二代測序NGS實驗方案和應(yīng)用

這里為您介紹二代測序的有關(guān)流程和應(yīng)用.之阿布豐王創(chuàng)作時間：七月二十九日隨著人類基因組工程的完畢,對低耗費的測序技術(shù)的需求增進了高通量二代測序技術(shù)的發(fā)展.這些新的測序平臺允許進行高通量測序,含有廣泛的應(yīng)用：全基因組從頭測序或者重測序目的序列重測序轉(zhuǎn)錄組分析微生物組研究基因調(diào)控研究NGS序列

二代測序儀器有諸多個組合,在通量、片段長度、精確度、每一輪測序本錢、每百萬堿基對測序本錢、初始本錢、規(guī)格和技術(shù)方面存在存在不同.

從規(guī)格和初始本錢的角度而言,二代測序儀器可輕松地分類為更窄的范疇,也就是所謂的“臺式測序儀”和高通量儀器.

臺式測序儀使得任何實驗室都能夠像使用real-timePCR同樣,自己進行測序.這些儀器能夠和某些靶標序列富集技術(shù)相結(jié)合,用在某些臨床的應(yīng)用中,其中：選定的靶標基因用于深度分析,以檢測稀有的突變,或者檢測多樣樣本中（例如癌癥樣本）中的突變.現(xiàn)在,這些儀器的通量在10Mb到7.5Gb之間,可是隨著硬件,軟件和試劑的繼續(xù)改善,通量也在穩(wěn)步增加.

高通量測序儀非常適合于年夜量的,基因組范疇的研究,每次測序能測定600Gb的序列.某些這樣的高通量和高精度的平臺,能測定的片段長度相對較短,這對高重復(fù)性的序列和未知基因組的從頭測序就可能成為問題.與此相反,也有某些儀器能測序的片段較長（達成2500bp）,可是其精度和測序能力（90Mb）要低諸多.尚有某些測序能力位于兩者之間的儀器（~800bp,700Mb）.

因此,應(yīng)用決定了哪一種儀器是最適宜的.

有一種新的辦法被稱作“納米孔測序”.這種技術(shù)中,根據(jù)一種DNA鏈通過一種合成的或者卵白納米孔道所引發(fā)的電流的變化,能夠擬定通過這個孔道的堿基.這理論上能夠僅用一步就測序一種完整的染色體,而不需要生成新的DNA鏈.

DNA測序

二代DNA測序的工作流程以下：DNA樣本制備文庫構(gòu)建和驗證文庫分子年夜規(guī)模平行克隆擴增測序

二代測序DNA樣本的質(zhì)量控制

首先,評價基因組DNA的質(zhì)量是非常需要的（完整性和純度）.

凝膠電泳法

基因組DNA的完整性和年夜小,能夠用慣例或者脈沖場瓊脂糖凝膠電泳(PFGE)來檢測.慣例的凝膠電泳的精確度不高,這是由于年夜的DNA分子在凝膠中移動的時候,實質(zhì)上是用一種與尺寸無關(guān)的方式一起移動的.可是,它仍然能夠提供完整性（年夜小范疇）和純度（RNA污染物在凝膠底部形成脫尾條帶）方面的有效信息.因此,它仍然是評價基因組DNA質(zhì)量的有效辦法之一.

注：RNA污染會招致DNA濃度高估,并且克制某些下游步伐.如果能必定有RNA污染,則可使用去DNase的RNaseI處置樣本.

分光光度測定法

分光光度儀在260nm和280nm處讀數(shù)的比例（A260/A280）能夠用來預(yù)計DNA相對某些吸取紫外光的雜質(zhì)（例如卵白）的純度.純潔的DNA的A260/A280比例年夜約為1.7–1.9.

注：想要獲得精確的A260/A280值,需要在弱堿性的緩沖溶液中測定吸光度(例如,10mMTris?Cl,pH7.5).

第二個步伐是測定基因組DNA的濃度.

分光光度法

DNA的濃度能夠通過使用分光光度儀測定其在260nm波長的吸光度來擬定.Nanodrop現(xiàn)在被廣泛使用,由于它需要的樣本量少(1μl),并且使用方便（不需要比色皿）.為了確保成果的可靠性,讀數(shù)應(yīng)當(dāng)在0.1到1.0之間.

