轉(zhuǎn)基因蘋果研究現(xiàn)狀與展望

.頁眉.頁腳..轉(zhuǎn)基因蘋果研究現(xiàn)狀與展望摘要：從轉(zhuǎn)基因蘋果受體基因型、選擇標(biāo)記基因、報告基因及外源基因等方面綜述了轉(zhuǎn)基因蘋果研究現(xiàn)狀，著重論述了外源基因在轉(zhuǎn)基因蘋果中的應(yīng)用。同時綜合文獻提出了蘋果轉(zhuǎn)基因研究存在的問題和今后的研究方向。關(guān)鍵詞：蘋果；轉(zhuǎn)基因；基因型；外源基因；ProspectandResearchStatusofTransgenicApplesAbstract:Thispaperreviewedthepresentsituationoftransgenicapplesfromthegenotypeoftransgenicapplesreceptors，selectivemarkergene，reportergeneandexogenousgeneandsoon，moreover,theapplicationofexogenousgeneintransgenicapplesweremainlydiscussed．Meanwhile，problemsinthestudyoftransgenicapplesandtheresearchdirectioninthefuturewereputforwardbysummarizingliterature．Keywords:Apple;Transgenic;Genotype;Exogenousgene蘋果是世界四大水果之一，是我國第一大水果，在國民經(jīng)濟中占有重要地位。隨著社會的發(fā)展，培育優(yōu)良蘋果品種已經(jīng)成為廣大消費者的迫切要求。目前，培育出的蘋果品種雖然已有800多個，但是培育具有綜合農(nóng)藝性狀的品種仍然是一大難題。其主要原因是:①蘋果是高度雜合的樹種，遺傳背景比較復(fù)雜，有性雜交后代廣泛分離，選育結(jié)果難以控制;②蘋果童期(5～7年)比較長，育種周期長;③蘋果育種工作已有上百年的歷史，長期的人為定向選育使蘋果品種的遺傳性趨于一致，基因型范圍越來越窄。以上原因?qū)μO果育種造成諸多不利影響，使培育具有優(yōu)良綜合農(nóng)藝性狀的蘋果品種極為困難。20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為蘋果品種的遺傳改良提供了新的技術(shù)方法首先，轉(zhuǎn)基因技術(shù)只對個別性狀進行改良即可獲得理性個體;其次，轉(zhuǎn)基因植株不存在童期問題，可以縮短育種周期;最后，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以打破物種界限，極大地豐富基因來源轉(zhuǎn)基因技術(shù)給蘋果育種工作展現(xiàn)了良好的前景，筆者就蘋果轉(zhuǎn)基因方面的研究進展作一綜述。1蘋果轉(zhuǎn)基因受體基因型1989年James等首次獲得轉(zhuǎn)基因綠袖蘋果，此后，蘋果轉(zhuǎn)基因研究迅猛發(fā)展迄今為止，用于蘋果轉(zhuǎn)基因研究的受體基因型越來越多，除綠袖外，還包括M26、元帥、皇家嘎拉、嘎拉、Braeburn、Elstar、喬納金、富士、遼伏、Marshall、McIntoshM．9、M29、粉紅佳人(Pinkla-dy)、Jork9QueenCox、王林(Orin)、金矮生(Jon-agored)17個品種。2選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化的植物中存在著轉(zhuǎn)化細(xì)胞和未被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，它們之間存在著生長競爭，需要插入選擇標(biāo)記基因來選擇轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞以獲得轉(zhuǎn)化植株植物基因工程中常用的選擇標(biāo)記基因主要有兩大類:一類是編碼抗生素抗性的基因，如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Ⅱ(nptII)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)和二氫葉酸還原酶基因(dhfr)等;另一類是編碼除草劑抗性的基因，如草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(bar)在蘋果轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用最多的選擇標(biāo)記基因是nptⅡ，其作用原理是nptⅡ基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，通過酶促磷酸化使氨基糖苷類抗生素失活，從而解除毒性，使轉(zhuǎn)基因植物對卡那霉素巴龍霉素等氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生抗性。