第四章 海洋動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)儀器設(shè)備的 清洗和消毒

第四章細(xì)胞培養(yǎng)用品的清洗、消毒一、細(xì)胞培養(yǎng)的要求1、消毒細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)時(shí)發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染。污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液的消毒不合格或不徹底等等。消毒方法分類物理滅菌法（紫外線、濕熱、干熱、過濾等）化學(xué)滅菌法（化學(xué)消毒劑、抗生素）

干熱法

殺菌機(jī)制：使菌體脫水干燥、大分子變性。

80－100℃1h可殺死繁殖體，160－170℃2h可殺死芽胞。常用方法有焚燒、干烤等。熱力滅菌法

a、紫外線消毒用于空氣、操作臺(tái)表面和不能用其他方法進(jìn)行消毒的培養(yǎng)器皿紫外線的殺菌波長范圍為240—280nm，265~266nm的作用最強(qiáng)。其主要是使DNA上相鄰的嘧啶通過共價(jià)鍵結(jié)合形成二聚體，影響DNA的正常堿基配對。紫外線的穿透力很弱，其殺菌只限于表面的照射。MechanismofUltravioletRadiation

thymine-thyminedimmers

b、濕熱消毒高壓蒸汽消毒，使用最廣泛、效果最好的消毒方法。橡膠制品、玻璃器皿、金屬器械。濕熱法

殺菌機(jī)制：在水分子存在情況下更易于使菌體蛋白凝固，熱力穿透性更強(qiáng)。1、巴氏消毒法（pasteurization）

61.1-62.8℃30min；71.7℃15-30s。2、高壓蒸氣滅菌法（autoclaving）

121.3℃15-20min可殺滅包括芽胞在內(nèi)的所有微生物。3、煮沸法：100℃5min殺死細(xì)菌繁殖體。c、過濾除菌不能采用高壓消毒的方法進(jìn)行滅菌處理，如血清、培養(yǎng)液等Filtration濾過sterilize

solutionsthatmaybedamagedordenaturedbyhightemperaturesorchemicalagents(cellculturemedium,serum……)d、化學(xué)消毒法75%酒精主要用于操作者的皮膚、臺(tái)面及無菌室內(nèi)的壁面處理。1%新潔爾滅主要用于器械的浸泡化學(xué)消毒滅菌法根據(jù)作用機(jī)制不同，主要有以下幾類：

1.使菌體蛋白質(zhì)變性或凝固todenatureproteinsofbacterialcell

酚類---石碳酸、來蘇、洗必泰等。醇類---70%~75%乙醇?xì)⒕ψ顝?qiáng)。重金屬鹽類---紅汞等。烷化劑---甲醛等，殺菌力強(qiáng)，但毒性大，有致癌性。2.干擾細(xì)菌的酶系統(tǒng)和代謝

tointerfereenzymaticsystemandmetabolismofbacterium氧化劑---過氧化氫、高錳酸鉀等，與細(xì)菌的酶結(jié)合使之失去活性。過氧乙酸對細(xì)菌繁殖體和芽胞、真菌、病毒都有殺滅作用。3.損傷菌細(xì)胞膜

todamagecellmembraneofbacterium表面活性劑：新潔爾滅等增加菌細(xì)胞表面張力，并增加其通透性使細(xì)菌破裂?；瘜W(xué)消毒劑:碘伏等大多對人體組織有害，只能外用或環(huán)境消毒。e、抗生素滅菌用于培養(yǎng)用液或預(yù)防培養(yǎng)物污染。常用抗生素為青霉素及鏈霉素。f、電離輻射滅菌用Co60產(chǎn)生的射線照射48-72h用高能電子束照射。消毒方法的選擇實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的消毒培養(yǎng)器械的消毒培養(yǎng)用液體的消毒2、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備根據(jù)要求準(zhǔn)備好瓶管盤架、器械消毒盒等準(zhǔn)備器材數(shù)要大于實(shí)際使用數(shù)，瓶蓋數(shù)大于瓶數(shù)、將所需物品一并放入超凈臺(tái)內(nèi)。3、無菌室和操作臺(tái)消毒無菌室每周用過氧乙酸加紫外線消毒1-2次超凈臺(tái)常用酒精擦拭實(shí)驗(yàn)前無菌室及超凈臺(tái)紫外消毒。4、無菌操作要求（1）手指不能觸及器材使用端。（2）減少手與器材的接觸面積，學(xué)會(huì)手指操作。（3）一切操作，如打開或封閉瓶口、安裝吸管、注射器等，都要在火焰前方進(jìn)行，使用端用前要經(jīng)過火焰消毒。