注：吸光度測定不能區(qū)別DNA和RNA.RNA污染物會招致DNA濃度高估.可是,純潔RNA的A260/A280比值在2.0左右,而純潔的DNA年夜約為1.8.因此,如果這個值為1.95,那么闡明樣本里面有RNA雜質(zhì).

注：苯酚在270–275nm的波長范疇內(nèi)有最年夜的吸光度,非?？拷贒NA.因此苯酚能提高樣本在260nm附近的吸光度,從而招致高估DNA的產(chǎn)量和純度.

熒光法

熒光法使用熒光染料測定DNA的濃度,含有特異性和敏捷性.Hoechst33258結(jié)合到DNA上后,能增年夜458nm波長附近的發(fā)光強度,除此之外,也能夠使用某些更加敏捷的熒光染料,例如PicoGreen染料.基于PicoGreen染料的實驗,比紫外吸光光度法敏捷10,000倍,而比使用Hoechst33258染料的辦法最少敏捷400倍.和紫外吸光光度法分歧,PicoGreen實驗對雙鏈DNA的選擇性要遠高于RNA和單鏈DNA.

DNA原則品和樣本與熒光染料混合,并且使用熒光計檢測.將樣本的測定成果與原則品的測定成果相比力,以擬定DNA的濃度.

Real-timePCR

能夠使用real-timePCR技術(shù)來測定DNA樣本的數(shù)量和質(zhì)量.多重PCR技術(shù)使用引物集在多個位點擴增分歧年夜小的片段,是檢測DNA損傷和片段化的有效質(zhì)控手段.這類技術(shù)實驗專門測定可經(jīng)PCR擴增,適于二代測序的DNA分子.上述提到的這些慣例辦法,普通不能測定的樣本中擴增獲得的DNA的量,或者會高估了DNA的量.與它們相比,real-timePCR更加合用于預(yù)測DNA樣本與否適合于二代測序.

文庫制備

對年夜大都商業(yè)化的二代測序平臺,使用諸如橋式擴增或者乳液PCR辦法,對文庫中的DNA片段進行克隆擴增,以發(fā)生足夠拷貝數(shù)量的測序模板非常需要.通過將平臺特異性的適配子與感愛好的DNA源（例如基因組DNA、雙鏈cDNA或者PCR擴增子等所發(fā)生的DNA片段）退火,獲得片段文庫.適配子序列的存在,使得我們能夠?qū)ξ膸旆肿舆M行選擇性的克隆擴增.因此,這種辦法不需要像傳統(tǒng)的辦法那樣,在微生物中間體中,對基因組片段進行微生物克隆.另外,適配子序列中,還含有平臺特異性的測序引物的結(jié)合位點.

普通狀況下,一種慣例的DNA文庫構(gòu)建方案涉及四步：片段化DNA對DNA片段進行末端修復(fù)連接適配子序列（不合用于單分子測序）對可選的文庫進行擴增

現(xiàn)在有四種辦法用于發(fā)生基因組DNA碎片：酶消化法、超聲波法、噴霧法和水動力剪切法.這四種辦法都能夠用于文庫構(gòu)建,可是每一種辦法都有其優(yōu)點和局限性.核酸內(nèi)切酶消化的辦法快速并且容易,可是難以精確的控制片段長度的分布.另外這種辦法可能會對基因組DNA的呈遞引入偏倚.另外三種技術(shù)使用物理的辦法將DNA的雙鏈打斷,這種斷裂是隨機的,因此能在文庫中對DNA進行無偏的呈遞.能夠使用瓊脂糖凝膠電泳或者自動化的DNA分析辦法,對DNA片段的尺寸分布進行控制.

片段化DNA之后,需要將DNA修復(fù),發(fā)生5’磷酸化的平末端DNA,方便能夠和測序平臺特異性的適配子相連接.文庫構(gòu)建的效率直接依賴于DNA末端修復(fù)的效率和精確性.

末端修復(fù)混合溶液將5’或者3’的粘性末端轉(zhuǎn)釀成5’磷酸化的平末端DNA.在年夜大都狀況下,末端修復(fù)通過T4DNA聚合酶的5’—3’聚合酶活性和3’—5’的核酸外切酶活性完畢.而T4多聚核苷酸激酶確保平末真?zhèn)€DNA片段5’真?zhèn)€磷酸化,方便進行后續(xù)的適配子連接.