3報告基因報告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速地測定，在轉(zhuǎn)化的早期階段可以快速檢測外源基因是否成功導(dǎo)入受體細(xì)胞組織或器官，并檢測其表達活性的一類特殊用途的基因在蘋果轉(zhuǎn)基因研究中，常用的報告基因有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Ⅱ(nptII)β-葡萄糖醛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(gus)胭脂堿合成酶基因(nos)和綠色熒光蛋白基因(gfp)［19］等。4蘋果品種改良基因1989年James等首次獲得轉(zhuǎn)基因綠袖蘋果后，蘋果轉(zhuǎn)基因研究迅猛發(fā)展，外源基因涉及到改良植物性狀的目的基因范圍也越來越廣目前蘋果改良基因研究有以下幾個方向:抗病蟲害基因開花相關(guān)基因矮化植株基因促進生根基因抗除草劑基因耐貯藏基因及調(diào)控基因等。4,1抗病基因在蘋果的遺傳轉(zhuǎn)化中，抗病基因研究主要集中在抗火疫病(Erwiniaamylovora)方面與此相關(guān)的有CecropinB、AttacinA、SB-37、Shiva-1、AttacinE、hrpN、NPR1、MB39gene、mbr4、等基因CecropinBAttacinA和AttacinE是從天蠶體內(nèi)分離出來的細(xì)胞溶解酶蛋白;SB-37Shiva-1是人工合成的細(xì)胞溶解酶類似物此外還有抗真菌基因β-1，3-葡聚糖酶雙價基因、內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因、stilbenesynthasegene、PGIP以及抗蘋果黑星病基因pinB。4,2抗蟲基因到目前為止，導(dǎo)入蘋果的外源抗蟲基因有抗鱗翅類和鞘翅類昆蟲的CpTI基因、蘇云金桿菌毒蛋白基因(Bt)、生物素綁定蛋白基因、CpTI對于許多害蟲都具有抗性，廣譜性是其應(yīng)用于植物基因工程最主要的優(yōu)點;Bt是從蘇云金桿菌分離出的殺蟲結(jié)晶蛋白(ICP)基因，ICP以原毒素形式存在，昆蟲取食后，在消化道被活化，與腸道上特異性結(jié)合蛋白結(jié)合，使ICP全部或部分嵌合于細(xì)胞膜上，產(chǎn)生孔道，昆蟲幼蟲停止進食，最終死亡;生物素綁定蛋白基因通過表達抗生物素蛋白或卵白素蛋白提高蘋果的抗蟲性。4,3開花相關(guān)基因果樹童期長的特點在很大程度上延長了果樹的育種周期開花相關(guān)基因的研究，為縮短果樹的童期，從而縮短育種周期提供了分子理論基礎(chǔ)目前已經(jīng)從多種植物上克隆到MdTFL、BpMADS4等基因，并應(yīng)用到蘋果的遺傳轉(zhuǎn)化中MdTFL基因是從蘋果(Malus×domesti-caBorkh．)中克隆得到，該基因與擬南芥中的TERMINALFLOWER1(TFL1)基因為同源基因，可以抑制花的分生組織形成Kotoda等向蘋果中轉(zhuǎn)入反義MdTFL基因可以抑制MdTFL的表達，從而使蘋果可以在嫁接8～15個月后就可以開花BpMADS4是從歐洲白樺(Betulapendula)中克隆出的MADS-box家族基因，其主要在歐洲白樺的花序莖尖和根尖中表達，作用主要是促進早起花的形成Flachowsky等將BpMADS4基因轉(zhuǎn)入蘋果Pinova中，3～4個月就可以開花4,4矮化基因矮化栽培因具有結(jié)果早、品質(zhì)好、管理方便、品種更新快等優(yōu)點，已成為果樹業(yè)發(fā)展的趨勢。由于果樹有很長的生命周期，使得傳統(tǒng)的育種方法選育矮化品種非常緩慢，利用基因工程技術(shù)可以大大提高矮化品種培育的速率。目前已經(jīng)從病原體農(nóng)桿菌中鑒定和克隆出一些與矮化有關(guān)的基因，在蘋果中得到應(yīng)用的主要有rolA、rolC、phyB、gai基因等Holefors等及Zhu等將rolA基因轉(zhuǎn)入砧木M26，獲得的轉(zhuǎn)化植株與對照相比，樹體矮小，節(jié)間縮短，樹葉面積減小。Holefors等獲得的轉(zhuǎn)化植株葉、根干重均降低，Zhu等獲得的轉(zhuǎn)化植株的根明顯縮短。Igarashi等將從擬南芥中克隆出的rolC基因轉(zhuǎn)入Marubakaidou砧木，獲得的轉(zhuǎn)基因植株有1～3個拷貝的rolC基因整合到基因組DNA中，轉(zhuǎn)基因植株的節(jié)間縮短、葉片面積減小、頂端優(yōu)勢減弱。2000年Hole-fors等將擬南芥phyB(光敏色素B)基因?qū)隡26獲得13個株系的轉(zhuǎn)基因植株，該基因在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)過量表達。其中9個株系主干明顯縮短，13個株系的莖、根和植物體干重均降低。