基因探針分子雜交技術(shù)課件

基因探針

——分子雜交技術(shù)Molecularprobetechniques1目錄簡介基本原理分類歷史及發(fā)展主要應(yīng)用xx操作步驟Southern雜交Northern雜交Western雜交2xx基因探針基因探針，即核酸探針，是一段帶有檢測標(biāo)記，且序列已知的，與目的基因互補(bǔ)的核酸序列(DNA或RNA)。FISH3xx基因探針分析的基本原理兩條不同來源的核酸單鏈如果在一定區(qū)段具有互補(bǔ)的堿基序列,或者說具有一定的同源性,就可以特異性結(jié)合,形成雙鏈雜種分子,這種結(jié)合稱為核酸分子雜交。如果用已知核酸(通常是DNA)片段作為探針,通過與未知核酸(DNA或RNA)樣品進(jìn)行雜交試驗(yàn),根據(jù)兩者雜交狀況的分析,就可以確定它們同源性程度,檢測特定核苷酸序列在樣品中的存在及含量。這便是核酸探針分析的基本原理。4xx分子雜交技術(shù)的分類根據(jù)其檢測對象不同，可分為檢測對象探針Southern雜交DNA核酸Northern雜交RNA核酸Western雜交蛋白質(zhì)抗體根據(jù)探針來源的不同，可分為來源基因組探針（genomicprobe）基因組cDNA

探針（cDNAprobe）mRNA寡核苷酸探針（Oligonucleotides

Probe）人工合成5xx基本操作程序印跡（blotting）將樣品在凝膠上分離，然后將樣品通過“影印”的方式轉(zhuǎn)移到固相支持物上（如濾膜）。雜交將已印跡有樣品的濾膜與帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交。結(jié)果檢測通過放射自顯影或顯色反應(yīng)，判斷樣品中是否有與探針同源的分子。6xxSouthern雜交檢測樣品DNA的處理電泳分離及變性處理轉(zhuǎn)移并固定到濾膜上探針的制備及雜交檢測與分析7xx檢測樣品DNA的處理提取檢測樣品的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶對其進(jìn)行酶切，至大小不同的DNA片段8xx電泳分離及變性處理瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段變性處理通常DNA變性的方法：熱變性、酸堿變性、化學(xué)試劑變性在0.4M

NaOH堿性條件下變性凝膠0.4MNaOH9xx轉(zhuǎn)移并固定到濾膜上通過毛細(xì)管虹吸法，將凝膠上的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上。最后通過紫外線照射將DNA固定在濾膜上。10xx轉(zhuǎn)移的方法毛細(xì)管虹吸法、電轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法11xx探針的制備一、探針的合成 PCR、化學(xué)合成等方法二、探針的標(biāo)記 同位素：3H、35S、32P等 非同位素：地高辛、生物素、熒光素等12地高辛：可以與dCTP連接成地高辛-dCTP

原理：

地高辛+

抗地高辛抗體（帶有熒光素或酶的標(biāo)記）1314xx雜交預(yù)雜交：將結(jié)合了DNA分子的濾膜先與特定的預(yù)雜液進(jìn)行預(yù)雜交，也就是將濾膜的空白處用魚精DNA或牛奶蛋白封閉起來，防止在雜交過程中濾膜本身對探針的吸附。雜交：在一定的溫度和溶液條件下，將標(biāo)記的探針與濾膜混合，如果濾膜上的DNA分子存在與探針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸在濾膜上。15xx

洗膜：經(jīng)過一定的洗滌程序?qū)⒂坞x的探針分子除去。精確控制雜交及洗滌條件（如溫度及鹽濃度），在同源序列中即使有一對堿基錯(cuò)配也可檢出。這技術(shù)已應(yīng)用于遺傳病（基因?。┑呐R床診斷。安裝雜交管雜交爐16xx檢測與分析1、放射自顯影：適用于放射性同位素標(biāo)記的探針2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非同位素標(biāo)記的探針通過放射自顯影或生化檢測，就可判斷濾膜上是否存在與探針同源的DNA分子及其分子量。

17xxNorthern雜交1、檢測對象為RNA。2、與Southern雜交不同的是：1）不需要限制性核酸酶切；2）變性方法不是堿變性，而是采用化學(xué)試劑變性法。3、主要用于檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平，或比較不同組織或細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。18xxWestern雜交1、基本原理和基本過程與Southern雜交基本相同2、檢測對象為蛋白質(zhì)（或酶）3、SDS電泳分離4、用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。19歷史及發(fā)展1969年，Gall和Pardue（YaleUniversity）等首次將同位素探針用于原位雜交實(shí)驗(yàn)，獲得成功。1987年，染色體原位抑制雜交法的創(chuàng)建，使FISH技術(shù)得以迅速發(fā)展。隨后，Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰熒光素等非放射性物質(zhì)標(biāo)記探針，創(chuàng)立了雙色FISH技術(shù)。1990年，Nederlof

