葛根素對(duì)糖尿病小鼠降糖作用的研究

葛根素對(duì)糖尿病小鼠降糖作用的研究

近年來的研究表明，pi3k-akt信號(hào)通道是胰島素受體下游的重要信號(hào)通道。akt信號(hào)通道的變化與糖尿病的發(fā)展密切相關(guān)。位于AKT通路下游的糖原合成酶激酶-3β(glycogensynthasekinase-3β,GSK-3β)可抑制糖原合成及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn),促進(jìn)糖異生,抑制胰島素的分泌并阻礙胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。胰島素激活A(yù)KT后,使GSK-3β磷酸化失活,從而抑制糖異生,促進(jìn)糖原合中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志2014年8月第34卷第16期ChinHospPharmJ,Aug2014,Vol34,No.16成,實(shí)現(xiàn)降低血糖的作用。解耦聯(lián)蛋白2(uncouplingprotein2,UCP2)是線粒體內(nèi)膜上的一種質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在激活后可產(chǎn)生質(zhì)子滲漏。UCP2參與體內(nèi)能量代謝調(diào)控,與肥胖,糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。異黃酮類化合物葛根素(puerarin,Pue)是中藥葛根的主要有效成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,葛根素具有一定的降血糖作用,提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性,減輕胰島素抵抗,清除自由基等多重功效。葛根素的降糖作用雖已有較多報(bào)道,但大部分文獻(xiàn)都僅初步報(bào)道了其降糖的藥效作用,或基于其在心血管疾病的療效進(jìn)行糖尿病并發(fā)癥方面的研究,而其降糖作用機(jī)制尚不清楚?；谥兴幘哂姓w調(diào)節(jié)、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn),本研究分別從保護(hù)胰島β細(xì)胞和改善肝臟功能這兩個(gè)不同的方面綜合考察了葛根素可能的降糖作用機(jī)制。1材料表面1.1熒光定量pcrmehsNanodrop1000微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司);電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司);5430R冷凍離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司);AL2041/10萬天平(瑞士MettlerToledo公司);HH-60型數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司);血糖儀(羅氏活力型,德國(guó));ABI7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)AppliedBiosystems);熒光顯微鏡(奧林巴斯公司)。1.2試劑與實(shí)驗(yàn)方法胰島素放射免疫試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所,批號(hào)20130720);RIPA細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所,編號(hào)P0013C);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、檸檬酸、檸檬酸鈉(南京化學(xué)試劑有限公司);葡萄糖(美國(guó)Sigma公司,批號(hào)088K00393)、鏈脲佐菌素(STZ)[美國(guó)Sigma公司,批號(hào)SLBB7526V,純度(HPLC)98%];CYBRGreenPCRMasterMix熒光定量PCR試劑(美國(guó)ABI公司);所用抗體p-AKT、p-GSK-3β、β-actin及insulin購(gòu)自SantaCruz公司,抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德公司。1.3混懸液的配制葛根素購(gòu)于西安開來生物工程有限公司(批號(hào)K120722),純度≥95%,用前以0.2%CMC-Na配制混懸液,用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。1.4動(dòng)物2方法2.1空腹血糖等fps法檢測(cè)血糖小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,參照文獻(xiàn)方法禁食不禁水12h,于左下腹一次性注射STZ150mg·kg-1(臨用前溶解于0.1mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液,pH4.4),72h后小鼠尾端采血,用血糖儀測(cè)定空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG),7d后再次測(cè)定FBG,選擇FBG≥11.1mmol·L-1者進(jìn)行試驗(yàn)。