牛fshr基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析

牛fshr基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析

fsh是動(dòng)物體內(nèi)垂體的重要繁殖激素。它促進(jìn)了卵巢細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、成熟和產(chǎn)卵。由于為生物大分子,不能透過(guò)細(xì)胞膜,FSH必須通過(guò)與位于靶細(xì)胞膜上的促卵泡素受體(FSHR)結(jié)合,經(jīng)過(guò)受體介導(dǎo)將信息傳遞到靶細(xì)胞內(nèi),才能發(fā)揮其生物學(xué)功能。1982、1983年,Riper等、Kelly等就發(fā)現(xiàn):多胎綿羊要比單胎的品種對(duì)促性腺激素更敏感。隨后的多項(xiàng)研究表明,不僅不同的鼠品系對(duì)超排制劑的反應(yīng)存在遺傳差異,而且對(duì)母牛多胎性的選擇會(huì)增加卵巢對(duì)促性腺激素反應(yīng)的敏感性,這些研究結(jié)果說(shuō)明:FSH的作用強(qiáng)度可能受到了FSHR表達(dá)數(shù)量多寡或活性高低的調(diào)控。Abdennebi等(1999)對(duì)多胎羅曼諾夫綿羊和單胎法蘭西島綿羊發(fā)育卵泡促性腺激素受體表達(dá)的進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn):盡管隨著卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和體積增大,卵泡顆粒細(xì)胞的FSHR水平降低、LHR水平升高這一特征趨勢(shì)在二品種綿羊相同,但無(wú)論是在大卵泡還是小卵泡,多胎羅曼諾夫綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的FSHRmRNA水平均比單胎的法蘭西島羊高。當(dāng)對(duì)發(fā)育早期卵泡收集的顆粒細(xì)胞用FSH或人絨毛膜促性腺激素(hCG)處理時(shí),羅曼諾夫羊表現(xiàn)出明顯高于法蘭西島羊的對(duì)FSH和hCG的反應(yīng)強(qiáng)度(cAMP生成量增加)。研究者認(rèn)為:羅曼諾夫羊高的排卵率是與其卵泡發(fā)育早期對(duì)促性腺激素有較高的反應(yīng)敏感性相關(guān)。目前國(guó)際上已對(duì)多種動(dòng)物的FSHR基因cDNA序列進(jìn)行了克隆和測(cè)序。但對(duì)該基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)調(diào)控區(qū)的研究仍然較少,尚未見(jiàn)到牛該段序列的報(bào)道。由于基因5′端的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)著基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)和速率,從而影響基因表達(dá)產(chǎn)物的數(shù)量,我們對(duì)牛FSHR基因5′端側(cè)翼約800bp的序列進(jìn)行了克隆和分析,并利用PCR-RFLP方法研究了中國(guó)西門(mén)塔爾牛該段序列的多態(tài)性。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及引物中國(guó)西門(mén)塔爾牛血樣和凍精共34頭份來(lái)自于中國(guó)農(nóng)科院畜牧所中國(guó)西門(mén)塔爾牛培育課題組。其中12頭份為種用公牛凍精,11頭份為至少產(chǎn)過(guò)1次雙胎的成年母牛(以下簡(jiǎn)稱雙胎母牛)血樣,其余11頭份為未加選擇的隨機(jī)牛血樣。實(shí)驗(yàn)用DNA聚合酶、連接酶、限制性內(nèi)切酶、RNA酶、蛋白酶K及苯酚、氯仿、瓊脂糖、dNTPs等藥品、試劑分別購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司或北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心。PCR引物由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所合成?？寺∮幂d體為PUC18質(zhì)粒載體,菌株為E.coliJM109。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1pcr擴(kuò)增和轉(zhuǎn)染fshr基因擴(kuò)增目的DNA片段的引物參照Sairam和Subbarayan(1997)報(bào)道的澳洲綿羊FSHR基因5′端側(cè)翼序列和第1外顯子序列設(shè)計(jì),上游引物為5′AATTCATTTGTGCCAGCATCC3′,位于綿羊FSHR基因翻譯起始點(diǎn)上游-815→-795位點(diǎn);下游引物為5′AGTTCGACCGCATCCCTG3′,位于綿羊FSHR基因翻譯起始點(diǎn)下游+135→+152位點(diǎn)。從凍精和血樣中提取基因組DNA參照孟安明和盧圣棟資料。PCR反應(yīng)采用50μl體系,反應(yīng)液的組成為:20mmol/LMgCl2的10×Taq酶buffer5.0μl、10mmol/LdNTPs1.0μl、20pmol/L的上、下游引物各2.5μl、基因組DNA500ng、TaqDNA聚合酶2.5U、加雙蒸去離子水至50μl。