突變體的獲得方法課件

微生物突變體的獲得方法Homelabel來源：生物技術(shù)通報2010年第2期構(gòu)建微生物突變體的方法綜述張念章

逯忠新突變體什么是突變體？定義1：

一般指帶有已經(jīng)發(fā)生突變的基因的細胞、病毒或細菌，有時也指發(fā)生突變的基因。定義2：攜帶突變基因的細胞或個體。(mutant)Homelabel

物理方法基因工程化學(xué)方法Homelabelback物理方法1.紫外2.電離輻射3.離子注入4.微波5.其它Homelabelback紫外紫外線是誘發(fā)微生物突變的一種非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很強的紫外吸收能力，最大的吸收峰在260nm。

因此，波長在200-300nm的紫外光才有誘變作用。紫外線可引起生物體形成嘧啶(主要是胸腺嘧啶)二聚體、嘧啶水合物和引起DNA分子交聯(lián)。其中形成嘧啶二聚體的生物學(xué)效應(yīng)研究的比較清楚。由于二聚體的出現(xiàn)會減弱雙鏈間氫鍵的作用，引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形。同時又會妨礙雙鏈的解開，阻礙堿基正常的互補配對，影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致突變或死亡。

盡管不斷有新型的誘變技術(shù)產(chǎn)生，紫外誘變技術(shù)因其操作簡單，效果顯著，在很多領(lǐng)域仍然發(fā)揮重要作用。Homelabelback電離輻射是指一切能引起物質(zhì)產(chǎn)生電離作用的輻射總稱。生物學(xué)上常用γ射線進行輻射，此外還有Χ射線、β射線和快中子等。這些射線可直接將能量傳遞給生物分子，使細胞中有序排列的生物大分子處于激發(fā)和電離狀態(tài)。引起遺傳物質(zhì)的變化主要是堿基的氧化作用，糖苷鍵及DNA單鏈鍵或雙鏈鍵斷裂。伴隨著生物大分子化學(xué)鍵的斷裂，有機體內(nèi)產(chǎn)生大量的離子和自由基。這些自由基與細胞中的溶質(zhì)分子相互作用，誘發(fā)酶的釋放，導(dǎo)致代謝的方向性和協(xié)調(diào)性紊亂，促使開始的生物化學(xué)損傷進一步發(fā)展，引起了機體內(nèi)環(huán)境的進一步變化。電離輻射Homelabelback化學(xué)

誘變

方式1.烷化劑2.其它誘變劑及復(fù)合誘變Homelabel0.化學(xué)誘變back化學(xué)誘變劑是一類能和DNA起作用，進而改變DNA的空間結(jié)構(gòu)或者結(jié)構(gòu)組成，導(dǎo)致DNA產(chǎn)生變異的物質(zhì)。按其誘變機制可分為堿基類似物誘變劑、直接誘變DNA結(jié)構(gòu)的誘變劑和誘發(fā)移碼突變的誘變劑3類。利用化學(xué)誘變劑進行的化學(xué)誘變具有使用方便，特異性較強和誘變后代較易穩(wěn)定遺傳等特點。該方法已培育出許多具有生產(chǎn)利用價值的微生物新品種，給生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益.Homelabelback烷化劑又稱生物烷化劑，是一類能形成碳正離子或其它親電性基團的化合物。常用的烷化劑包括亞硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙醋(DMS)和硫酸二乙酯(DES)。其中Ems是目前公認的效果最好和應(yīng)用最廣的一種化學(xué)誘變劑。其誘變作用主要發(fā)生在鳥嘌呤N·7位置上，烷基取代H離子后，使之成為一個帶正電的季銨基團，從而發(fā)生兩種遺傳效應(yīng)：一是烷化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對，代替胞嘧啶，發(fā)生轉(zhuǎn)換突變(即G：C變?yōu)锳：T)；二是由于鳥嘌呤的N-7烷基活化，糖苷鍵斷裂造成脫嘌呤，鳥嘌呤的位置成了一個空位，復(fù)制時其互補位置上的堿基就不受嚴格的配對限制，4種堿基都有機會進入，從而造成置換現(xiàn)象。此外，EMS還可以造成糖．磷酸骨架斷裂，引起染色體缺失。與其它誘變劑相比，EMS誘變后產(chǎn)生的突變頻率高，且多為顯性突變體，易于突變體的篩選。烷化劑Homelabelback除了烷化劑外，平陽霉素(PYM)、秋水仙素、5-溴尿嘧啶(5-BU)、2-氨基嘌呤(AP)等也常用于誘變工作。其它誘變劑及復(fù)合誘變將兩種或多種誘變劑的聯(lián)合應(yīng)用于突變育種工作中就形成了復(fù)合誘變。該誘變過程包括：兩種或多種誘變劑的先后使用；兩種或多種誘變劑的同時使用；同一種誘變劑的交替重復(fù)作用等。普遍認為，如果將兩種或兩種以上誘變劑合理搭配使用，誘變劑間的協(xié)同效應(yīng)會產(chǎn)生較單一誘變更好的效果。

