分子發(fā)光分析法

第五章分子發(fā)光分析法1分子發(fā)光基態(tài)分子吸收了一定能量后，躍遷至激發(fā)態(tài)，當激發(fā)態(tài)分子以輻射躍遷形式將其能量釋放返回基態(tài)時，便產生分子發(fā)光。激發(fā)模式光致發(fā)光（熒光，磷光）熱致發(fā)光場致發(fā)光化學發(fā)光2主要分析方法：熒光分析法(MolecularFluorescence)磷光分析法(MolecularPhosphorescence)化學發(fā)光分析法(Chemiluminescence)3§5.1熒光分析法一、概述分子熒光法是根據物質的分子熒光光譜進行定性，以熒光強度進行定量的一種方法16世紀，人們已經觀察到了熒光現象1852年，Stokes考察了奎寧和葉綠素的熒光，對熒光現象給出了解釋1864年，Stokes提出將熒光作為一種分析方法1867年，Goppelsroder應用鋁－桑色素絡合物的熒光測定了鋁1924年，Wawwilous進行了熒光量子產率的測定1926年，Gavila對熒光壽命進行了測定4熒光分析法的特點靈敏度高

檢出限通常比分光光度法低2-4個數量級選擇性好

包括激發(fā)和發(fā)射兩個過程，通過前后兩次波長的選擇，可得到更高的選擇性方法簡便快速，試樣用量少對環(huán)境因素比較敏感，能產生強熒光的化合物相對較少，使其應用受到一定限制5二、基本原理6（一）熒光與磷光的產生過程1.分子能級與躍遷分子能級比原子能級復雜；在每個電子能級上，都存在振動、轉動能級；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

；2.電子激發(fā)態(tài)73.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑8

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內轉化外轉移系間躥越振動弛豫無輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強度相對大熒光：10-9～10-6

s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)磷光：10-4～100

s,第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)9S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間躥越內轉化振動弛豫能量l2l1l

3

外轉移l

2T2內轉化振動弛豫10S0S2S1T1吸光

1吸光

2熒光

3熒光熒光發(fā)射

處于第一激發(fā)單重態(tài)中的電子躍回至基態(tài)各振動能級時，將得到最大波長為λ3的熒光。λ3的波長較激發(fā)波長λ1或λ2都長，而且不論電子開始被激發(fā)至什么高能級，最終將只發(fā)射出波長λ3為的熒光。熒光的產生在10-9-10-6s內完成。

輻射能量傳遞過程11S0S2S1T1吸光

1吸光

2熒光

3磷光磷光磷光發(fā)射電子由基態(tài)單重態(tài)激發(fā)至第一激發(fā)三重態(tài)的幾率很小，因為這是禁阻躍遷。但是，由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級，有可能以系間竄躍方式轉至第一激發(fā)三重態(tài)，再經過振動馳豫，轉至其最低振動能級，由此激發(fā)態(tài)躍回至基態(tài)時，便發(fā)射磷光，這個躍遷過程（T1→S0）也是自旋禁阻的，其發(fā)光速率較慢，約為10-4-100s。因此，這種躍遷所發(fā)射的光，在光照停止后，仍可持續(xù)一段時間。非輻射能量傳遞過程12振動弛豫內轉化外轉移系間躥越13S0S2S1T1吸光

1吸光

2振動弛豫在同一電子能級中，電子由高振動能級轉至低振動能級，而將多余的能量以熱

的形式發(fā)出。發(fā)生振動弛豫的時間為10-14-10-12s。14S0S2S1T1吸光

1吸光

2內轉化當兩個相同多重態(tài)的電子能級非?？拷灾疗湔駝幽芗売兄丿B時，常發(fā)生電子由高能級以無輻射躍遷方式轉移至低能級。處于高激發(fā)單重態(tài)的電子，通過內轉移及振動弛豫，均躍回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。S0S2S1T1吸光

1吸光

215外轉移外轉移激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質分子的相互作用及能量轉移，使熒光或磷光強度減弱甚至消失。這一現象稱為“熄滅”或“猝滅”。16S0S2S1T1吸光

1吸光

2熒光

3系間躥越系間躥越

指不同多重態(tài)間的無輻射躍遷，例如S1→T1就是一種系間躥越。通常，發(fā)生系間躥越時，電子由S1的較低振動能級轉移至T1的較高振動能級處。有時，通過熱激發(fā)，有可能發(fā)生T1→S1，然后由S1發(fā)生熒光。這是產生延遲熒光的機理。

