)藥應(yīng)用及研究工作要求?；瘜W(xué)修飾路徑，能夠經(jīng)過(guò)對(duì)酶分子表面進(jìn)行修飾，也可對(duì)酶分子內(nèi)部進(jìn)行修飾。主要方法有：①酶功效基修飾：經(jīng)過(guò)對(duì)酶功效基化學(xué)修飾提升酶穩(wěn)定性和活性。比如將α-胰凝乳蛋白酶表面氨基修飾成親水性更強(qiáng)-NHCH2COOH，可使酶抗不可逆熱失活穩(wěn)定性在60℃時(shí)提升了1000倍。②交聯(lián)反應(yīng)：用一些雙功效試劑能使酶分子間或分子內(nèi)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而改變酶活性或穩(wěn)定性。比如將人α-半乳糖苷酶A經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)修飾后，其酶活性比天然酶穩(wěn)定，對(duì)熱變性與蛋白質(zhì)水解穩(wěn)定性也顯著增加。若將兩種大小、電荷和生物功效不一樣藥用酶交聯(lián)在一起，則有可能在體內(nèi)將這兩種酶同時(shí)輸送到同一部位，提升藥效。③大分子修飾：可溶性高分子化合物如肝素、葡聚糖、聚乙二醇等可修飾酶蛋白側(cè)鏈，提升酶穩(wěn)定性，改變酶一些主要性質(zhì)。如α-淀粉酶與葡聚糖結(jié)合后熱穩(wěn)定性顯著增加，在65℃結(jié)合酶半衰期為63min，而天然酶半衰期只有2.5min。74/92酶工程酶工程定義化學(xué)酶工程固定化酶生物酶工程酶工程應(yīng)用范圍75/92固定化酶固定化酶（immobilizedenzyme），是用物理或化學(xué)方法處理水溶性酶使之變成不溶于水或固定于固相載體但仍含有酶活性酶衍生物。在催化反應(yīng)中，它以固相狀態(tài)作用于底物，反應(yīng)完成后，輕易與水溶性反應(yīng)物分離，可重復(fù)使用。固定化酶不但仍含有酶高度專一性和高催化效率特點(diǎn)，且比水溶性酶穩(wěn)定，可較長(zhǎng)久使用，含有較高經(jīng)濟(jì)效益。將酶制成固定化酶，作為生物體內(nèi)酶模擬，可有利于了解微環(huán)境對(duì)酶功效影響。固定化酶在文件中曾用水不溶酶、不溶性酶、固相酶、結(jié)合酶、固定酶、酶樹(shù)脂及載體結(jié)合酶等名稱。酶催化反應(yīng)依賴于它活性部位完整性，所以在固定某一酶時(shí)必須選擇適當(dāng)條件，使其活性部位基因不受影響，并防止高溫、強(qiáng)酸及強(qiáng)堿等條件，不使蛋白質(zhì)變性。76/92固定化酶①載體結(jié)正當(dāng)：最慣用是共價(jià)結(jié)正當(dāng)，即酶蛋白非必需基團(tuán)經(jīng)過(guò)共價(jià)鍵和載體形成不可逆連接。在溫和條件下能偶聯(lián)蛋白質(zhì)基團(tuán)包含：氨基、羧基、半胱氨酸巰基、組氨酸咪唑基、酪氨酸酚基、絲氨酸和蘇氨酸羥基。參加和載體共價(jià)結(jié)合基團(tuán)，不能是酶表現(xiàn)活力所必需基團(tuán)。②交聯(lián)法：依靠雙功效團(tuán)試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使之不溶于水從而形成固定化酶。常采取雙功效團(tuán)試劑有戊二醛、順丁烯二酸酐等。酶蛋白游離氨基、酚基、咪唑基及巰基均可參加交聯(lián)反應(yīng)。③包埋法：酶被裹在凝膠細(xì)格子中或被半透性聚合物膜包圍而成為格子型和微膠囊型兩種。包埋法制備固定化酶除包埋水溶性酶外還常包埋細(xì)胞，制成固定化細(xì)胞，比如可用明膠及戊二醛包埋含有青霉素?；富盍w，工業(yè)上用于生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸。酶經(jīng)過(guò)固定化后,比較能耐受溫度及pH改變，最適pH往往稍有移位,對(duì)底物專一性沒(méi)有任何改變，實(shí)際使用效率提升幾十倍（如5′-磷酸二酯酶工業(yè)應(yīng)用）甚至幾百倍77/92固定化酶固定化酶形式多樣，可制成機(jī)械性能好顆粒裝成酶柱用于連續(xù)生產(chǎn)；或在反應(yīng)器中進(jìn)行批式攪拌反應(yīng)；也可制成酶膜、酶管等應(yīng)用于分析化學(xué)；又可制成微膠囊酶，作為治療酶應(yīng)用于臨床?