ccr7對乳腺癌細(xì)胞趨化活性與侵襲活性的影響

ccr7對乳腺癌細(xì)胞趨化活性與侵襲活性的影響

0ccr7在乳腺癌活檢和活檢中的表達許多腫瘤細(xì)胞可以特定地表達一些特征的受體，如csc4、ccr7、ccr10。現(xiàn)在，這些發(fā)現(xiàn)在癌癥器官的異質(zhì)化過程中發(fā)揮了重要作用。其中，ccr7家族成員的slc（二級化療性肝腫瘤）和elc（ebi1-ligadchemarki）在淋巴結(jié)中表現(xiàn)出高度的特異性。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面都有ccr7。研究表明，ccr7的出現(xiàn)與各種腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，包括癌、癌、癌等。然而，如果ccr7也參與了乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的形成，則沒有確定ccr7是否也參與了乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的形成。因此，我們在以外表面檢測了不同乳腺癌細(xì)胞株的ccr7表達，評估了ccr7的出現(xiàn)對外部scl誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的趨勢和入侵的影響，為進一步研究乳腺癌細(xì)胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機制奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1其他逆轉(zhuǎn)錄酶和tt乳腺癌細(xì)胞株MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-361由本室常規(guī)傳代培養(yǎng);TrizolRNA提取試劑盒,購自LifeTechnologies公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶,DTT,DEPC等購自Gibco公司;Oligo-dT15購自Promega公司;TaqDNA聚合酶、dNTPs購自TakaRa公司;人趨化因子SLC由醫(yī)科院腫瘤研究所張叔人教授惠贈;人CCR7mAb購自R&DSystems公司;趨化小室與多聚碳酸酯膜(8.0μm孔徑,25mm×80mm),購自Neutroprobe公司.1.2方法1.2.1逆轉(zhuǎn)錄的制備各取1×106的不同乳腺癌細(xì)胞,按照TrizolRNA提取試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA.取6μg總RNA與0.5μgoligo-dT15混合,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.以其作為模板,PCR擴增CCR7中一大小為530bp的片段.所用的上游引物為5′–TCCTTCTCATCAGCAAGCTGT-3′,下游引物為5′–GAGGCAGCCCAGGTCCTTGAAG-3′.具體反應(yīng)步驟為:37℃1h,72℃5min,完成逆轉(zhuǎn)錄;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,35個循環(huán)完成PCR后,再72℃充分延伸10min.以人Tubulin作為內(nèi)對照,其上游引物為5′-CTCATCACAGGCAAGGAAGAT-3′,下游引物為5′-TTAAGGTAAGTGTAGGTTGGG-3′,大小為410bp.擴增產(chǎn)物進行1.5g/L瓊脂糖凝膠電泳,以各自Tubulin作為內(nèi)對照調(diào)整上樣量,電泳圖像經(jīng)FluorsMulti-Imager凝膠成像掃描儀分析,比較乳腺癌細(xì)胞中CCR7的相對表達量.1.2.2多聚碳酸酯膜的制備采用Boyden趨化小室法體外行趨化活性分析,趨化實驗具體步驟如下:在趨化小室的底孔中,加入27μL含100nmol/LSLC的無血清RPMI1640培養(yǎng)液,同時以無血清RPMI1640培養(yǎng)液作為陰性對照加入底孔中;上面覆蓋8.0μm孔徑的多聚碳酸酯膜,再覆蓋上頂板.