（二）熒光效率及其影響因素（1）熒光效率熒光效率用來描述激發(fā)態(tài)分子發(fā)生輻射躍遷返回基態(tài)的概率的大小，定義為發(fā)熒光的分子數目與激發(fā)態(tài)分子總數的比值。熒光效率(φf)＝發(fā)熒光的分子數／激發(fā)態(tài)分子總數φf越高，輻射躍遷的概率越大，發(fā)射的熒光越強具有分析應用價值的熒光化合物，φf應在0.1-1之間17（2）熒光與分子結構的關系物質必須能夠吸收紫外-可見光，即分子中必須含有共軛雙鍵這樣的強吸收基團，共軛體系越大，π電子的離域性越強，越易被激發(fā)而產生熒光。共軛芳環(huán)增大，熒光效率提高，熒光峰向長波方向移動。 萘φf＝0.29,λem=310nm

蒽φf＝0.46,λem=400nm18b.分子的剛性平面結構有利于熒光的產生

熒光黃，φf接近1酚酞，沒有熒光剛性平面結構可以減少分子振動和碰撞去活的可能性。有機配位劑與金屬離子形成螯合物后熒光強度增大，也是由于形成了共平面的配合物的原因。19c.取代基的影響給電子基團(-OH,-NH2,-NR2,-OR)使共軛體系增大，導致熒光增強。反之，吸電子基團(-COOH,-NO,-NO2)使熒光減弱?！爸卦有?--隨著鹵素取代基原子序數的增加，物質的熒光減弱，磷光增強的現象。分子中由于重原子的存在導致容易發(fā)生系間竄躍的效應，產生的原因是原子序數高的重原子的電子自旋和軌道間的相互作用變大，容易發(fā)生自旋偶合作用，使S1－T1的體系間竄躍顯著增加所致。20（3）環(huán)境因素對熒光的影響a.溶劑的影響電子激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性，溶劑的極性增強，對激發(fā)態(tài)會產生更大的穩(wěn)定作用，使熒光波長紅移，強度增大。b.溫度的影響輻射躍遷的速率不隨溫度而變，而非輻射躍遷的速率隨溫度升高而顯著增大。T增大，φf減小21c.pH值的影響含有酸性或堿性取代基的芳香族化合物的熒光性質受pH值的影響大，共軛酸堿的光譜有明顯差異，同時質子化會對π電子體系產生影響。d.表面活性劑的影響形成有序的膠束微環(huán)境，對激發(fā)單重態(tài)的分子起保護作用，減小非輻射躍遷的概率，提高熒光效率。22e.溶解氧的熒光熄滅作用氧分子具有順磁性（三重態(tài)），溶解氧的存在，使激發(fā)態(tài)單重態(tài)分子向三重態(tài)的體系間竄躍速率加大，因而會使熒光效率降低。另一種原因是處于基態(tài)的三重態(tài)能級的氧分子和激發(fā)單重態(tài)的熒光物質相碰撞，形成單重激發(fā)態(tài)的氧分子和三重態(tài)的物質分子，導致熒光熄滅。23（三）熒光強度與溶液濃度的關系熒光強度If正比于吸收的輻射強度Ia與熒光量子產率φf

。

If=φf

Ia根據Beer定律Ia=I0-It=I0(1-e-

lc)I0和It分別是入射光強度和透射光強度。代入上式得If=φf

I0(1-10-

lc)=

I0(1-e-2.3

lc)24經近似處理，整理得：If

=2.3

f

I0lc當入射光強度I0

和l一定時，上式為：If

=Kc即熒光強度與熒光物質的濃度成之正比，但這種線性關系只有在極稀的溶液中，當lc0.05時才成立。對于較濃溶液，由于猝滅現象和自吸收等原因，使熒光強度和濃度不呈線性關系。25熒光猝滅

熒光物質分子與溶劑分子或其它溶質分子的相互作用引起熒光強度降低的現象稱為熒光猝滅。能引起熒光強度降低的物質稱為熒光猝滅劑。導致熒光猝滅的主要類型：①碰撞猝滅碰撞猝滅是指處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子相碰撞，使激發(fā)單重態(tài)的熒光分子以無輻射躍遷的方式回到基態(tài)，產生猝滅作用。M+hv→M*(激發(fā))M*→M+hv’(發(fā)生熒光)M*+Q→M+Q+熱(熄滅)26②靜態(tài)猝滅由于部分熒光物質分子與猝滅劑分子生成非熒光的配合物而產生的。此過程往往還會引起溶液吸收光譜的改變。

③轉入三重態(tài)的猝滅分子由于系間的跨越躍遷，由單重態(tài)躍遷到三重態(tài)。轉入三重態(tài)的分子在常溫下不發(fā)光，它們在與其它分子的碰撞中消耗能量而使熒光猝滅。溶液中的溶解氧對有機化合物的熒光產生猝滅效應是由于三重態(tài)基態(tài)的氧分子和單重激發(fā)態(tài)的熒光物質分子碰撞，形成了單重激發(fā)態(tài)的氧分子和三重態(tài)的熒光物質分子，使熒光猝滅。27④發(fā)生電子轉移反應的猝滅

