大鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)及aadc的免疫學(xué)特性

大鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)及aadc的免疫學(xué)特性

c型腫瘤是一種已知的抗原加工和脫離作用能力最強(qiáng)的獨(dú)特的抗原加工細(xì)胞（apc）。它具有激活復(fù)制和表達(dá)核電站的能力。將抗原信息傳輸?shù)絫細(xì)胞，可以誘導(dǎo)特定的免疫反應(yīng)，這在身體和體液的免疫和體液的免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用，尤其是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。因體內(nèi)DC分散,含量極低,僅占外周血單核細(xì)胞的1%以下,故獲得一定數(shù)量具有功能的DC是深入研究其生物學(xué)特性的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)用含有3種相關(guān)細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系對(duì)大鼠骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),并且用腫瘤細(xì)胞裂解物(TAA)對(duì)未成熟DC進(jìn)行沖擊致敏,獲得TAA/DC,分析對(duì)比DC和TAA/DC的形態(tài)特征及免疫學(xué)特性,旨在獲得能有效發(fā)揮DC抗原提呈能力、增強(qiáng)腫瘤抗原的免疫原性、有效刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性的DC瘤苗,為DC培養(yǎng)方法的選擇及腫瘤疫苗的制備提供有價(jià)值的資料。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1惠贈(zèng)醫(yī)生回血近交系Fischer344大鼠卵巢上皮低分化腺癌細(xì)胞株NuTu-19,由華西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科王和教授惠贈(zèng)。近交系Fischer344雌性清潔級(jí)大鼠,8~10周齡、體重120~150g,購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK-(軍)2002-001。1.1.2血肉蛋白的--重組大鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rrGM-CSF),重組大鼠白細(xì)胞介素-4(rrIL-4),重組大鼠腫瘤壞死因子-α(rrTNF-α),均為R&D公司產(chǎn)品。1.1.3細(xì)胞、肝素、pbs和pb培養(yǎng)液RPMI1640和胎牛血清(FCS)均購(gòu)自Gibco公司;磷酸緩沖液(PBS)和0.05%胰蛋白酶均購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心;淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海試劑二廠;肝素鈉(2ml:12500U)的產(chǎn)品批號(hào)是050509;PE標(biāo)記的抗大鼠抗體及相應(yīng)的同型免疫球蛋白為BioLegend公司產(chǎn)品。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)液-nf-ms法將健康大鼠斷頸處死,四肢備皮消毒,剝凈肌肉組織,無(wú)菌取出雙側(cè)股骨、脛骨、肱骨,剪去骨兩端,用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液分別從骨兩端反復(fù)沖洗出骨髓至骨變白,收入50ml離心管內(nèi)備用(離心管內(nèi)已加入少量肝素鈉抗凝20U/ml)。將骨髓腔沖洗液室溫下離心,1500r/min×10min,沉淀細(xì)胞用5ml無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液重懸,并緩慢加至已有5ml淋巴細(xì)胞分離液的10ml離心管內(nèi),2000r/min×15min進(jìn)行密度梯度離心,初步純化單個(gè)核細(xì)胞(MNC),取界面細(xì)胞,洗滌后,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/ml;加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,并加入rrGM-CSF、rrIL-4、rrTNF-α各8μl(50ng/μl,終濃度40ng/ml),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3天半量換液,加入全量細(xì)胞因子,觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化,第12天收獲懸浮細(xì)胞。1.2.2細(xì)胞裂解物的制備將大鼠卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇與傳代,在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,調(diào)整細(xì)胞濃度1×108個(gè)/ml,反復(fù)凍融,高速離心(4600r/min×30s),上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾,獲得腫瘤細(xì)胞裂解物(tumorassociatedantigen,TAA)。1.2.3taa致敏的dc取培養(yǎng)第5天的未成熟DC,在半量換液,加入全量細(xì)胞因子的同時(shí),以DC與抗原1∶10的比例(抗原的量以?xún)鋈谇澳[瘤細(xì)胞的量計(jì))加入TAA,DC的終濃度為1×107/ml,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng),到第12天收獲TAA致敏的DC:TAA/DC。