以一株綠色木霉F1為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線、亞硝基胍、硫酸二乙酯三種因素依次處理，以每一輪誘變處理篩選到的酶活最高的突變株作為下一輪誘變的出發(fā)菌株。Homelabelback基因工程方法:1.DNA標簽法2.基于載體構(gòu)建的突變體3.基因打靶技術(shù)4.RNA干擾技術(shù)Homelabelback當(dāng)一段特定的DNA序列插入到基因組目的因的內(nèi)部或其附近位點時，便會誘發(fā)該基因發(fā)生突變，形成突變體。

根據(jù)這一作用原理，用已知的插入DNA分子做探針，發(fā)展出來一種分離未知基因的方法。由于插入的DNA序列，相當(dāng)于人為的給目的基因加上一段已知的序列標簽，因此稱DNA插入突變分離基因的技術(shù)為DNA標簽法，亦叫基因標簽法。

它包括T—DNA標簽法和轉(zhuǎn)位子標簽法兩大類。其中轉(zhuǎn)位子標簽法又可分為同源轉(zhuǎn)位子標簽法和異源轉(zhuǎn)位標簽法基因標簽法Homelabelback常用的構(gòu)建突變體的載體包括質(zhì)粒載體、噬菌體載體以及二者部分結(jié)構(gòu)組合成的噬菌粒載體。細菌質(zhì)粒是存在于細胞質(zhì)中的一類獨立于染色體的自主復(fù)制的遺傳成份，可以持續(xù)穩(wěn)定的處于染色體外的游離狀態(tài)。人們利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)移技術(shù)打破物種界限，賦予生物新的遺傳性狀，使外源基因在受體細胞內(nèi)按照人們期望的方式進行表達，并進行基因功能分析等研究。與質(zhì)粒相似，噬菌體也可作為外源基因表達的載體。最常用的噬茵體載體是入噬菌體載體。

根據(jù)使該載體失活的方法，又可以分為插人型載體和替換型載體。利用入噬菌體實現(xiàn)基因克隆和表達的有DNA連接酶、DNA聚合酶I等。由部分質(zhì)粒載體和部分單鏈噬菌粒載體組合而成的具有雙功能的新型大腸桿菌克隆載體系列，就形成了噬菌粒載體。它有兩個復(fù)制起點，其一來自ColEl，其二來自單鏈噬菌體。此載體具有分子量小、克隆能力大、可遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點?；谳d體構(gòu)建微生物突變株，特別是用質(zhì)粒為載體，是目前在基因工程中應(yīng)用較多的構(gòu)建突變體的方法。基于載體構(gòu)建的突變體Homelabelback20世紀80年代后期發(fā)展的基因打靶技術(shù)，通過在轉(zhuǎn)染細胞中發(fā)生外源打靶基因與核基因組目標基因之間的DNA同源重組，真正實現(xiàn)了外源基因定點整合到基因組特定位置上的目的，從而可以有針對性的改變細胞的遺傳特性?；虼虬械姆肿踊A(chǔ)是兩條具有相同或類似核苷酸序列的同源DNA分子之間發(fā)生的遺傳信息的重組事件。因此，基因打靶需要首先將要整合到受體細胞核基因組目標座位的外源打靶基因，以及位于打靶基因兩側(cè)與內(nèi)源目標基因同源的DNA片段，克隆在具有選擇性標記基因的載體(如自殺性質(zhì)粒載體)上，構(gòu)成專用的基因打靶載體。之后再將其轉(zhuǎn)化進感受態(tài)的受體細胞。由于外源打靶基因的兩側(cè)與內(nèi)源核基因組上的目標基因或座位之間存在著同源的DNA序列，兩條DNA鏈的相同部分便會相繼發(fā)生單鏈斷裂、鏈的交換、磷酸二酯鍵的形成和缺口重新封閉等一系列變化，并最終完成同源重組，實現(xiàn)外源基因在核基因組DNA上的定點組合?；虼虬械男嗜Q于DNA同源重組的頻率，這與兩條重組DNA分子之間的同源序列的長度密切相關(guān)?，F(xiàn)在，該技術(shù)在檢測基因功能、治療遺傳疾病等方面有著研究與應(yīng)用。

基因打靶技術(shù)Homelabelback20世紀90年代發(fā)現(xiàn)的RNA干擾(簡稱RNAi)現(xiàn)象也可以高效而特意的阻斷體內(nèi)相應(yīng)基因的活性，發(fā)揮基因剔除的作用。

RNAi引起基因沉默的大致過程是外源性的dsRNA在Dicer酶的切割下形成21—25bp的siRNA。該siRNA便會同RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)結(jié)合，并將其激活。激活狀態(tài)的RISC催化ds-siRNA發(fā)生解旋和解鏈。其中的反義鏈會附著在RISC表面與mRNA配對，形成新的siRNA，再循環(huán)作用于另外靶的向mRNA。另一條鏈會被釋放分解。這種不斷放大的瀑布式作用形成大量新的siRNA，使siRNA在短時間內(nèi)迅速有效的抑制