此外，Zhu等將從擬南芥中克隆出的gai基因?qū)胩O果砧木A2以及栽培品種Gravenstein和McIntosh中，得到的轉(zhuǎn)化植株大部分表現(xiàn)出矮化特征，同時還表現(xiàn)出節(jié)間距減小、節(jié)數(shù)變少等表型特征。轉(zhuǎn)基因植株的矮化使得節(jié)數(shù)變少，但是否可以縮短童期尚未見報道4.5促進生根基因受基因型的影響，有些蘋果砧木采用扦插和壓條繁殖時，生根極其困難利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在一定程度上可以解決這一問題Welander等將rolB基因?qū)胝枘綧26中，發(fā)現(xiàn)與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株根系對生長素的敏感性增強，生根能力也相應(yīng)提高Igarashi等將從擬南芥中克隆出的rolC基因轉(zhuǎn)入Marubakaidou砧木，獲得的轉(zhuǎn)基因植株除了表現(xiàn)植株矮化性狀外，其生根能力也有了相應(yīng)提高4.6抗除草劑基因隨著生物技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)有能力通過遺傳工程的方法來培育耐除草劑的作物品種根據(jù)抗性機理不同，目前耐除草劑的基因工程主要有2種策略:①修飾除草劑作用的靶蛋白，使其對除草劑不敏感，或促使其過量表達以使植物吸收除草劑后仍能進行正常代謝;②引入酶或酶系統(tǒng)，在除草劑發(fā)生作用前將其降解或解毒ALS的靶位點突變體在自然界中普遍存在，人們已在細(xì)菌酵母植物細(xì)胞培養(yǎng)物及種植于田間的作物中發(fā)現(xiàn)了這種突變酶將來自擬南芥的als基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化皇家嘎拉蘋果獲得轉(zhuǎn)基因植株在后續(xù)研究中，獲得的種子用60mg/L綠貧隆(Glean)噴灑檢測其抗性，發(fā)現(xiàn)als基因按1∶1分離比例穩(wěn)定遺傳。從鏈霉菌中分離出的編碼乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶的基因被稱為bar基因乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶具有使除草劑草丁膦代謝失活的作用其作用機制在于在乙酰CoA存在的情況下，乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶催化乙酰CoA與草丁膦的游離氨基結(jié)合，從而使草丁膦失去除草劑的活性Dolgov等把bar基因?qū)胩O果砧木No．545并獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株4.7耐貯藏基因蘋果在貯藏過程中，由于果實熟化過程難以控制，常常導(dǎo)致過熟腐爛，造成極大的經(jīng)濟損失常規(guī)育種方法選育耐貯藏蘋果品種周期太長效果不理想，不能滿足生產(chǎn)的需求近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)改良蘋果貯藏性已經(jīng)有了一定的成效果實耐貯藏基因的研究主要集中在乙烯的合成途徑相關(guān)基因的研究上，乙烯在對蘋果果實的成熟轉(zhuǎn)變扮演著重要角色Pesis等向蘋果綠袖中轉(zhuǎn)入反義ACCS和ACCO基因，然后將轉(zhuǎn)基因蘋果果實0℃冷藏3個月，之后轉(zhuǎn)入20℃環(huán)境中存放結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)化的蘋果果實相比，轉(zhuǎn)基因蘋果的乙烯含量明顯降低，轉(zhuǎn)基因蘋果對蘋果貯藏過程中容易出現(xiàn)的虎皮病和苦陷病抑制效果不明顯4.8調(diào)控基因近20年來利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行蘋果的遺傳改良取得了很大進展，外源基因涉及到改良植物性狀的目的基因范圍也越來越廣很多轉(zhuǎn)基因植株的性狀在一定程度上得到了改良，但外源基因的表達強度不夠，其效果尚不盡人意2000年Gittins等提出遺傳改良作物轉(zhuǎn)化基因的表達受限于組織特異性的編碼活性他們將非同源的SSURBCS3CPSRS1P和CaMV35S啟動子，以及GUSA標(biāo)記基因連接轉(zhuǎn)入到蘋果綠袖中，研究了不同啟動子啟動的GUSA在綠袖中不同組織的表達狀況研究表明，SSU啟動子首先在蘋果的綠色營養(yǎng)組織中起作用;在根部RBCS3C啟動子活性要遠遠高于SRS1啟動子;SRS1啟動子的活性在很大程度上依賴于光照2001年Gittins等又對Bras-sicanapusextA啟動子的調(diào)控作用作了研究，結(jié)果表明該啟動子在蘋果莖段中的調(diào)控作用非常明顯以上結(jié)果表明，不同基因在不同組織中有特異的啟動方式，因此，改進調(diào)控基因表達的特異啟動子有助于提高目的基因的表達強度和減少表達蛋白的損耗。