根據(jù)所使用的測序平臺,平末端DNA片段能夠直接與適配子連接,或者需要在其片段的3’端增加一種獨自的突出的腺苷酸A,方便與平臺特異性適配子上突出的胸苷酸T互相配對.普通狀況下,使用Klenow片段（含有最低的3’到5’真?zhèn)€核酸外切酶活性）,或者使用其它含有末端轉(zhuǎn)移酶活性的聚合酶催化這一步伐.

T4DNA連接酶將雙鏈的適配子與文庫片段修復(fù)過的末端相連,然后使用回收反映或者根據(jù)DNA的尺寸,選擇性去除文庫中未連接的適配子和適配子二聚體.年夜小篩選辦法涉及使用瓊脂糖凝膠電泳分離,使用磁珠或者使用高等的基于柱的純化辦法.在連接過程中可能呈現(xiàn)適配子的二聚體,它們會和與適配子連接的文庫片段共同擴增,從而減少測序平臺對真正文庫片段測序的能力并且減少測序的質(zhì)量,因此在測序之前,必需將它們從文庫中除去.某些測序平臺規(guī)定文庫片段的長度分布在比力窄的范疇內(nèi),以獲得最佳的成果,諸多時候,這只能通過去除凝膠電泳上的對應(yīng)的片段條帶實現(xiàn).這種辦法也能夠用來去除適配子二聚體.

完畢這一步伐之后,應(yīng)當(dāng)對DNA片段文庫的質(zhì)量進行檢測,并進行定量檢測.根據(jù)濃度和測序文庫的適配子設(shè)計,既能夠直接稀釋溶液并用于測序,也能夠?qū)ξ膸爝M行選擇性擴增.在文庫擴增階段,使用高保真的DNA聚合酶,合成完整的適配子序列,通過與PCR引物的重疊,用于后續(xù)的克隆擴增和與測序引物結(jié)合,或者提高DNA文庫的產(chǎn)量.為了獲得最佳的文庫擴增成果,規(guī)定DNA聚合酶含有高保真性和最小的序列偏倚.

文庫質(zhì)量評定辦法,拜會NGS文庫質(zhì)控.

為了充沛運用測序能力,分歧樣本獲得的測序文庫能夠放在一起,在同一輪實驗中一同測序.通過將DNA片段與含有分歧特性的適配子相連接,能夠?qū)崿F(xiàn)這一過程,即對每一種樣本使用分歧的短核苷酸序列作為適配子.

有某些其它的辦法能夠用于簡化文庫構(gòu)建.有一種新辦法使用轉(zhuǎn)位酶/DNA的復(fù)合物進行體外轉(zhuǎn)座,方便在同一種試管中同時將DNA片段化并標記表記標幟.通過對所標記表記標幟的DNA片段進行有限次數(shù)的PCR擴增,能夠構(gòu)建完整的測序文庫,這節(jié)省了把持步伐和時間.可是,使用體外轉(zhuǎn)座構(gòu)建的文庫,與傳統(tǒng)辦法構(gòu)建的文庫相比,含有更高的序列偏倚.

NGS文庫質(zhì)控

高質(zhì)量的文庫是勝利進行第二代測序的核心.文庫構(gòu)建涉及復(fù)雜的步伐,例如片段化樣本、修復(fù)末端、將末端腺苷?；?、連接適配子和擴增文庫.根據(jù)使用的平臺和文庫類型,這些步伐也會發(fā)生變動.監(jiān)控每一種步伐非常需要,涉及在片段化樣本之后檢查片段的尺寸,以及連接適配子之后檢查片段的年夜小和濃度.文庫驗證過程中,需要分析文庫中片段的年夜小和數(shù)量,這是質(zhì)控的最后步伐.

評定文庫中片段的年夜小

瓊脂糖和PAGE凝膠電泳是傳統(tǒng)的檢測片段年夜小的辦法,它們比力耗時.