4、無菌操作要求（4）瓶口要順風(fēng)斜放在支架上。試劑使用后應(yīng)立即封閉瓶口，若長時(shí)間敞口，會(huì)增加落菌的機(jī)會(huì)。（5）細(xì)胞培養(yǎng)各種用液要專管專用，并要勤換洗管，防止擴(kuò)大污染和交叉污染。

4、無菌操作要求（6）瓶口液滴不能再倒回瓶內(nèi)，要用于酒精棉球擦拭，瓶口要再經(jīng)火焰消毒。（7）操作者動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，盡量避免空氣流動(dòng)。

4、無菌操作要求（8）工作臺(tái)面上的用品要放置有序，布局合理，一般來講，酒精燈要放在當(dāng)中，右手使用的物品在右側(cè)，左手使用的物品在左側(cè)。

注意事項(xiàng)1、雙手2、避免燙傷細(xì)胞3、講話，咳嗽4、人員走動(dòng)5、培養(yǎng)用品的清洗玻璃器皿基本程序：浸泡，刷洗，浸酸，沖洗4個(gè)步驟。洗液的配制洗液的配制（1）根據(jù)具體情況，選擇大小適宜的耐酸器皿，加入一定量的去離子水。（2）按照比例，將重鉻酸鉀榮于去離子水中，為了充分溶解，邊加邊用玻璃棒攪拌。（3）溶解完全后，將濃硫酸緩慢加入溶液中。（4）洗液降到常溫后，既可用來清洗器皿5、培養(yǎng)用品的清洗玻璃器皿（1）、浸泡新買的玻璃器皿自來水初步洗刷，5%稀鹽酸浸泡過夜。使用后的立即進(jìn)入清水中，避免器皿內(nèi)蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上。浸泡是要將器皿完全進(jìn)入水中，無氣泡空隙5、培養(yǎng)用品的清洗玻璃器皿（2）、涮洗防止損壞器皿表面光潔度，選擇軟毛刷，但不能留死角。涮洗后要將洗滌劑沖凈，晾干。5、培養(yǎng)用品的清洗玻璃器皿（3）、清潔液浸泡洗液中泡24小時(shí)，注意玻璃器皿中不要留有氣泡5、培養(yǎng)用品的清洗玻璃器皿（4）、沖洗必須用流水沖洗，流水灌滿，倒掉，重復(fù)10次以上，直到清潔液全部被沖凈，不留任何殘跡。蒸餾水漂洗2-3次，三蒸水漂洗1次，烘干備用5、培養(yǎng)用品的清洗膠塞、蓋子等雜物塑料器皿6、包裝一般采用牛皮紙、硫酸紙、棉布等作為包裝材料對培養(yǎng)瓶、濾器、吸管等的瓶口部分作局部包裝密封。對比較小的培養(yǎng)皿、吸頭等可以全包裝注射器、金屬器械可直接放入鋁飯盒內(nèi)。瓶裝玻璃器皿的包扎與消毒1、依據(jù)要包扎的對象，剪取食以大小的包扎紙。2、將包扎紙蓋在瓶口上進(jìn)行包扎，3、滅菌，121℃，20min.4、備用管狀培養(yǎng)器皿的包扎與消毒1、用脫脂棉塞入上端管口，松緊適當(dāng)，防止移取液體時(shí)吸爾球造成污染。2、用一層牛皮紙螺旋狀包扎。3、包好的吸管、滴管統(tǒng)一裝到金屬吸管筒中，蓋好蓋子。4、滅菌。注意事項(xiàng)1、包裝時(shí)手指與器材接觸面積要小，手指不能觸及器材的使用端。2、封閉器材使用端，標(biāo)記器材手持端3、小包裝4、玻璃管道口（尖吸管、移液管手持段等）加棉花正壓濾器的安裝使用正壓濾器的安裝使用