5存在問題及前景展望5.1安全的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)目前由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一些限制性因素，在轉(zhuǎn)基因過程中一般要與目的基因一起轉(zhuǎn)入1個篩選標(biāo)記基因常用的篩選標(biāo)記基因為抗生素抗性基因和抗除草劑基因，大多數(shù)的篩選標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)化后也同時存在于轉(zhuǎn)基因植物中，因此引起了轉(zhuǎn)基因植物安全性問題的討論如人們擔(dān)心抗生素抗性基因有可能從攝入的轉(zhuǎn)基因食物轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，從而使人體的消化道內(nèi)產(chǎn)生抗性菌株;另外，除草劑抗性基因也有可能在野外引起基因擴散，造成超級雜草的出現(xiàn)盡管目前并沒有證據(jù)證明其危害性，但公眾對安全性的關(guān)注大大推遲了轉(zhuǎn)基因作物的商品化和市場運作，從而阻礙了轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展因此，探索一種新的無抗性篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，可以更好地激勵植物基因工程技術(shù)盡快地應(yīng)用到生產(chǎn)之中5.2外源基因表達強度不夠盡管目前通過轉(zhuǎn)基因方式獲得了很多各種蘋果改良轉(zhuǎn)基因植株，如蘋果的抗病蟲害轉(zhuǎn)基因雖然離體檢測其抗性有了一定程度的提高，但其效果并不能達到人們所期望的目標(biāo)所以應(yīng)該從基因表達調(diào)控以及特異性表達的啟動子方面進行研究，以盡可能地提高目的基因的表達強度5.3品種改良基因型范圍太窄蘋果轉(zhuǎn)基因研究主要集中在抗病蟲害方面，而抗病基因研究又主要集中在抗火疫病方面，抗其他病害的基因很少有報道;以提高果實品質(zhì)及抗逆性如抗寒抗鹽堿等為目的的轉(zhuǎn)基因研究也不多見References［1］JAMESDJ，PASSEYAJ，BARBARADJ，etal．Genetictransformationofapple(MaluspumilaMill)usingadisarmedTi-binaryvector［J］.PlantCellRep，1989，7:658－661．［2］MAHESWARANG，WELANDERM，HUTCHINSONJF，etal．Transforma-tionofapplerootstockM26withAgrobacteriumtumefaciens［J］．JPlantPhysiol，1992，139(5):560－568．［3］SRISKANDARAJAHS，GOODWINPB，SPEIRSJ．Genetictransformationofapplescioncultivar‘Delicious’viaAgrobacteriumtumefaciens［J］．PlantCellTissOrg，1994,36(3):317－329．［4］JIALY，COHEND，ATKINSONR，etal．RegenerationoftransgenicplantsfromthecommercialapplecultivarRoyalGala［J］．PlantCellRep，1995，14(7):407－412．［5］SCHAARTJG，PUITEKJ，KOLOVAL，etal．Somemethodologicalas-pectsofappletransformationbyAgrobacterium［J］.Euphytica,1995,85(1/3):131－134．［6］PUITEKJ，SCHAARTJG．GeneticmodificationofthecommercialapplecultivarsGala，GoldenDeliciousandElstarviaanAgrobacteriumtumefa-ciens-mediatedtransformationmethod［J］．PlantSci，1996，119(1/2):125－133．［7］BONDTAD，EGGERMONTK，PENNINCKXI，etal．Agrobacteriummedi-atedtransformationofapple(MalusdomesticaBorkh):anassessmentoffactorsaffectingregenerationoftransgenicplant［J］．PlantCellRep，1996，15:549－554．［8］裴東，田穎川，劉群祿等．蘋果葉片再生的改進及抗蟲基因植株的獲得［J］．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1996，19(4):23－27．