近來,基于微流技術(shù)的電泳或者毛細管電泳越來越廣泛的用于檢測片段的年夜小和濃度.即買即用的芯片和膠盒省去了配備凝膠的步伐,使用方便.它們含有更高的通量,并且省去了諸多的手動把持時間.除此之外,它們的敏捷度更高（對檢測的限制更少）,并且能完全自動化的獲取數(shù)據(jù)和輸出電子化的數(shù)據(jù)資料.這些儀器能同時檢測片段的年夜小和濃度.測定文庫中的片段數(shù)量分光光度法和熒光法拜會分光光度法和熒光法電泳設(shè)備

如前所述,基于微流技術(shù)的電泳和毛細管電泳除提供片段年夜小的信息之外,還提供了定量檢測數(shù)據(jù).可是,電泳、分光光度法和熒光法的一種共同的局限性是,都只檢測總的核苷酸的濃度,而非與適配子連接的分子的濃度.

Real-timePCR

將適配子連接到文庫分子的兩端,使得能夠在平行的PCR擴增步伐中擴增上百萬個自力的DNA分子（乳液PCR或者橋式PCR）.在有些儀器中,乳液PCR能夠?qū)⒁环NDNA分子擴增到數(shù)百萬個相似序列的拷貝,并全都結(jié)合在同一種珠子上.在另一種平臺上,橋式PCR能夠?qū)⒁环NDNA分子轉(zhuǎn)釀成一種涉及相似序列的多個拷貝的DNA簇.因此,兩端連接了適配子的擴增之后的分子,決定了乳液PCR中模板和珠子的比例以及橋式PCR中發(fā)生的最佳DNA簇.

對擴增后的文庫中的分子進行精確的定量檢測,對確保片段的質(zhì)量和高效的獲得數(shù)據(jù)是非常重要的.低估擴增文庫中的分子數(shù)量,會招致混雜的信號以及難以解析的數(shù)據(jù)；相反地,高估分子的數(shù)量會減少結(jié)合模板的珠子或者DNA簇的產(chǎn)量,并且沒有充沛運用測序能力.

Real-timePCR能夠特異性的定量檢測兩端結(jié)合有適配子的DNA分子,因此能夠?qū)U增文庫中的分子進行高度精確的定量檢測.Real-timePCR的敏捷性非常高,能夠?qū)舛确浅５偷奈膸旆肿舆M行定量檢測,即使其濃度低于傳統(tǒng)辦法能夠檢測的閾值.因此,這種辦法能盡量減少對文庫的擴增,減少可能的偏倚.

用于決對定量檢測的數(shù)字PCR

數(shù)字PCR能夠?qū)Χ鷾y序的文庫進行絕對定量檢測,而不需要原則品.這個技術(shù)對文庫進行有限的稀釋,并進行年夜量自力的PCR反映；因此,年夜大都反映沒有模板,獲得陰性的成果.一種獨自的陽性PCR反映統(tǒng)計為一種獨自的模板分子.通過統(tǒng)計全部陽性PCR的數(shù)量,能夠擬定文庫分子的絕對數(shù)目.數(shù)字PCR的重要優(yōu)點在于：單分子的敏感性與PCR擴增的效率無關(guān),由于勝利的擴增被統(tǒng)計為一種分子,而與最后產(chǎn)物的數(shù)量無關(guān)

可是,這種技術(shù)需要特殊的儀器,并且耗費較高,因此尚未廣泛用于文庫定量檢測.

宏基因組學(xué)Metagenomics

DNA測序的應(yīng)用領(lǐng)域之一是宏基因組領(lǐng)域,即從環(huán)境樣本中直接回收的遺傳物質(zhì)的非培養(yǎng)研究.宏基因組學(xué)是指一種環(huán)境樣本中所涉及的全部微生物基因組的功效和序列分析.這個辭匯來源于“meta”（在這里指對基因多樣性的系統(tǒng)性理解）和“genomics”（對一種物種的遺傳物質(zhì)的綜合分析）.

宏基因組不是一種新的學(xué)科,但由于二代測序技術(shù)所帶了的諸多可能性,宏基因組的應(yīng)用經(jīng)歷了巨年夜的提高.

據(jù)預(yù)計,微生物中僅有1%左右是可培養(yǎng)的,因此宏基因組學(xué)的研究能極年夜的拓展我們對環(huán)境的認識.

很數(shù)年以來,“宏基因組”這個辭匯僅與環(huán)境樣本的分析有關(guān),例如,分析從極真?zhèn)€生存環(huán)境下分離獲得的DNA,方便發(fā)現(xiàn)能用于工業(yè)的新的生物催化劑.可是,通量的極年夜提高,以及所耗費的費用和時間的減少,將這個領(lǐng)域的應(yīng)用擴展到了諸多其它方面.