PCR反應(yīng)退火溫度經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定為67℃。反應(yīng)程序?yàn)?94℃變性5min后,按94℃1min變性、67℃1min退火、72℃1min延伸循環(huán)30次,最后在72℃延伸10min,降溫至4℃保存。1.2.2目的dna片段的回收、克隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1頭份,應(yīng)用0.9%瓊脂糖凝膠電泳分離目的DNA片段,然后用glassmilk作吸附劑、Genecleankit法從瓊脂糖凝膠中回收、純化目的DNA片段。選用T4DNA連接酶將目的DNA片段克隆于PUC18質(zhì)粒加T載體,轉(zhuǎn)化受體菌JM109。藍(lán)白斑篩選,并經(jīng)限制性酶切鑒定出陽(yáng)性克隆。堿裂解法提取重組質(zhì)粒,用370ADNA序列自動(dòng)分析儀測(cè)序。1.2.3內(nèi)切酶切時(shí)間對(duì)測(cè)序的目的DNA片段應(yīng)用DNASIS軟件查找出內(nèi)切酶酶切圖譜。用PstⅠ、TaqⅠ、HaeⅢ和SinⅠ4種內(nèi)切酶對(duì)34頭份PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行單酶切,酶切采用20μl體系,反應(yīng)時(shí)間4h。酶切產(chǎn)物用2.5%～3%的瓊脂糖凝膠分析。計(jì)算檢測(cè)出的等位基因頻率,并應(yīng)用X2檢驗(yàn)基因頻率和基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律及差異的顯著性。2結(jié)果2.1牛和麻黃堿基的序列及測(cè)序結(jié)果以中國(guó)西門(mén)塔爾?；蚪MDNA為模板,應(yīng)用參照澳州綿羊FSHR基因序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,目的DNA條帶明亮,只有一條特異帶。這一結(jié)果與已證實(shí)的FSHR為單拷貝基因的結(jié)論一致。序列分析結(jié)果(圖1):擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度970bp,減去引物后的長(zhǎng)度為931bp,包括基因第1外顯子134bp和5′端側(cè)翼797bp。與Sairam和Subbarayan報(bào)道的澳洲綿羊FSHR基因同源區(qū)域比較,牛FSHR基因5′端側(cè)翼序列長(zhǎng)度多出3個(gè)堿基;在結(jié)構(gòu)基因第1外顯子區(qū),牛與綿羊的序列長(zhǎng)度一致。用SEQNCE軟件將測(cè)定序列與Hould等(1994)報(bào)道的牛FSHR基因cDNA的序列作比較,試驗(yàn)所克隆基因的外顯子部分與Hould等報(bào)道的外顯子,在同源區(qū)域長(zhǎng)度一致,但氨基酸密碼在信號(hào)肽第13位氨基酸的密碼發(fā)生了1個(gè)堿基變異,我們測(cè)定的密碼子為GGC,而Hould等報(bào)道的密碼子是AGC。這說(shuō)明或者中國(guó)西門(mén)塔爾牛在這一位點(diǎn)的堿基與Hould等研究的牛品種不同,或者牛在這一位置存在堿基突變多態(tài)性。筆者認(rèn)為是后一種可能。對(duì)5′端側(cè)翼的797bp,應(yīng)用轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)元件TATA盒、CAAT盒和GC盒序列進(jìn)行掃描,在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近發(fā)現(xiàn)了2個(gè)TATA盒序列,分別位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上、下游的-162→-154位點(diǎn)和+3→+10位點(diǎn);但未檢索到CAAT盒和GC盒序列。當(dāng)降低標(biāo)準(zhǔn)至2個(gè)堿基不匹配時(shí),則在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游搜索到6個(gè)類CAAT序列,分別位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的-93→-86、-154→-147、-169→-162、-182→-174、-221→-214和-282→-275位點(diǎn)。與Sairam和Subbarayan報(bào)道的澳洲綿羊FSHR基因5′端側(cè)翼序列比較,牛與綿羊該段序列的同源性為92.78%。在應(yīng)用Devereux(1992)、Lee(1996)和Yiu(1997)報(bào)道的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基元序列檢索出的13個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或可能具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的特征性序列中,牛在PuF、Cmos-R2個(gè)調(diào)控元件和2個(gè)3′端HalfERE、甲基化位點(diǎn)逆序列3個(gè)特征性序列位點(diǎn)與綿羊相比發(fā)生了堿基突變,而在另8個(gè)調(diào)控元件或特征性序列位點(diǎn),牛與綿羊的序列一致(表1)。