，F(xiàn)在又有些人用酶膜（包含細(xì)胞、組織、微生物制成膜）與電、光、熱等敏感元件組成一個(gè)裝置稱生物傳感器，用于測(cè)定有機(jī)化合物和發(fā)酵自動(dòng)控制中信息傳遞及環(huán)境保護(hù)中有害物質(zhì)檢測(cè)。最慣用是酶膜與離子選擇電極組成生物傳感器，比如脲傳感器是由固定化脲酶、固定化硝化菌及氧電極組成，脲經(jīng)脲酶分解成氨及二氧化碳，氨又繼續(xù)被硝化菌氧化，總耗氧量則經(jīng)過(guò)氧電極反應(yīng)出電流改變，用以計(jì)算脲含量。78/92酶工程酶工程定義化學(xué)酶工程固定化酶生物酶工程酶工程應(yīng)用范圍79/92生物酶工程生物酶工程是在化學(xué)酶工程基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)，是以酶學(xué)和DNA重組技術(shù)為主當(dāng)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)物。所以它亦可稱為高級(jí)酶工程。自從70年代初DNA重組技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，把酶學(xué)推進(jìn)到一個(gè)十分主要發(fā)展時(shí)期，使它基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究領(lǐng)域發(fā)生著巨大革命性改變，產(chǎn)生了生物酶工程。生物酶工程主要包含三個(gè)方面：(1)用DNA重組技術(shù)(即基因工程技術(shù))大量地生產(chǎn)酶(克隆酶)；(2)對(duì)酶基因進(jìn)行修飾，產(chǎn)生遺傳修飾酶(突變酶)；(3)設(shè)計(jì)新酶基因，合成自然界不曾有過(guò)、性能穩(wěn)定、催化效率更高新酶。80/92酶基因克隆和表示技術(shù)應(yīng)用使我們有可能克隆各種天然蛋白基因或酶基因。先在特定酶結(jié)構(gòu)基因前加上高效開(kāi)啟基因序列和必要調(diào)控序列，再將此片段克隆到一定載體中，然后將帶有特定酶基因上述雜交表示載體轉(zhuǎn)化到適當(dāng)受體細(xì)菌中，經(jīng)培養(yǎng)繁殖，再?gòu)乃鸭w中分離得到大量表示產(chǎn)物——我們所需要酶。一些來(lái)自于人體酶制劑，如治療血栓栓塞病尿激酶原，就能夠用此法取代從大量人尿中提取。另外還有組織纖溶酶原激活劑(TPA)與凝乳酶等一百各種酶基因已經(jīng)克隆成功，其中一些還已進(jìn)行了高效表示。此法產(chǎn)生出大量酶，并易于提取分離純化。81/92近幾年興起另一個(gè)新研究領(lǐng)域：酶選擇性遺傳修飾，即酶基因定點(diǎn)突變。研究者們?cè)诜治霭被嵝蛄懈闱迕敢患?jí)結(jié)構(gòu)及X線衍射分析搞清酶空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，再在由功效推知結(jié)構(gòu)或由結(jié)構(gòu)推知功效重復(fù)推敲下，設(shè)計(jì)出酶基因改造方案，確定選擇性遺傳修飾修飾位點(diǎn)?，F(xiàn)在人們已掌握技術(shù)，所以只要有遺傳設(shè)計(jì)藍(lán)圖，就能人工合成出所設(shè)計(jì)酶基因。酶遺傳設(shè)計(jì)主要目標(biāo)是創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)酶，用于生產(chǎn)昂貴特殊藥品和超自然生物制品，以滿足人類特殊需要。82/92需要改進(jìn)酶學(xué)性質(zhì)包含：對(duì)熱、氧化劑、非水溶劑穩(wěn)定性；對(duì)蛋白水解作用敏感性；免疫原性；最適pH、離子強(qiáng)度及溫度；催化效率；對(duì)底物和輔助因子專一性與親協(xié)力；反應(yīng)主體化學(xué)選