宏基因組學(xué)可分成幾個領(lǐng)域,涉及：

病理基因組學(xué)/感染基因組學(xué)微生物組分析環(huán)境宏基因組學(xué)注：這其實不是全方面的分類,研究者能夠選擇其它的分類原則.

病理基因組學(xué)/感染基因組學(xué)和疾病的診療有關(guān),用于擬定有疾病癥狀的患者體內(nèi)未知的病原體.這普通是極具挑戰(zhàn)性的過程,由于微生物的數(shù)量可能非常少（每毫升血液中年夜概有1–10個細胞）.

與之相反,微生物組分析則涉及到數(shù)量巨年夜的微生物,例如口腔或者直腸拭子中的微生物.此時,我們的目的是分析這些菌群的構(gòu)成.考慮到人體僅涉及1%的人類細胞而其它99%都是微生物細胞,微生物組分析在將來的診療技術(shù)中有潛在的巨年夜應(yīng)用.更多細節(jié),請見人類微生物組工程(.org).

環(huán)境宏基因組學(xué)的目的除涉及傳統(tǒng)的尋找新的生物催化劑之外,還涉及研究和鑒定棲息環(huán)境.

從理論上來講,環(huán)境宏基因組學(xué)有兩種分歧的研究辦法：

全基因組分析：對全部存在的DNA進行測序16S分析：僅對16SrRNADNA進行測序

第一種辦法只是簡樸的對樣本中存在的全部DNA進行測序.這能夠完整地描繪全部呈現(xiàn)過的微生物,并且可能發(fā)現(xiàn)新的酶或者酶家族,以及抗生素的抗性.另首先,這種辦法需要較高的測序能力,因而,相對第二種辦法,其通量較低并且耗費較高.與此有關(guān)的進一步的辦法正在研發(fā).

在宏基因組的應(yīng)用中,普通需要能提供較高的片段長度的測序儀,這是由于普通沒有參考序列可供參考.對16SrRNA分析而言,測序儀的讀長需要覆蓋整個區(qū)域（另請參考二代測序儀）.

RNA測序

RNA測序（RNA-seq）是使用深度測序技術(shù)來碩士物體轉(zhuǎn)錄組的辦法.此辦法在構(gòu)建適宜的文庫之后,對樣本中的RNA直接測序,獲得豐富的數(shù)據(jù)集以進行分析.這項技術(shù)的高敏捷度和高分辨率使得它成為研究整個轉(zhuǎn)錄情形的有價值的工具.數(shù)據(jù)的定量性以及測序技術(shù)的高靜態(tài)范疇使得其對基因體現(xiàn)的分析含有高度的敏捷性.數(shù)據(jù)的單個堿基的分辨率提供了有關(guān)單核苷酸多態(tài)性(SNP)、選擇性剪接、外顯子/內(nèi)含子鴻溝、非翻譯區(qū)及其它元件的具體信息.除此之外,RNA-seq不需要預(yù)先懂得參考序列,這使得從頭的轉(zhuǎn)錄組分析和新的變異體和突變體的檢測成為可能.RNA-seq是研究轉(zhuǎn)錄組的強年夜、革命性辦法,可是使用這種技術(shù)需要非常認真以獲得最高質(zhì)量的數(shù)據(jù).

RNA-seq中需要考慮的因素

第一種需要考慮的因素是樣本富集.總RNA普通只涉及比例極少的編碼RNA或者功效RNA；樣本中年夜部份RNA是核糖體RNA（rRNA：年夜約占到了總RNA的80–90%）和較少的轉(zhuǎn)運RNA(tRNA).為了避免將80–90%的測序資源用在重復(fù)的rRNA序列上,普通在測序之前,需要從樣本中去除rRNA.這普通能夠通過特定的消耗rRNA實現(xiàn),也能夠通過使用寡聚胸腺嘧啶富集技術(shù)選擇性富集PolyA實現(xiàn).消耗rRNA的辦法能夠同時保管編碼RNA和非編碼RNA（一項非常重要的研究內(nèi)容）的信息,而PolyA富集則僅保管了編碼mRNA.PolyA富集可能會丟失落特定的RNA和含有高轉(zhuǎn)換率的RNA.