某些猝滅劑分子與熒光物質分子相互作用時，發(fā)生了電子轉移反應，因而引起熒光猝滅。⑤熒光物質的自猝滅

在濃度較高的熒光物質溶液中，單重激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和未激發(fā)的熒光物質分子碰撞而引起的自猝滅。有些熒光物質分子在溶液濃度較高時會形成二聚體或多聚體，使它們的吸收光譜發(fā)生變化，也引起溶液熒光強度的降低或消失。28（四）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜繪制激發(fā)光譜曲線時，固定測量波長為熒光（或磷光）最大發(fā)射波長，然后改變激發(fā)波長，根據所測得的熒光（磷光）強度與激發(fā)光波長的關系，即可得到激發(fā)光譜曲線。熒光強度最大時的波長即為激發(fā)波長λex。熒光物質的激發(fā)光譜曲線與其紫外吸收曲線可能相同，但激發(fā)光譜曲線是熒光強度與波長的關系曲線，吸收曲線則是吸光度與波長的關系曲線，兩者在性質上是不同的。29如果固定激發(fā)光波長為其最大激發(fā)波長，然后測定不同的波長時所發(fā)射的熒光或磷光強度，即可得到熒光或磷光發(fā)射光譜曲線。熒光強度最大時的波長即為發(fā)射波長λem30激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關系a）波長比較與激發(fā)（或吸收）波長相比，熒光發(fā)射波長更長，即產生所謂Stokes位移。（振動弛豫失活所致）b）形狀比較熒光光譜形狀與激發(fā)波長無關。盡管分子受激到可到達不同能級的激發(fā)態(tài)，但由于去活化（內轉換和振動弛豫）到第一電子激發(fā)態(tài)的速率或幾率很大，好像是分子受激只到達第一激發(fā)態(tài)一樣。換句話說，不管激發(fā)波長如何，電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能層躍遷到基態(tài)的各個振動能層。31c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。3233三、熒光儀器第一單色器或濾光片記錄儀第二單色器或濾光片熒光光源激發(fā)樣品池為了消除入射光和散射光的影響，熒光的測量通常在與激發(fā)光成直角的方向上進行。為消除可能共存的其它光線的干擾，如由激發(fā)所產生的反射光、Raman光以及為將溶液中雜質濾去，以獲得所需的熒光，在樣品池和檢測器之間設置了第二單色器。熒光作用于檢測器上，得到響應的電信號。341）光源：強度大、適用波長范圍寬；常用光源有氙燈、高壓汞燈2）樣品池：低熒光的材料；常用石英，形狀以方形和長方形為宜3）單色器：

濾光片、分光器4）檢測器：光電管、光電倍增管35熒光分析的特點

靈敏度高：視不同物質，檢測下限在0.1~0.001g/mL之間。

選擇性好：可同時用激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜定性。

結構信息量多：包括物質激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、光強、熒光量子效率、熒光壽命等。

應用不廣泛：主要是因為能發(fā)熒光的物質不具普遍性、增強熒光的方法有限、外界環(huán)境對熒光量子效率影響大、干擾測量的因素較多。36四、熒光分析法的應用

1、無機分析無機化合物的熒光分析法有三類：（1）直接法：利用金屬離子或非金屬離子與有機熒光試劑形成能發(fā)出熒光的絡合物，在紫外光的輻射下測量絡合物所發(fā)射的熒光強度進行定量用此法測定的元素已有七十多種。（2）熒光猝滅法：有些無機離子不能形成熒光絡合物，但它可以從金屬-有機試劑熒光絡合物中奪取金屬離子或有機試劑，形成更穩(wěn)定的絡合物或難溶化合物，使熒光強度降低。（3）催化熒光法：無機離子形成熒光絡合物的速度很慢或產生的熒光微弱，在微量金屬離子催化作用下反應迅速進行，可由在給定時間內測定的熒光強度增強程度來測定該金屬離子的濃度；相反，某些微量金屬離子可阻止熒光物質的生成或促使熒光物質轉化為非熒光物質，根據熒光熄滅效應測量在給定時間內熒光強度的降低程度測定該金屬離子的濃度。２、有機分析（１）脂肪族化合物（２）芳香族化合物（３）在生物化學、生理醫(yī)學和臨床、藥物分析中有廣泛應用3738熒光試劑：絕大多數為芳香族化合物，含兩個以上官能團，與金屬離子形成五元或六元環(huán)螯合物，使分子剛性平面結構增大。熒光試劑應滿足以下要求：(1)與分析物質快速定量反應(2)形成穩(wěn)定的強熒光物質(3)試劑本身無熒光或與產物的熒光光譜能分開(4)生成的熒光絡合物的激發(fā)和發(fā)射光譜不存在明顯重疊。§5.2磷光分析法分子磷光與分子熒光光譜的主要差別是磷光是第一激發(fā)單重態(tài)的最低能層，經系間跨越躍遷到第一激發(fā)三重態(tài)，并經振動弛豫至最低振動能層，然后躍遷回到基態(tài)發(fā)生的。39S0S2S1T1吸光