1.2.4從d、a和d的形態(tài)觀察在細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中,每日將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下,觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化,并照相。1.2.5pe標(biāo)記檢測(cè)大鼠cd98,mhs-、ox62表達(dá)在DC細(xì)胞培養(yǎng)的第3、7、12天及腫瘤細(xì)胞裂解物致敏DC后繼續(xù)培養(yǎng)的第7、12天,分別取1×105個(gè)細(xì)胞,用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD86、MHC-Ⅱ、OX62。具體檢測(cè)方法如下:取3只試管,向第一只實(shí)驗(yàn)管中加入10μlPE標(biāo)記抗大鼠CD86抗體,第二只實(shí)驗(yàn)管中加入10μlPE標(biāo)記抗大鼠MHC-Ⅱ抗體,第三只實(shí)驗(yàn)管中加入10μlPE標(biāo)記抗大鼠OX62抗體。再取一只試管作為對(duì)照,加入等體積PE標(biāo)記的同型抗大鼠IgG,再分別向?qū)嶒?yàn)管及對(duì)照管中加入100μl細(xì)胞懸液,混勻,室溫下避光孵育15min,加入1mlPBS洗1次,避光儲(chǔ)存待測(cè)。用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)管中的CD86、MHC-Ⅱ、OX62的陽(yáng)性率,檢測(cè)標(biāo)本前用BD公司標(biāo)準(zhǔn)Beads校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀,使CV值在2%以?xún)?nèi),檢測(cè)時(shí)每管收集10000個(gè)細(xì)胞。1.3統(tǒng)計(jì)處理所有數(shù)據(jù)用ˉx±sxˉ±s表示,統(tǒng)計(jì)用SPSSforWindowsVer.11.5軟件,采用t檢驗(yàn)及方差分析。2結(jié)果2.1雙軸經(jīng)皮織物的dc形態(tài)以表4從大鼠骨髓中獲得單個(gè)核細(xì)胞,在細(xì)胞培養(yǎng)的第3天,部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),形態(tài)小而圓,邊界光滑,無(wú)樹(shù)枝樣突起,以后逐漸表現(xiàn)為懸浮狀態(tài),表面出現(xiàn)毛刺樣突起,細(xì)胞增大,到第12天,細(xì)胞脫壁、懸浮,表面伸出樹(shù)枝樣突起,散布于培養(yǎng)液中,表現(xiàn)為典型的DC形態(tài)(圖1~4,見(jiàn)封4)。2.2免疫表型檢測(cè)在DC細(xì)胞培養(yǎng)的第3、7、12天,分別取1×105個(gè)細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫表型。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),DC的CD86、MHC-Ⅱ、OX62的表達(dá)水平不斷提高,差異均有極顯著性意義(P<0.01),見(jiàn)表1。2.3不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)taa/dc的免疫表型的影響TAA/DC與DC的細(xì)胞形態(tài)特征無(wú)顯著差異。TAA沖擊致敏未成熟DC后,繼續(xù)培養(yǎng),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),TAA/DC的免疫表型較同期培養(yǎng)的DC顯著增強(qiáng)(均P<0.01),見(jiàn)表2。與同期培養(yǎng)DC比較*P<0.013討論3.1il-4和tnf-的協(xié)同作用DC是具有典型樹(shù)突狀形態(tài),膜表面高表達(dá)MHC-Ⅱ類(lèi)分子,能移行至淋巴器官和刺激初始型T細(xì)胞增殖活化,并具有一些相對(duì)特異性表面標(biāo)志的一類(lèi)細(xì)胞。目前聯(lián)合應(yīng)用GM-CSF、IL-4和TNF-α3種細(xì)胞因子已成為DC培養(yǎng)的基本方案。GM-CSF是維持DC發(fā)育及分化的最根本的細(xì)胞因子,但GM-CSF只能產(chǎn)生少量的DC集落,而聯(lián)合IL-4和(或)TNF-α?xí)r,則產(chǎn)生大量表型及功能均典型的DC。IL-4抑制DC前體細(xì)胞向單核細(xì)胞分化的潛能,并維持DC于未成熟狀態(tài),使其具有很強(qiáng)的處理外源性抗原的能力。TNF-α一方面抑制粒細(xì)胞的產(chǎn)生,另一方面促進(jìn)DC的功能成熟,使DC喪失加工抗原的能力,而具有很強(qiáng)的刺激初始T淋巴細(xì)胞的功能。本實(shí)驗(yàn)用含有GM-CSF、IL-4和TNF-α的培養(yǎng)體系對(duì)大鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng),DC逐漸發(fā)育成熟,到第12天獲得了細(xì)胞形態(tài)及免疫表型均典型的DC。3.2taa/dc與dc融合抑制活性DC腫瘤疫苗是指以各種攜有或能表達(dá)腫瘤抗原成分的物質(zhì)體外專(zhuān)一性地沖擊DC而制成的瘤苗。DC負(fù)載腫瘤抗原信息的方法很多,如:腫瘤特異性多肽負(fù)載DC、腫瘤蛋白抗原負(fù)載DC、腫瘤全細(xì)胞抗原負(fù)載DC、胞外小體(exosomes)負(fù)載DC、基因轉(zhuǎn)染DC、體內(nèi)DC的腫瘤抗原負(fù)載等,各有優(yōu)缺點(diǎn)。由于目前腫瘤特異性抗原或相關(guān)性抗原得到明確鑒定的為數(shù)甚少,因而予以腫瘤細(xì)胞全部抗原信息(如腫瘤細(xì)胞裂解物、腫瘤細(xì)胞提取物、腫瘤細(xì)胞RNA、經(jīng)過(guò)滅活的完整腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞與DC融合負(fù)載抗原)修飾DC,由DC去完成對(duì)抗原的識(shí)別、攝取、加工及呈遞成為必要,可以產(chǎn)生針對(duì)多個(gè)已知或未知的腫瘤相關(guān)抗原的免疫反應(yīng),保證抗腫瘤免疫的全面性和有效性。其中腫瘤細(xì)胞裂解物激勵(lì)DC的方法簡(jiǎn)單,對(duì)設(shè)備要求不高,因而最常使用。本實(shí)驗(yàn)用腫瘤細(xì)胞裂解物沖擊致敏未成熟DC,使細(xì)胞很快趨向成熟