此外,在-97位點(diǎn)、-145位點(diǎn)、-623位點(diǎn),與綿羊序列相比,牛發(fā)生了單堿基缺失;在-364位點(diǎn),出現(xiàn)3個(gè)堿基缺失;在-537位點(diǎn)、-792位點(diǎn),牛出現(xiàn)了單堿基插入;而在-618位點(diǎn),出現(xiàn)7個(gè)堿基插入。2.2taq酶切基因型頻率用4種內(nèi)切酶對(duì)34頭份PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單酶切,PstⅠ、SinⅠ和HaeⅢ3種內(nèi)切酶的酶切產(chǎn)物均為單態(tài),34份樣品使用同一種酶切呈現(xiàn)的帶型一致(圖略)。而用TaqⅠ酶切出現(xiàn)了多態(tài)性,酶切產(chǎn)物電泳呈現(xiàn)3種帶型模式(圖2):Ⅰ型,電泳呈現(xiàn)4條帶。電腦掃描和對(duì)酶切圖譜分析結(jié)果顯示,4條帶大小分別為446、292、140和86bp。Ⅱ型,呈現(xiàn)3條帶,大小分別為586、292和86bp,電腦顯示該帶型的出現(xiàn)是由于位于-387→-384位點(diǎn)的TaqⅠ酶切序列消失造成的;Ⅲ型,呈現(xiàn)5條帶,大小分別為586、446、292、140和86bp,這是Ⅰ型與Ⅱ型的合成帶型。根據(jù)以上結(jié)果,可把實(shí)驗(yàn)中對(duì)牛FSHR基因的擴(kuò)增區(qū)域分成2種等位基因。A:在擴(kuò)增區(qū)域(+134→-797位點(diǎn)間)有3個(gè)TaqⅠ酶切位點(diǎn),其中2個(gè)位于5′端區(qū),分別在-387→-384位點(diǎn)和-527→-524位點(diǎn);1個(gè)位于第一外顯子區(qū)的+60→+63位點(diǎn)。B:在擴(kuò)增區(qū)域有2個(gè)TaqⅠ酶切位點(diǎn),-387→-384位點(diǎn)的TaqⅠ切點(diǎn)消失。兩種等位基因會(huì)形成3種基因型:AA、BB和AB,分別對(duì)應(yīng)于擴(kuò)增片段TaqⅠ酶切后的3種模式帶型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(圖1)。對(duì)34頭份中國(guó)西門(mén)塔爾牛TaqⅠ酶切基因型按種用公牛、雙胎母牛和隨機(jī)牛3種類型分別計(jì)算基因型頻率和基因頻率,并作統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。種用公牛和雙胎母牛的基因型頻率以AB型占優(yōu)勢(shì),分別為0.9167和0.8181;等位基因B的頻率0.5417和0.5909,高于等位基因A的頻率0.4583和0.4091。它們的基因和基因型頻率分布與隨機(jī)牛樣本明顯不同。隨機(jī)牛群的B等位基因頻率較低,而A的頻率顯著較高。X2檢驗(yàn)結(jié)果:隨機(jī)牛的基因和基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),而種用公牛和雙胎母牛的基因和基因型頻率與Hardy-Weinberg平衡不符(P<0.05)。這說(shuō)明盡管雙胎母牛、種用公牛和隨機(jī)樣本牛同為一個(gè)群體,但對(duì)公牛種用性和母牛雙胎力的選擇已使基因和基因型頻率發(fā)生了顯著變化從而與總?cè)翰煌Ｕf(shuō)明這兩種等位基因?qū)ε５姆敝沉τ胁煌饔谩?討論3.1不同類型的fshr基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)和控制轉(zhuǎn)錄是真核生物遺傳信息由細(xì)胞核傳遞至細(xì)胞質(zhì)的必經(jīng)途徑。研究表明:真核基因的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄受DNA上順式作用元件(cis-actingelement)和細(xì)胞中存在的反式作用因子(trans-actingfactor)相互復(fù)雜作用的調(diào)控。在大多數(shù)基因的啟動(dòng)子,決定基因基礎(chǔ)表達(dá)的DNA序列是TATA盒、CAAT盒和GC盒。但對(duì)人和大鼠FSHR基因啟動(dòng)區(qū)的研究結(jié)果:它們啟動(dòng)區(qū)都沒(méi)有TATA盒和CAAT盒,卻有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。大鼠的FSHR基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)有一段類InR(initiatorregion)序列,該序列與TdT基因啟動(dòng)區(qū)的InR序列沒(méi)有相似性,而與CD2基因啟動(dòng)區(qū)的InR序列相似性高。Smale(1997)認(rèn)為:缺失TATA盒的啟動(dòng)子是依靠InR序列來(lái)發(fā)動(dòng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)和指導(dǎo)精確的本底轉(zhuǎn)錄(accuratebasaltranscription),一些具有TATA盒的啟動(dòng)子也具有這種轉(zhuǎn)錄指導(dǎo)特性。InR序列的位置在包含轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的鄰接區(qū)域。