一種抗erp蛋白的單克隆抗體的制備及鑒定

一種抗erp蛋白的單克隆抗體的制備及鑒定

柔軟性苦艾酒花是屬于頭腔門的真空菌屬，在雞腸中繁殖，導(dǎo)致雞疾病和死亡。柔嫩艾美耳球蟲的致病作用起始于侵入性蟲體(子孢子和裂殖子)對(duì)宿主細(xì)胞的入侵,了解其入侵宿主細(xì)胞的過程和機(jī)理是控制雞球蟲病的關(guān)鍵。同所有頂復(fù)門類寄生蟲一樣,頂復(fù)合器是柔嫩艾美耳球蟲入侵宿主細(xì)胞的器官,只形成于子孢子和裂殖子階段。在整個(gè)入侵過程中,頂復(fù)合體分泌一系列與入侵細(xì)胞相關(guān)的因子以發(fā)揮作用,抑制這些入侵相關(guān)因子發(fā)揮功能可有效降低蟲體的入侵率和致病性。因此,雞球蟲的入侵相關(guān)因子通常被作為藥物治療或免疫預(yù)防的靶標(biāo)分子。棒狀體是頂復(fù)合器的重要構(gòu)件,在蟲體入侵宿主細(xì)胞時(shí),棒狀體能夠釋放分泌物,促進(jìn)帶蟲空泡的形成,從而有利于蟲體在宿主細(xì)胞內(nèi)的定居。韓紅玉等應(yīng)用抑制性消減文庫(kù)和cDNA微陣列技術(shù),獲得了一個(gè)柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊和子孢子差異表達(dá)基因的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST),利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapidamplificationofcDNAends,RACE)得到了該基因的全長(zhǎng),經(jīng)序列比對(duì),該基因的編碼產(chǎn)物與剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)的一個(gè)棒狀體蛋白具有28%的同源性,推測(cè)其可能為柔嫩艾美耳球蟲棒狀體組分蛋白,本文暫時(shí)將其命名為EtRP(Eimeriatenellarhoptryprotein)。初步研究表明,在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的EtRP重組蛋白具有較好的免疫原性和對(duì)宿主產(chǎn)生免疫保護(hù)力,可作為雞球蟲基因工程疫苗的候選分子或藥物治療的候選靶標(biāo),因此,有必要對(duì)其功能做進(jìn)一步的研究。單克隆抗體由于其高度的特異性和均質(zhì)性,近年來已被廣泛應(yīng)用于球蟲研究領(lǐng)域,如新基因和新抗原篩選、發(fā)育過程與致病機(jī)理探索、疾病診斷和預(yù)防治療等方面的研究,將之與基因工程技術(shù)、蛋白質(zhì)技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合,更顯示出了強(qiáng)大的功能,是雞球蟲研究領(lǐng)域十分重要的一種工具。為進(jìn)一步探討EtRP在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中的功能及詳細(xì)機(jī)制,本研究以原核表達(dá)的EtRP重組蛋白免疫小鼠,制備了一株抗EtRP的特異性單克隆抗體,并利用該單抗對(duì)EtRP在蟲體上的分布進(jìn)行了定位,可為進(jìn)一步研究提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)材料。1材料和方法1.1小鼠骨髓瘤細(xì)胞重組菌BL21-EtRP為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存;柔嫩艾美耳球蟲蟲株、小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0為本實(shí)驗(yàn)室保存;BALB/c小鼠和昆明系小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2大鼠氨基切髓酸酯t、meg、nf-rog、ntc-羊抗鼠igg、f、hrp-羊抗鼠的igg、fa-rog、igg、f.igaDMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司;胎牛血清、次黃嘌呤(H)氨基喋呤(A)胸腺嘧啶(T)(50×HAT)、PEG-2000、降植烷、HRP-羊抗鼠IgG、FITC-羊抗鼠IgG等購(gòu)自Sigma公司;鼠源McAb亞類鑒定試劑盒購(gòu)自洛陽(yáng)賽爾維生物器材有限公司。1.3etrp重組蛋白的分離純化將保存于-70℃的BL21-EtRP重組菌接種于LB培養(yǎng)基,37℃、200g搖床培養(yǎng)至D600nm值達(dá)0.6,加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6h離心收集菌體。冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞,離心收集包涵體,用含8mol/L尿素的PBS溶解沉淀,經(jīng)透析復(fù)性后,用GST柱純化獲得EtRP重組蛋白,取少量收集液做SDS檢測(cè)。將等體積重組蛋白與弗氏佐劑混合充分乳化用以免疫小鼠,按50μg/只,皮下注射免疫6～8周齡BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,融合前3d腹腔注射加強(qiáng)免疫1次。1.4間接elisa方法的建立采用方陣試驗(yàn)確定抗原最佳包被量、二抗最佳工作濃度和待檢血清最佳稀釋度。1.5elisa法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞的表達(dá)根據(jù)文獻(xiàn)所述方法,無菌摘取小鼠脾臟制備脾細(xì)胞,按4∶1的比例與SP2/0細(xì)胞融合。37℃、5%CO2濃度條件下培養(yǎng),5d后用HAT培養(yǎng)基半量換液,7～10d后換HT培養(yǎng)基。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)至1/10孔底面積時(shí),取上清液用1.4建立的間接ELISA方法檢測(cè),并以免疫小鼠血清做陽(yáng)性對(duì)照,SP2/0細(xì)胞上清做陰性對(duì)照。將檢測(cè)為陽(yáng)性孔的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存,同時(shí)用有限稀釋法亞克隆,經(jīng)2～3次亞克隆,直到檢測(cè)全部孔為陽(yáng)性時(shí),方可確定建株。1.6雜交瘤細(xì)胞接種取10周齡BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL降植烷。1周后腹腔接種無血清培養(yǎng)基懸浮的雜交瘤細(xì)胞懸液,每只0.5mL(5×105個(gè)細(xì)胞)。7～10d后,無菌采集腹水,離心分裝后,置-20℃保存。1.7單克隆抗體特征的測(cè)定1.7.1elisa效價(jià)用間接ELISA法,將抗體做梯度稀釋,陰性血清OD值<0.1,陽(yáng)性血清OD值>1.0,檢測(cè)樣品OD值>0.1,P/N>2(P為樣品OD值,N為陰性對(duì)照OD值)時(shí),抗體的最大稀釋倍數(shù)即為抗體的ELISA效價(jià)。1.7.2mcaga和子分類的鑒定按照洛陽(yáng)賽爾維公司的單抗亞類鑒定試劑盒說明書進(jìn)行。1.7.3免疫組化檢測(cè)將純化的EtRP重組蛋白經(jīng)SDS后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,同時(shí)設(shè)空載體菌為陰性對(duì)照,以2E3腹水為一抗,HRP-羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng),DAB顯色至目的條帶清晰時(shí)水洗終止反應(yīng),觀察結(jié)果。1.8etrp對(duì)子甾的分布1.8.1子芽孢的制備按文獻(xiàn)所述方法制備。取保存于4℃的孢子化卵囊,純化后用研磨器研磨,離心除去卵囊殘壁,用含0.25%胰酶和5%雞膽汁的Hank’s液懸浮,41℃消化30min,離心除去孢子囊壁,再經(jīng)G3漏斗過濾,獲得純凈的子孢子。1.8.2tri能力和pbs/msa的制備將純化的柔嫩艾美耳球蟲子孢子分別用PBS和含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮,41℃孵育1h。利用間接免疫熒光法對(duì)EtRP在子孢子上的分布進(jìn)行定位。方法按文獻(xiàn)所述,將子孢子懸液滴于蓋玻片上,自然風(fēng)干,加2%低聚甲醛室溫固定15min,PBS洗3次;加1%Triton-X-100室溫放置15min,PBS洗3次;用含2%BSA的PBS封閉20min,PBS洗3次;加McAb(200倍稀釋),37℃孵育1h,PBS洗3次;加FITC-羊抗鼠IgG(500倍稀釋),37℃避光孵育1h,TBS洗5次,并在TBS中避光浸泡30min;加約60μL抗熒光淬滅劑,置熒光顯微鏡下觀察并成像。2結(jié)果2.1sds-東南角檢測(cè)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體,破壁離心獲得包涵體蛋白,將包涵體溶解復(fù)性,取GST柱純化后的收集液10μL進(jìn)行SDS檢測(cè),結(jié)果顯示在分子量為81kDa附近有明顯條帶,與預(yù)期結(jié)果一致(如圖1),表明重組蛋白純化成功。