等用3種熒光素成功探測出了3種以上的靶位DNA序列，從而宣告了多色FISH技術(shù)的問世。Southern印跡雜交（Southernblot）是1975年由英國愛丁堡大學(xué)的E.M.Southern創(chuàng)建，是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者一般認(rèn)為是美國斯坦福大學(xué)的喬治·斯塔克（GeorgeStark）。在尼爾·伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的《分析生物化學(xué)》（AnalyticalBiochemistry）中首次被稱為WesternBlot。發(fā)展：基因芯片技術(shù)、生物傳感器等。xx20xx分子雜交技術(shù)的主要應(yīng)用

1.基因工程和分子生物學(xué)研究

2.檢測病原微生物及寄生蟲3.普查和診斷遺傳性疾病

4.法醫(yī)物證學(xué)

21xx基因工程和分子生物學(xué)研究作為生物技術(shù)核心的基因工程(重組DNA技術(shù))是

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0年代興起的、按人們意愿定向改造生物遺傳性狀的技術(shù)。 其主要步驟是取得目的DNA,與載體DNA體外重組,將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞,篩選能夠表達(dá)重組DNA的細(xì)胞加以傳代擴(kuò)增。這中間篩選步驟,就可以用DNA探針進(jìn)行菌落或噬菌體原位雜交來完成。22xx基因工程和分子生物學(xué)研究分子生物學(xué)研究中凡涉及核酸的定位、定量及序列分析等方面的工作,諸如染色體基因定位,基因突變及不同種屬間基因變異的研究,細(xì)胞

中DNA的轉(zhuǎn)錄過程的研究,以及探討病毒、腫瘤基因和細(xì)胞癌變之間可能存在的關(guān)系等,都需要應(yīng)用分子探針技術(shù)。23xx檢測病原微生物及寄生蟲對于人體或環(huán)境中存在的細(xì)菌、病毒微生物,現(xiàn)行檢測方法既費(fèi)時(shí)又不夠準(zhǔn)確。如果用特異的DNA探針檢測微生物包含的核酸片段,不但靈敏快速,而且特異性強(qiáng),甚至可以分析同種異株間的區(qū)別。DNA探針推廣至微生物檢驗(yàn)上,對于診斷傳染病、開展流行病學(xué)研究將有重要意義。24xx檢測病原微生物及寄生蟲 乙型肝炎是危害我國人民健康的大敵,現(xiàn)在已開發(fā)DNA探針法檢測乙肝病毒DNA的技術(shù),比現(xiàn)行的免疫學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果更靈敏可靠,是普查乙肝傳染的強(qiáng)有力手段,該技術(shù)正在國內(nèi)普及推廣。 此外,DNA探針還可以應(yīng)用于對利什曼原蟲病、瘧原蟲病等寄生蟲感染疾病的診斷。

25xx普查和診斷遺傳性疾病 人類和動物的遺傳性疾病是由于基因DNA的缺陷經(jīng)遺傳引起的。目前已知的三千多種遺傳性疾病中,只有很少一部分可以通過檢測基因的表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì)或酶)的改變予以診斷。用DNA探針可以在DNA水平分析基因結(jié)構(gòu)的缺陷,突破依靠基因的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行診斷的局限。26xx普查和診斷遺傳性疾病對于因?yàn)榛騼?nèi)點(diǎn)突變或基因部分缺失、重排或插入而引起的遺傳性疾病,可以用DNA探針進(jìn)行Southern印漬雜交直接加以分析診斷。對于那些尚不明其原發(fā)的基因缺陷的遺傳性疾病,則需要用DNA探針技術(shù)分析限制性片段長度多態(tài)性,以此作為遺傳標(biāo)志作出分析診斷。總之,DNA探針技術(shù)有助于開展產(chǎn)前診斷或遺傳咨詢、攜帶者普查,為防治遺傳性疾病開辟了新路。27xx法醫(yī)物證學(xué)人類染色體中存在許多分散的具有串聯(lián)重復(fù)單位的微小衛(wèi)星區(qū)。利用人體衛(wèi)星區(qū)DNA作探針檢測不同個(gè)體的衛(wèi)星區(qū),產(chǎn)生相應(yīng)的

DNA指紋圖譜