對(duì)小鼠FSHR基因表達(dá)的研究顯示:盡管小鼠的FSHR基因有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn),但大部分活性較低,翻譯起始點(diǎn)上游的-534位點(diǎn)是主要的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),該位點(diǎn)之前約10bp處含有一個(gè)類TATA序列TTAAAT。在研究中,在相應(yīng)于牛FSHR基因翻譯起始點(diǎn)上游的-323→-318位點(diǎn),牛和綿羊均存在一個(gè)TATA盒序列TAATAT,在-159→-152位點(diǎn)則含有一個(gè)類TATA序列TAAAAAAG;在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的-86→-282位點(diǎn)間,則檢索到6個(gè)類CAAT序列,而沒(méi)有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近有富嘧啶區(qū)。鑒于目前在牛、綿羊的FSHR基因只發(fā)現(xiàn)1個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn),筆者認(rèn)為:牛、羊的FSHR基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)控制可能與人和大鼠不同,不是靠InR序列來(lái)發(fā)動(dòng)轉(zhuǎn)錄,而可能是TATA盒啟動(dòng)子類型。這一分析結(jié)果與Gromoll等(1994)認(rèn)為人和鼠的FSHR基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能不同可說(shuō)是殊途同歸。3.2轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的堿基變異Sairam和Subbarayan在分析澳洲綿羊FSHR基因5′端序列時(shí),在-1→-800位點(diǎn)間檢索出13個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件序列或可能具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的特征性序列,與其比較,中國(guó)西門(mén)塔爾牛在其中5個(gè)序列位點(diǎn)出現(xiàn)了堿基變異(表1)。在PuF序列位點(diǎn),中國(guó)西門(mén)塔爾牛與澳洲綿羊有2個(gè)堿基不同;在類Cmos-R(Cmos-R-like)、2個(gè)3′HalfERE和甲基化位點(diǎn)逆序列4個(gè)位點(diǎn),二者之間均為單堿基變異。PuF、Cmos-R、cAMP反應(yīng)元件、ERE和細(xì)胞膜類固醇孤兒受體5個(gè)元件序列已在對(duì)其它基因的研究中證實(shí)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄有調(diào)控作用。而其余的特征性序列,如3′HalfERE、5′HalfERE等,由于它們只是正常轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的部分序列、或者序列的方向與正常元件的序列不同,它們對(duì)基因轉(zhuǎn)錄是否有調(diào)控作用目前還不清楚。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是指DNA上與基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)的蛋白質(zhì)因子結(jié)合的序列。一般而言,基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件序列的堿基改變對(duì)啟動(dòng)子活性的影響比一般序列有更大的作用。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件發(fā)生堿基變異,在不同物種、不同基因都有發(fā)生。如對(duì)9個(gè)哺乳動(dòng)物β-球蛋白基因5′端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的研究發(fā)現(xiàn),幾乎每個(gè)基因都有CAAT區(qū),但完全保守的堿基數(shù)只有CCAAT5個(gè)堿基。對(duì)Y-box、Cmos-R2個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的研究發(fā)現(xiàn),它們的序列在不同動(dòng)物種及不同基因啟動(dòng)區(qū)也有相當(dāng)大的堿基變異,如小鼠CytCT基因的Cmos-R序列為GTACAGGGAC,而在Ldhc基因變?yōu)門(mén)TAAAGGGAT;人的HPgk2基因的Cmos-R序列為GTACAGGTAG,而在山羊的FSHR基因,其序列為GGACAGCGTA。令人驚奇的是,當(dāng)將牛和綿羊FSHR基因的PuF、Cmos-R調(diào)控元件序列與原初發(fā)現(xiàn)該元件的基因序列比較時(shí),牛與原初發(fā)現(xiàn)元件的基因序列堿基變異數(shù)多,而綿羊元件序列的保守性較強(qiáng)。如Cmos-R,在小鼠Cmos基因發(fā)現(xiàn)的序列為GTACAGGGAC,綿羊的序列為GGACAGCGTA,而牛的序列為GGAC