在趨化小室頂孔中加入50μL乳腺癌細(xì)胞(1×109/L重懸于無血清RPMI1640培養(yǎng)液中);將整個小室置37℃,50mL/LCO2孵育箱中作用8h.取出多聚碳酸酯膜,刮去上表面殘留的乳腺癌細(xì)胞,將整個膜置于40g/L甲醛中固定,再行姬姆薩染液染色;每組行3個復(fù)孔平行檢測,每個小孔隨機計數(shù)5個高倍視野下遷移至多聚碳酸酯膜背面乳腺癌細(xì)胞的總數(shù),并計算趨化指數(shù)(chemotacticindex,CI),CI=檢測組平均遷移細(xì)胞總數(shù)/陰性對照組平均遷移細(xì)胞總數(shù).1.2.3基質(zhì)膠及其他血管內(nèi)皮功能性狀的檢測仍然采用Boyden趨化小室法體外檢測乳腺癌細(xì)胞的侵襲活性,方法大致同趨化實驗,改動包括:在趨化小室頂孔的多聚碳酸酯膜上預(yù)先鋪入Matrigel基質(zhì)膠(每孔約50μg),并且趨化小室在孵育箱中作用時間延長至20h,每組同樣行3個復(fù)孔平行檢測,每孔隨機計數(shù)5個高倍視野下遷移至多聚碳酸酯膜背面的乳腺癌細(xì)胞總數(shù).以侵襲指數(shù)(invasionindex,II)表示侵襲活性,II=檢測組穿過基質(zhì)膠平均細(xì)胞總數(shù)/陰性對照組穿過基質(zhì)膠平均細(xì)胞總數(shù).1.2.4不同處理乳腺癌細(xì)胞的活性檢測Boyden趨化小室法檢測趨化活性和侵襲活性的具體方法同上,底孔中各加入27μL含100nmol/LSLC的無血清RPMI1640培養(yǎng)液,頂孔中各加入50μL的1×109/L乳腺癌細(xì)胞的無血清RPMI1640培養(yǎng)液,再加入5mg/L的CCR7mAb進行受體封閉(此為處理組,同時以不加CCR7mAb的孔為對照組),每組均行5個復(fù)孔的平行檢測,分別行趨化活性和侵襲活性檢測,并分別計算抑制率.抑制率=(對照組平均遷移細(xì)胞總數(shù)-處理組平均遷移細(xì)胞總數(shù))/對照組平均遷移細(xì)胞總數(shù)×100%.統(tǒng)計學(xué)處理:數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,組間方差齊時采用t檢驗,方差不齊時采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗,統(tǒng)計學(xué)處理均采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行.2結(jié)果2.1ccr7的相對含量乳腺癌細(xì)胞系MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-361中,通過RT-PCR法均能擴增出人Tubulin基因片段和CCR7中選定的基因片段,以Tubulin為參照,比較各株乳腺癌細(xì)胞CCR7的相對含量.結(jié)果發(fā)現(xiàn),3株乳腺癌細(xì)胞均有不同程度CCR7的mRNA表達,其中以MDA-MB-361表達量最高,MDA-MB-231次之,MCF-7表達量最低,三者CCR7相對含量分別為2.54,0.43,0.29(Fig1).2.2ccr7對3種乳腺癌細(xì)胞的趨化活性趨化小室法催化實驗發(fā)現(xiàn):在100nmol/L的SLC作用下,遷移至多聚碳酸酯膜背面的3種乳腺癌細(xì)胞數(shù),均明顯多于各自相應(yīng)的陰性對照組遷移細(xì)胞數(shù)(Tab1).說明CCR7的配體SLC對3種乳腺癌細(xì)胞均有不同程度的趨化活性(Fig2).2.3打造乳腺癌細(xì)胞的擊穿活性同樣選擇100nmol/L濃度的SLC置于趨化小室底孔,行侵襲實驗檢測不同乳腺癌細(xì)胞的侵襲活性.結(jié)果發(fā)現(xiàn):在SLC作用下,3種乳腺癌細(xì)胞均能夠穿透Matrigel基質(zhì)膠到達多聚碳酸酯膜的背面,膜背面細(xì)胞數(shù)均明顯多于相應(yīng)的陰性對照組,說明在SLC作用下3種細(xì)胞均表現(xiàn)出不同程度的侵襲活性(Tab2).2.4ccr7受體的封閉對乳腺癌細(xì)胞slc誘導(dǎo)的控制作用將乳腺癌細(xì)胞經(jīng)CCR7單克隆抗體孵育后,分別檢測CCR7受體的封閉對SLC介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的趨化活性和侵襲活性的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn),CCR7受體的封閉均能不同程度上抑制3種乳腺癌細(xì)胞SLC介導(dǎo)的趨化活性和侵襲活性(Tab3,4).