基因工程的基本操作程序新

1.2基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定1、目的基因：主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結構基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。2、獲取方法：（1）從基因文庫中獲取目的基因；（2）利用PCR技術擴增目的基因；（3）用化學方法人工合成目的基因。一、目的基因的獲取基因文庫genelibrary基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)注意：是通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因，而不是直接保存基因基因組文庫:

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.（比較大）部分基因文庫:

基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.（比較?。┤纾琧DNA文庫。構建基因文庫的目的：為了在不知道目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。基因文庫：思考：基因文庫如何構建？

將某種生物體內(nèi)的DNA全部提取出來，選用適當?shù)南拗泼富驒C械力量將DNA切成一定范圍大小的DNA片段，然后，將這些DNA片段與合適的載體在體外重組后，導入受體菌的群體中儲存，每個受體菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是說，這個群體包含了這種生物的所有基因，這樣就構建成了生物的基因組文庫。（1）基因組文庫的構建提取某生物全部DNA用適當限制酶切割許多DNA片段與載體連接導入受體菌群該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）（常用于原核生物）基因組文庫與部分基因文庫的比較(1)原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄(1)原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子RNA聚合酶:能夠識別啟動子（調(diào)控序列）上結合位點，并與其結合的一種蛋白質(zhì)（酶）。

轉錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。

轉錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。①不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結構②有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列。其中包括啟動子和終止子等多種非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子(2)真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：真核細胞基因的編碼區(qū)一般是斷裂的（斷裂基因）：真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的啟動子、下游的終止子等(3)原核細胞與真核細胞的基因結構比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼基因組文庫與cDNA文庫的比較依據(jù)：目的基因的有關信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉錄產(chǎn)物mRNA、

基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?例：根據(jù)基因的部分核苷酸序列找到目的基因第一步，通過PCR方法將目的基因已知的部分核苷酸序列擴增出來，進行放射性同位素標記(制成探針)。第二步，將基因文庫中的所有菌落轉移至硝酸纖維膜上。然后，通過處理溶解消化掉細菌中的蛋白質(zhì)，并使DNA固定在膜上。第三步，按DNA雜交的方法進行雜交。第四步，在X光底片上出現(xiàn)黑斑的菌落，這表明這個菌落中含有所需要的目的基因。第五步，把該菌落挑選出來，從該菌落中再提取目的基因。2、利用PCR技術擴增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術。③前提條件：_______________________；反應體系：___________、___________、__________________、________________。②原理：____________________。④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結果：聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段DNA復制和DNA熱變性四種脫氧核苷酸DNA引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增模板DNA要有一段已知目的基因的核苷酸序列

過程：變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位配對并結合延伸：加熱至70～75℃以目的基因為模板，在DNA聚合酶催化下，從引物開始延伸，合成互補的新DNA鏈變性退火延伸Taq

DNA聚合酶(thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020美國黃石公園的熱泉當然，除了Taq，現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)了其他多種多樣的耐高溫的DNA多聚酶PCR的基本反應步驟變性90-95?C延伸70-75?C退火55-60?C整個過程可以在PCR儀中自動完成循環(huán)30輪左右PCR管PCR技術擴增與DNA復制的比較堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、酶、DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復制細胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子能量、引物（3)人工合成DNA測序；根據(jù)已知的氨基酸序列推測DNA序列；

蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成DNA合成儀(一般用于目的基因比較小，且序列又已知)思考：人工合成的目的基因和真正的基因之間的序列是否是完全一致的？二、基因表達載體的構建

——基因工程的核心1、目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。基因表達載體需要哪些結構呢？實際上就是目的基因和運載體結合的過程2、基因表達載體的組成：復制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因它們各自的作用是什么?啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄標記基因：鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細胞篩選出來①載體與表達載體的區(qū)別：表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構（在限制酶切割位點上插入）。②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體、目的基因，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵。③啟動子、終止子對于目的基因的表達必不可少。④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去?；虮磉_載體的構建過程：載體目的基因、啟動子、終止子等元件限制酶切割DNA連接酶連接基因表達載體科學家在培育抗蟲棉時，經(jīng)歷了多次失敗，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)后，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)后，導入棉花受精卵，結果長成的植株，有了抗蟲能力。資料:思考：（P15）作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？

不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制/調(diào)控元件，如啟動子、終止子和標記基因等。常用的受體細胞：微生物細胞：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌等；動物細胞；植物細胞；三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1、將目的基因?qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉化法特點:能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉移至受體細胞并整合到其染色體上轉化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構建表達載體導入植物細胞插入植物細胞染色DNA表達新性狀轉入農(nóng)桿菌植物組織培養(yǎng)（2）基因槍法

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與受體細胞基因組整合并表達的方法。適用于單子葉植物（3）花粉通道法

植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因的基因表達載體），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。適用于被子植物2、將目的基因?qū)雱游锛毎椒?顯微注射技術操作程序:提純含目的基因表達載體動物的受精卵顯微注射移植到代孕母體的子宮胚胎發(fā)育新性狀動物胚胎早期培養(yǎng)轉入生長素基因思考：為什么要用受精卵而不用體細胞？這與導入植物細胞有什么不同，為什么？新性狀動物3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎Ｓ梅ǎ篊a2+處理法/CaCl2法/感受態(tài)細胞法常用菌：大腸桿菌微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA思考：為什么要用Ca2+處理受體細胞？用Ca2＋處理，增加細菌細胞壁的通透性四、目的基因的檢測與鑒定檢測:是否插入目的基因是否轉錄是否翻譯鑒定:分子水平鑒定個體生物學水平鑒定1、檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因①首先取出轉基因生物的基因組DNA；（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:②將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針；③使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入轉基因生物的DNA中。（一）檢測基因探針：是一段帶有檢測標記（放射性或者熒光標記），且序列已知的，與目的基因互補的核酸序列?；蛱结樛ㄟ^分子雜交與目的基因結合，產(chǎn)生雜交信號，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來。DNA分子雜交示意圖采用一定的技術手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。2、檢測目的基因是否轉錄出了mRNA①方法:分子雜交（DNA和RNA之間）②過程:用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA。提取蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒蛋白的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法:抗原-抗體雜交若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。怎樣檢驗抗蟲基因在棉細胞內(nèi)是否表達呢？沒有抗蟲基因的棉植株有抗蟲基因的棉植株棉鈴蟲蟲沒有死蟲被殺死沒有表達目的基因表達（二）鑒定（個體生物學水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等1.有關基因工程的敘述中，錯誤的是（）A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得C、目的基因須由運載體導入受體細胞D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A隨堂練習2.有關基因工程的敘述正確的是（）A、限制酶只在獲得目的基因時才用B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成C、質(zhì)粒都可作為運載體D、蛋白質(zhì)的結構可為合成目的基因提