2.2血清最佳稀釋度采用方陣試驗(yàn)確定了抗原最佳包被量、二抗最佳工作濃度、待檢血清最佳稀釋度。結(jié)果顯示,抗原稀釋濃度為10μg/mL,最佳包被量為50μL/孔,陽(yáng)性血清500倍稀釋,酶標(biāo)二抗最佳工作濃度為2000倍稀釋。2.3抗瑤艾美耳球蟲etrp蛋白分子的雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建經(jīng)過2次融合,采用間接ELISA篩選,獲得一株抗柔嫩艾美耳球蟲EtRP蛋白分子的雜交瘤細(xì)胞株,命名為2E3。將雜交瘤細(xì)胞腹腔接種小鼠7～10d后無菌采集腹水,離心分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?.4小鼠腸道效價(jià)檢測(cè)用間接ELISA法分別對(duì)2E3雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和小鼠腹水的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定,其效價(jià)分別為雜交瘤細(xì)胞上清1∶40、小鼠腹水1∶2.56×104。單抗亞類鑒定結(jié)果顯示,該單抗為IgG2a亞類。2.5網(wǎng)絡(luò)評(píng)估結(jié)果顯示在分子量約81kDa處有特異性反應(yīng)條帶,進(jìn)一步說明所獲得的單抗為抗EtRP的特異性單克隆抗體(如圖2)。2.6子脂體的制備經(jīng)收集純化獲得了純凈的柔嫩艾美耳球蟲子孢子(如圖3)。2.7高血清學(xué)藥物體中子芽孢桿菌的熒光分布間接熒光法結(jié)果顯示,在PBS懸浮的子孢子頂端有較集中的熒光產(chǎn)生,在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮的子孢子中,熒光分布于整個(gè)蟲體(如圖4)。3抗etrp的動(dòng)態(tài)分布雞球蟲的頂復(fù)合器包括多個(gè)分泌器官,如微線、棒狀體、致密顆粒等,這些器官在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中均發(fā)揮各自特定的作用,研究與入侵相關(guān)蛋白的功能對(duì)揭示球蟲入侵宿主細(xì)胞的機(jī)制至關(guān)重要。EtRP作為一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白分子,在其生物學(xué)功能、蟲體分布都尚未明了的情況下,研制其特異性的單克隆抗體對(duì)于其進(jìn)一步研究十分必要。本實(shí)驗(yàn)室在獲得EtRP蛋白基因全序列的基礎(chǔ)上構(gòu)建了其原核表達(dá)載體,這為本研究的開展奠定了基礎(chǔ)。單克隆抗體制備的關(guān)鍵是有足量、純凈的抗原。本研究以大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白為抗原,優(yōu)點(diǎn)是抗原的獲得簡(jiǎn)單、方便,但在重組蛋白中尚有標(biāo)簽序列沒有除去,可能會(huì)干擾目的雜交瘤細(xì)胞的篩選。對(duì)此,我們?cè)陂g接ELISA篩選時(shí)以子孢子全蛋白為包被抗原,針對(duì)標(biāo)簽序列的雜交瘤細(xì)胞株的顯色反應(yīng)將為陰性,而顯色反應(yīng)為陽(yáng)性的即為針對(duì)EtRP蛋白的雜交瘤細(xì)胞株,這樣就很好地解決了標(biāo)簽蛋白干擾的問題。同時(shí),我們對(duì)融合板的篩選堅(jiān)持分批、多次的原則,即隨時(shí)觀察板孔,只要細(xì)胞團(tuán)塊達(dá)到一定面積即挑出檢測(cè)。這樣既避免了有的孔細(xì)胞生長(zhǎng)過度使?fàn)顟B(tài)惡化,又避免了有的孔細(xì)胞面積較小而出現(xiàn)假陰性。實(shí)驗(yàn)篩選獲得一株抗EtRP的特異性單克隆抗體,并對(duì)該單抗的效價(jià)、亞類與免疫學(xué)活性進(jìn)行初步檢測(cè)與鑒定,為該單抗的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。但該單抗在EtRP上的抗原決定簇位置以及其對(duì)靶標(biāo)抗原功能的中和作用尚未明確,有待進(jìn)一步研究。本文對(duì)EtRP在子孢子中的動(dòng)態(tài)分布做了觀察,從間接免疫熒光結(jié)果來看,EtRP在PBS懸浮的子孢子中集中位于蟲體的頂端,推測(cè)此時(shí)的EtRP可能以一種無活性的前體形式存在,這也進(jìn)一