造模成功小鼠20只,隨機(jī)分為2組:模型組(STZ組)、Pue組(100mg·kg-1),每組10只,另設(shè)正常對(duì)照組10只,共3組。模型組及對(duì)照組ig給予0.2%CMC-Na,Pue組ig給予相應(yīng)藥物,每天1次,連續(xù)給藥4周。實(shí)驗(yàn)過程中死亡動(dòng)物剔除,不予統(tǒng)計(jì)。2.2肝臟組織的nd-pcr檢測(cè)實(shí)驗(yàn)4周時(shí),末次給藥后,禁食不禁水12h,摘眼球取血,肝素抗凝,3000r·min-1離心10min,取血漿;切取肝臟,一部分加入細(xì)胞裂解液150μl進(jìn)行研磨,制備組織勻漿,余下部分加入Trizol后立即置于-80℃冷凍待RNA提取及RT-PCR檢測(cè);胰腺經(jīng)4%中性甲醛固定后石蠟包埋切片待作免疫熒光及HE染色。2.3dbg測(cè)定在實(shí)驗(yàn)中,分別在給藥7,14,21,28d時(shí),禁食12h,測(cè)定FBG。28d后,取正常組、STZ組和Pue組的小鼠血漿,采用北京北方生物技術(shù)研究所研制的放射免疫試劑盒測(cè)定,按照說明書進(jìn)行操作。2.4灌胃前后血糖含量的測(cè)定方法:在28d給藥后,禁食12h,各組小鼠灌胃給予25%葡萄糖(2g·kg-1)溶液,于灌胃前和灌胃后0.5,1,2h尾靜脈取血得到各個(gè)時(shí)間段下的血糖值,并計(jì)算曲線下面積(AUC),AUC=0.5×(0min血糖+30min血糖)/2+0.5×(30min血糖+60min血糖)/2+1×(60min血糖+120min血糖)/2。2.5western-pcr檢測(cè)western-pa的表達(dá)blot檢測(cè)小鼠肝臟中AKT,GSK-3β蛋白磷酸化水平組織裂解液離心取上清,煮沸變性后進(jìn)行SDS凝膠電泳,灌制5%濃縮膠,12%分離膠,上樣量為20μg總蛋白,恒壓80V20min,之后把電壓提高到100V,繼續(xù)電泳90min,然后恒流200mA,120min濕轉(zhuǎn),將蛋白從SDS凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜上,脫脂牛奶封閉后加入抗p-AKT抗體、抗p-GSK-3β抗體、(1∶500)4℃孵育過夜,最后加入二抗孵育2h,ECL顯色。2.6免疫熒光法檢測(cè)胰腺組織經(jīng)4%中性甲醛固定的胰腺組織常規(guī)脫水、透明、包埋、制成厚4μm切片,進(jìn)行蘇木素伊紅染色(HE),400倍(40×10)光鏡下觀察胰腺的基本病理改變情況。免疫熒光染色:小鼠胰腺組織切片脫蠟水化用PBS洗滌,滴加封閉血清在濕盒中室溫封閉30min。加適宜濃度的一抗置濕盒中4℃孵育過夜,PBS洗滌后加入FITC二抗室溫置濕盒中避光孵育1h。最后用含DAPI的甘油封片,可對(duì)標(biāo)本進(jìn)行顯核,藍(lán)色熒光。保存切片于暗盒中,在800倍熒光顯微鏡下觀察。2.7實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)mRNA應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer3.0設(shè)計(jì)引物,引物序列為UCP2:上游5’-GCATTGGCCTCTACGACTCT-3’,下游5’-CCT-GGAAGCGGACCTTTAC-3’;內(nèi)參GAPDH:上游5’-GTCCATGCCATCACTGCCAC-3’,下游5’-CAGCACCAGTGGATGCAGGG-3’。取小鼠肝臟300mg,按照Trizol試劑說明書提取總RNA,鑒定RNA的純度及完整性(測(cè)得所提取的RNAA260/A280范圍1.8~2.0,且凝膠電泳顯示18s和20s條帶清晰,說明純度良好)。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作規(guī)程合成20μlcDNA。ABI7500RealtimePCR儀/SYBRgreen法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件:94℃,20s;退火溫度,20s;72℃,30s;40個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5min。2.8統(tǒng)計(jì)分析3結(jié)果3.1血漿胰島素檢測(cè)與正常對(duì)照組比較,STZ造模成功后小鼠FBG明顯升高(P<0.001)。在給藥4周內(nèi),與STZ模型組相比,Pue組小鼠在給藥7,14,21d后血糖均逐步降低,并在第28天時(shí),具有顯著性差異(P<0.05),見表1。而血漿胰島素檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,STZ組小鼠的FINS水平降低(P<0.05)。與STZ組相比,Pue組的FINS水平升高(P<0.05),提示葛根素可能增加胰島素分泌。見圖1。3.2血糖值對(duì)比STZ組在0,30,60,120min各時(shí)點(diǎn)血糖值均顯著高于con組,而Pue組在各時(shí)點(diǎn)血糖值均低于STZ組,并在0、60、120min時(shí)點(diǎn)有顯著性差異(P<0.01,P<0.01,P<0.001)。對(duì)糖耐量曲線進(jìn)行AUC統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)STZ組的AUC顯著高于con組(P<0.001),給予葛根素治療后,低于STZ組(P<0.001)。