有某些其它的辦法能夠避免rRNA的影響,例如選擇性降解年夜量轉(zhuǎn)錄物,或者不擴增rRNA的擴增技術(shù).可是這些辦法不像rRNA消耗或者polyA富集那么罕見,并且可能扭曲轉(zhuǎn)錄物表征的正常水平.

另外一種需要考慮的因素是要研究的RNA的年夜小.RNA轉(zhuǎn)錄物跨越比力年夜的年夜小范疇；與慣例的RNA分析相比,關(guān)注小RNA的實驗（例如microRNA或者長度范疇在15–35bp的RNA）,需要特另外純化和文庫構(gòu)建方案.年夜大都其它年夜小的RNA片段能夠同時測序（RNA測序的經(jīng)常使用步伐之一是將RNA分割成普通長度,例如200–300nt長度的片段）.

RNA-seq測序把持步伐

一旦擬定了移除核糖體的辦法和要研究的片段年夜小,就能夠?qū)NA構(gòu)建成一種文庫.對年夜大都測序儀器而言,這涉及首先將RNA打碎成片段,另首先通過逆轉(zhuǎn)錄辦法構(gòu)建雙鏈cDNA.在后續(xù)的文庫構(gòu)建過程中,這些雙鏈的cDNA被當(dāng)作普通的基因組DNA來看待.如果想要保管RNA的直接信息（鏈型）,必需使用修改正的文庫構(gòu)建方案,例如將mRNA與連接適配子直接相連,或者標記表記標幟cDNA的一條鏈方便在測序之前移除.

在進行測序計劃過程中,需要考慮三個重要的因：測序深度、讀長和與否使用雙端測序數(shù)據(jù).測序深度能夠提供RNA轉(zhuǎn)錄物的豐度信息,并且較年夜的測序深度使得對稀有轉(zhuǎn)錄物的檢測更加敏捷.讀長也很重要,由于較長的讀段對檢測剪接事件更加敏捷（內(nèi)含子–外顯子鴻溝,外顯子–外顯子鴻溝）.雙端測序數(shù)據(jù)能提供更多有關(guān)轉(zhuǎn)錄物構(gòu)造的信息,特別是互相分隔的較遠的外顯子.普通而言,從頭分析以及尋找新的構(gòu)造變異規(guī)定較高的測序深度和讀長,并且會得益于雙端測序數(shù)據(jù).典范的測序應(yīng)用涉及100–200M片段,長度為2x50–100bp.與之相反,體現(xiàn)分析得益于較高的測序深度,可是讀長和雙端測序數(shù)據(jù)則對成果的改善作用較小.這方面應(yīng)用的一種典范實驗涉及10–30M片段,讀長為1x35–100bp.

基因調(diào)控研究

二代測序技術(shù)也是研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的強有力的工具.例如ChIP-seq技術(shù)(染色質(zhì)免疫共沉淀測序)能夠用于分析卵白-DNA的互相作用.二代測序技術(shù)也能用于擬定基因組的全局甲基化模式.

ChIP-Seq

染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)是用于研究轉(zhuǎn)錄因子和修飾組卵白基因調(diào)控機制的強年夜、多功效辦法.這種技術(shù)用于擬定活細胞中染色質(zhì)上那些與轉(zhuǎn)錄因子、共調(diào)節(jié)因子、修飾組氨酸、染色質(zhì)重塑卵白或者其它的核因子互相結(jié)合的區(qū)域.

整個把持過程非常耗時,涉及了諸多步伐和變量,每一種步伐都需要研究者根據(jù)自己的模型體系進行優(yōu)化.將細胞與甲醛交聯(lián)之后,將染色質(zhì)中共價相連的基因組DNA和核因子復(fù)合物分離出來,然后通過超聲波處置,剪切成能夠處置的年夜小.抗體與目的核卵白特異性免疫共沉淀時,也將與這些核卵白特異性結(jié)合的基因組DNA也沉淀下來了.去除化學(xué)交聯(lián)并通過核酸純化處置的這些DNA可用于測序、基于微陣列的基因組雜交或者PCR擴增.ChIP與二代測序技術(shù)聯(lián)用（ChIP-Seq）可研究與感愛好卵白相結(jié)合的位點在基因組的范疇內(nèi)的分布.與微陣列分析(ChIP-Chip)相比,ChIP-Seq技術(shù)提供了較高的空間分辨率,靜態(tài)范疇和基因組覆蓋度,因而它對DNA結(jié)合位點的檢測含有超級的敏捷度和精確度.另外,ChIP-Seq技術(shù)普通只要極少的起始樣本輸入量,并且不需要雜交探針,含有較高的靈活性,任何測序過基因組的物種都能夠使用這種辦法進行研究.