［9］BOLARJP，BROWNSK，NORELLIJL，etal.Factorsaffectingthetrans-formationof‘MarshallMcIntosh’applebyAgrobacteriumtumefaciens［J］．PlantCellTissOrg，1998，55(1):31－38．［10］ZHULH，HOLEFORSA，AHLMANA，etal．TransformationoftheapplerootstockM．9/29withtherolBgeneanditsinfluenceonrootingandgrowth［J］.PlantSci，2001，160(3):433－439．［11］SRISKANDDARAJAHS，GOODWINP．Coditioningpromotesregenerationandtransformationinappleleafexplants［J］．PlantCellTissOrg，1998，53(1):1－11．［12］SEDIRAM，HOLEFORSA，WELANDERM．ProtocolfortransformationoftheapplerootstockJork9withtherolBgeneanditsinfluenceonrooting[J］．PlantCellRep，2001，20(6):517－524．［13］WILSONFM，JAMESDJ．Regenerationandtransformationofthepremi-erUKapple(Malus×pumilaMill．)cultivarQueenCox［J］．TheJournalofHorticulturalScienceandBiotechnology，2003，78:656－662．［14］KANAMARUN，ITOY，KOMORIS，etal．Transgenicappletransformedbysorbitol-6-phosphatedehydrogenasecDNA:Switchbetweensorbitolandsucrosesupplyduetoitsgeneexpression［J］．PlantSci，2004，167(1):55－61．［15］程家勝，鄂超蘇，田穎川等．轉(zhuǎn)Bt抗蟲基因蘋果植株的再生［J］．中國果樹，1994(4):14－15．［16］WELANDERM，PAWLICKIN，HOLEFORSA，etal．Genetictransforma-tionoftheapplerootstockM26withtherolBgeneanditsinfluenceonrooting［J］．JournalofPlantPhysiology，1998，53:371－380［17］HANKEV，HILLERI，KLOTSCHEG，etal．Transformationinappleforincreaseddiseaseresisitance［J］．ActaHort，2000，538:611－616．［18］BOLARJP，NORELLIJL，WONGKW，etal．Expressionofendochiti-nasefromTrichodermaharzianumintransgenicappleincreasesresistancetoapplescabandreducesvigor［J］.Phytopathology，2000，90(1):72－77．［19］HILYJM，LIUZA．simpleandsensitivehigh-throughputGFPscreeninginwoodyandherbaceousplants［J］．PlantCellRep，2009，28(3):493－501．［20］NORELLIJ，ALDWINCKLEH，DESETFANO-BELTRNL，etal．In-creasingthefireblightresistanceofapplebytransformationwithgenesencodingantibacterialproteins［J］．ActaHort，1993，338:385－386．［21］NORELLIJL，MILLSJZ，JENSENLA，etal．Geneticengineeringofap-pleforincreasedresistancetofireblight［J］．ActaHort，1998，484:541－546．［22］ABDUL-KADERAM，NORELLIJL，ALDWINKLEHS，etal．Evaluationofthehrpngeneforincreasingresistancetofireblightintransgenicapple［J］．ActaHort，1999，489:247－250．［23］LIUQ，INGERSOLLJ，OWENSL，etal．ResponseoftransgenicRoyalGa-laapple(MalusdomesticaBorkh．)shootscarryingamodifiedcecropinMB39gene，t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