3.3stz對(duì)胰島的活性檢測(cè)胰腺組織切片中HE及胰島素免疫熒光染色結(jié)果顯示,正常組的胰島呈橢圓形,結(jié)構(gòu)完整,邊界清晰,胰島內(nèi)胞漿豐滿,胰島素高表達(dá)(圖3A&D)。而STZ組胰島形態(tài)不規(guī)則,結(jié)構(gòu)被破壞,邊界不清晰,胰島內(nèi)的部分細(xì)胞發(fā)生空泡變性,胰島β細(xì)胞比例顯著降低(圖3B&E)。Pue組與STZ組相比,胰島結(jié)構(gòu)的破壞程度得到改善,胰島形態(tài)完整,邊界較為清晰,且胞漿飽滿,胰島β細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖3C&F)。3.4葛根素對(duì)kt和p-gsk-3水平的影響Westernblot結(jié)果顯示,STZ糖尿病小鼠肝臟中p-AKT和p-GSK-3β水平與對(duì)照組比較明顯降低,表明AKT通路的激活被抑制。而給予葛根素作用后,有效提高了p-AKT和p-GSK-3β的水平。見圖4(均具有極顯著性差異,P<0.001)。3.5ucp2mna的含量與對(duì)照組相比,STZ組小鼠肝臟中UCP2mRNA的含量明顯升高(P<0.05),而Pue給藥28d后,可觀察到UCP2mRNA水平的有效降低(P<0.01)。見圖5。4葛根素對(duì)ucp2表達(dá)的調(diào)控β細(xì)胞衰竭是糖尿病發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié),保護(hù)β細(xì)胞成為近年來糖尿病研究和藥物研發(fā)的重要方向,而肝臟作為重要的代謝器官,在調(diào)節(jié)、維持機(jī)體正常血糖水平中的關(guān)鍵作用毋庸置疑。中藥治療糖尿病及其并發(fā)癥具有與口服降糖西藥具有完全不同的作用特點(diǎn),它是通過綜合作用取得療效。本研究基于中藥整體調(diào)節(jié)、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn),分別從保護(hù)胰島β細(xì)胞和改善肝臟功能這兩個(gè)不同的方面綜合考察了葛根素可能的降糖作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn),相比于STZ模型組,葛根素給藥組小鼠血糖明顯下降,血漿胰島素含量升高,口服糖耐量明顯改善。在進(jìn)一步的作用機(jī)制研究中,通過模型小鼠胰腺切片免疫熒光染色,我們觀察到葛根素能保護(hù)胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,一定程度上增加β細(xì)胞的數(shù)目,在mRNA水平降低了UCP2的表達(dá)量,恢復(fù)肝臟調(diào)節(jié)血糖的功能,輔助調(diào)節(jié)β細(xì)胞的分泌功能,從而實(shí)現(xiàn)降糖效應(yīng)。AKT是胰島素受體信號(hào)通路下游PI3K途徑中關(guān)鍵信號(hào)蛋白,在受到胰島素或生長(zhǎng)因子刺激后,該途徑上游信號(hào)逐級(jí)激活,繼而啟動(dòng)下游相關(guān)反應(yīng),參與糖原合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解蛋白合成、糖異生抑制及抗凋亡等作用,故AKT是維持血糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)因素。同時(shí)AKT通路激活后,可磷酸化下游的GSK-3β從而抑制其活性,阻止其對(duì)糖原合成的抑制,達(dá)到降低血糖的目的。并且AKT在調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞生存與功能方面具有重要作用。PI3K/AKT通路的激活,能夠上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子PDX-1的表達(dá),抑制另一轉(zhuǎn)錄因子Foxo1的的功能,從而促進(jìn)β細(xì)胞增殖及胰島素分泌功能,降低由高糖誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡。本研究中我們觀察到在肝臟組織中,與正常對(duì)照組比較,糖尿病小鼠中AKT通路激活被抑制,而葛根素組AKT激活水平增加而GSK-3β活性被抑制,改善了肝臟功能,提高了機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性,提示葛根素降血糖的作用機(jī)制之一可能通過激活A(yù)KT信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)。肝臟是機(jī)體重要的代謝器官,UCP2在成年正常肝細(xì)胞中幾乎不表達(dá),而在某些病理情況下,肝細(xì)胞會(huì)大量表達(dá)UCP2,UCP2的過表達(dá)有可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的增加。有研究報(bào)道,肥胖高脂喂養(yǎng)的小鼠肝臟內(nèi)UCP2表達(dá)升高。而胰島β細(xì)胞高表達(dá)UCP2,引發(fā)解偶聯(lián)氧化磷酸化使細(xì)胞內(nèi)ATP含量減少?gòu)亩鴵p害β細(xì)胞胰島素分泌功能并促進(jìn)2型糖尿病發(fā)生。UCP2可以負(fù)性調(diào)節(jié)胰島素分泌,并且小鼠在敲除UCP2基因后,逆轉(zhuǎn)了肥胖和高糖誘發(fā)的β細(xì)胞損傷,改善了糖尿病癥狀。在本