高效的ChIP-Seq過程需要優(yōu)化幾個核心的變量.首先,甲醛交聯(lián)的溫度和時間需要優(yōu)化.如果卵白和DNA交聯(lián)的過于緊密,則在測序之前無法將染色質(zhì)有效地打碎成片段,并且去除交聯(lián)也會碰到困難.普通狀況下,最佳以在37°C下與1%的甲醛共哺育10分鐘起始,然后在此基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化.

有幾個分歧的辦法能夠?qū)⑷旧|(zhì)打成碎片,例如超聲波和酶消化（例如使用微球菌核酸酶）.如果使用二代測序技術(shù)來分析免疫共沉淀的DNA,染色質(zhì)碎片的年夜小應(yīng)在年夜約100–300核苷酸長度范疇內(nèi),并且每一種測試系統(tǒng)中（細胞的類型、組織的類型）,將染色質(zhì)打碎成片段的參數(shù)也需要嚴格優(yōu)化.

ChIP實驗的勝利與否取決于所使用的抗體的量和特異性.最佳選用能從多家抗體廠商處獲得的,通過ChIP實驗驗證的抗體.為了擬定抗體能特異性地沉淀目的卵白,能夠使用卵白印跡技術(shù)檢測核提取物.如果在成果中,僅能觀察到一條特定年夜小的條帶,則可認為該抗體是特異性的.使用選定的抗體進行免疫共沉淀,然后通過卵白印跡分析技術(shù)擬定抗體與否能特異性的沉淀目的卵白.如果這樣的實驗失敗了,那么還能夠?qū)⑦x定的抗體與培養(yǎng)的細胞進行免疫熒光實驗.如果僅有細胞核顯色,則闡明抗體最少能特異性的識別一種位于細胞核內(nèi)并可結(jié)合到DNA上面的卵白.

根據(jù)目的卵白的豐度,通過驗證的抗體的量以及用于免疫共沉淀的染色質(zhì)的量必需通過優(yōu)化,方便獲得足夠的DNA進行測序.對識別組卵白和組卵白修飾的抗體而言,每一次免疫共沉淀反映年夜概需要100,000到1百萬個細胞中的染色質(zhì).如果轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的靜態(tài)性較高或者與組卵白相比,僅在有限的基因組位點上結(jié)合,那么實驗就需要更多的染色質(zhì).為避免過剩的抗體與非目的卵白和染色質(zhì)的非特異性結(jié)合,同時確保能沉淀足夠多的目的卵白,每一次免疫共沉淀反映使用的抗體的數(shù)量也非常重要.普通而言,1–10μg的抗體即可獲得合理的成果.

能夠用對比反映來比對ChIP反映的特異性.在平行的ChIP反映中,使用同樣數(shù)量的染色質(zhì),能夠使用同型的對比抗體或者沒有抗體的珠子用來比較抗體和珠子與卵白和染色質(zhì)的非特異性的結(jié)合.通過比力陰性對比樣本和ChIP樣本中在特定位點沉淀的DNA的量,能計算這個位點的富集因子.可是,在這種免疫共沉淀對比實驗中獲得的沉淀物的量普通極少,缺少以提供足夠的片段進行二代測序.因此,ChIP-Seq實驗普通使用輸入對比樣本作比對.在這種狀況下,每個ChIP反映中普通有1%交聯(lián)并且打碎的染色質(zhì)被用來去除交聯(lián)并且與沉淀的樣本一同純化并進行后續(xù)的深度測序.這使得我們能夠比對由于打碎染色質(zhì)所引發(fā)的偏移,這些偏移暗示在染色質(zhì)的局部構(gòu)造,DNA擴增,測序,拷貝數(shù)量的變動,以及測定基因組區(qū)域的能力.

在沉淀的DNA碎片去除交聯(lián)和純化之后,建議使用real-timePCR技術(shù)確認與目的卵白結(jié)合的基因組位點的回收和富集效果.通過比力輸入對比組與