1吸光

2熒光

3磷光與熒光相比，磷光具有如下三個特點：(1)磷光輻射的波長比熒光長分子的T1態(tài)能量比S1態(tài)低(2)磷光的壽命比熒光長由于熒光是S1

S0躍遷產生的，這種躍遷是自旋許可的躍遷，因而S1態(tài)的輻射壽命通常在10-9~10-6s，磷光是T1

S0躍遷產生的，這種躍遷屬自旋禁阻的躍遷，其速率常數要小，因而輻射壽命要長，大約為10-4~100s(3)磷光的壽命和輻射強度對于重原子和順磁性離子敏感40磷光很容易受其它輻射或無輻射躍遷的干擾而使其強度減弱，甚至完全消失。因此，為了獲得較強的磷光，宜采取下列措施：1.增加試樣的剛性這種方法可減小質點間的碰撞幾率，以減小無輻射躍遷。低溫磷光就是基于這一原理建立起來的。通常，將被分析試樣的乙醚或異戊醇溶液置于液氮中，讓其冷凍至玻璃狀后，即可進行磷光測定。412.固體磷光法此法基于測量室溫下吸附于固體基質上的有機化合物所發(fā)射的磷光。所用的載體種類較多，有纖維素載體（如濾紙、玻璃纖維）、無機載體（如硅膠、氧化鋁）以及有機載體（如乙酸鈉、聚合物、纖維素膜）等。理想的載體是既能將分析物質牢固地束縛在表面或基質中以增加其剛性，并能減小三重態(tài)的碰撞猝滅等非輻射去活化過程，而本身又不產生磷光背景。3.分子締合物的形成在試液中，表面活性劑與被測物質形成膠束締合物后，可增強其剛性，減小因碰撞而引起的能量損失。4.重原子效應在含有重原子的溶劑如碘乙烷和溴乙烷中，有利于系間躥躍這種方式，因而有利于S1→T1躍遷，使磷光得到增強。磷光分析儀

磷光分析儀由光源、激發(fā)光單色器、液槽、發(fā)射光單色器、檢測器等組成。它與熒光計的主要區(qū)別在于：液槽為了能在低溫下測定磷光，盛試樣溶液的石英液槽需要放置在盛液氮的石英杜瓦瓶內。磷光鏡由于發(fā)生磷光的物質常伴隨有熒光產生，為了區(qū)別熒光和磷光，常采用一種叫磷光鏡的機械切光裝置，利用熒光和磷光壽命的差異消除熒光干擾。44磷光分析法的應用磷光分析法與熒光分析法相互補充，在藥物分析、臨床分析及環(huán)境分析中得到了一定的應用。主要用于測定有機化合物，如石油產品、多環(huán)芳烴、農藥、藥物等方面。45§5.3化學發(fā)光分析某些物質在進行化學反應時，由于吸收了反應時產生的化學能，而使反應產物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，便發(fā)出一定波長的光。這種吸收化學能使分子發(fā)光的過程稱為化學發(fā)光?；瘜W發(fā)光是由高能量、不放熱、不做電功或其它功的化學反應所釋放的能量激發(fā)體系中某種化學物質分子而產生的次級光發(fā)射?；瘜W發(fā)光發(fā)生于生物體系則被稱為生物發(fā)光。利用化學發(fā)光現象而建立起來的分析方法即為化學發(fā)光分析。46化學發(fā)光分析的特點：1、靈敏度高2、測定的線性范圍寬：5－6個數量級3、儀器設備簡單沒有激發(fā)光源，因而無雜散光和背景干擾檢測發(fā)光總量，因而不需要單色器4、分析速度快局限性：1、可供發(fā)光用的試劑有限2、發(fā)光機理有待進一步研究47一、基本原理1、化學發(fā)光反應的基本條件A＋B→C*

＋DC*→C＋hν能夠產生化學發(fā)光的反應必須具備下述條件：（1）能快速地釋放出足夠的能量在可見光區(qū)能觀察到化學發(fā)光，需要170~300kJ/mol的激發(fā)能（2）反應途徑有利于激發(fā)態(tài)產物的生成（3）激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)，或能夠將其能量轉移給可以產生輻射躍遷的其它分子482、化學發(fā)光效率和發(fā)光強度化學發(fā)光效率φCL定義為：φCL=發(fā)射的光子數／參加反應的分子數=φr?φfφr－激發(fā)態(tài)分子的化學效率；φf－激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率φr=激發(fā)態(tài)分子數／參加反應的分子數φf=發(fā)射