結(jié)果說明,SLC對3種乳腺癌細(xì)胞的趨化活性和侵襲活性都應(yīng)該是通過其受體CCR7介導(dǎo)的.3ccr7是乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的樞紐在生理狀況下,趨化因子及其受體對血細(xì)胞在體內(nèi)的遷移與定位發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用.然而近來研究發(fā)現(xiàn),趨化因子及其受體在惡性腫瘤器官特異性轉(zhuǎn)移中也同樣發(fā)揮關(guān)鍵性作用.一般認(rèn)為,不同的器官由于存在不同的趨化因子,對特異性表達相應(yīng)受體的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生不同的趨化或募集作用,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞選擇性地向相應(yīng)器官轉(zhuǎn)移.其中研究最多的是趨化因子受體CXCR4,它的配體SDF-1在淋巴結(jié)、肺臟、肝臟、骨髓等器官中高表達,腫瘤細(xì)胞表達CXCR4被認(rèn)為與多種惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、以及骨髓轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其中就包括乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等.CCR6的配體CCL20在肝臟高表達,CCR6的表達可以介導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞向肝臟轉(zhuǎn)移;表達CCR10的惡性黑色素瘤可以向表達相應(yīng)配體CTACK的皮膚特異性轉(zhuǎn)移.對于趨化因子受體CCR7,其配體SLC、ELC主要在淋巴結(jié)中特異性高表達,生理狀況下CCR7及其配體介導(dǎo)淋巴細(xì)胞向淋巴結(jié)遷移與歸巢.然而Mashino等研究卻發(fā)現(xiàn),大約2/3的胃癌組織也表達CCR7,并且CCR7的表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān);Takanami研究證實,CCR7的表達是一項與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的小細(xì)胞肺癌的獨立預(yù)后因素,但是在乳腺癌中,尚沒有類似的臨床病理研究證據(jù).我們推測CCR7及其配體可能也參與了乳腺癌細(xì)胞向淋巴結(jié)特異性轉(zhuǎn)移的過程.我們體外研究結(jié)果證實:乳腺癌細(xì)胞系也表達不同程度的CCR7;CCR7的配體SLC在體外可以促進乳腺癌細(xì)胞的趨化與侵襲,并且該兩種活性均可以通過CCR7受體的封閉而被抑制;另外,趨化活性與侵襲活性的強弱與乳腺癌細(xì)胞CCR7的表達水平可能相關(guān),在MDA-MB-361細(xì)胞中CCR7表達高,表現(xiàn)出的趨化活性與侵襲活性也比較強.這些結(jié)果表明,CCR7及其配體促進了乳腺癌細(xì)胞的趨化與侵襲.而趨化活性和侵襲活性正是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的基本特性,CCR7的表達可能就促使了乳腺癌細(xì)胞向表達相應(yīng)配體的淋巴結(jié)特異性轉(zhuǎn)移,當(dāng)然結(jié)論的得出還需要進一步的體內(nèi)研究和臨床證實.我們早期的預(yù)實驗還發(fā)現(xiàn),配體(SLC)的濃度明顯與乳腺癌細(xì)胞的趨化活性和侵襲活性相關(guān),濃度過高或者過低均會影響趨化活性和侵襲活性,理想的SLC濃度是50～500nmol/L.這一現(xiàn)象在SLC對T淋巴細(xì)胞的趨化中已經(jīng)發(fā)現(xiàn),50～500nmol/L的濃度范圍也