人白介素4ELISA試劑盒說明書

人白介素4（IL-4）酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書廈門慧嘉生物科技有限公司本試劑盒僅供研究使用檢測(cè)范圍：ng/ml-100ng/ml最低檢測(cè)限：ng/ml特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的人IL-4,且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。有效期：6個(gè)月預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中IL-4含量。說明：試劑盒保存：-20°C（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8°C（頻繁使用時(shí)）。濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。概述：白細(xì)胞介素-4（白介素-4,Interleukin-4，IL-4）是II型輔助T細(xì)胞（Th2細(xì)胞）分泌的細(xì)胞因子。白細(xì)胞介素-4的生物作用，包括刺激活化B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖、CD4+T細(xì)胞分化成II型輔助T細(xì)胞。它也在調(diào)節(jié)體液免疫和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用。白細(xì)胞介素-4誘導(dǎo)B細(xì)胞抗體類別轉(zhuǎn)換向IgE，上調(diào)第二型主要組織兼容性復(fù)合體的產(chǎn)生。它最初被認(rèn)為是B淋巴細(xì)胞分化因子（BCDF），同時(shí)也是B淋巴細(xì)胞刺激因子（BSF1）。隨著后來人和鼠IL-4被分子化克隆及表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了IL-4的多種功能作用于B淋巴細(xì)胞及其他造血及非造血細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，肥大細(xì)胞、骨系及紅細(xì)胞系祖細(xì)胞，纖維母細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等。IL-4在體外及體內(nèi)均呈現(xiàn)出抗腫瘤效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)原理：用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗IL-4抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗IL-4抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-4呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制：酶聯(lián)板(Assayplate)： 一塊(96孔)。標(biāo)準(zhǔn)品(Standard)： 2瓶(凍干品)。樣品稀釋液(SampleDiluent): 1x20ml/瓶。生物素標(biāo)記抗體稀釋液(Biotin-antibodyDiluent): 1x10ml/瓶。辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液(HRP-avidinDiluent)： 1x10ml/瓶。生物素標(biāo)記抗體(Biotin-antibody): 1^120^1/瓶(1：100)。辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素(HRP-avidin)： 1^120^1/瓶(1：100)。底物溶液(TMBSubstrate): 1x10ml/瓶。濃洗滌液(WashBuffer)： 1x20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。終止液(StopSolution)： 1x10ml/瓶(2NH2SO4)。需要而未提供的試劑和器材：標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀高速離心機(jī)電熱恒溫培養(yǎng)箱干凈的試管和Eppendof管系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，最好用多通道移液器蒸餾水，容量瓶等標(biāo)本的采集及保存：血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4°C過夜后于1000xg離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20C或-80C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8°C1000xg離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20C或-80C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000xg離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)h或?qū)?biāo)本放于-20C或-80C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。標(biāo)本的稀釋原則：首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。最后計(jì)算濃度時(shí)，稀釋7“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為100ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋100ng/ml,50ng/ml,25ng/ml,ng/mlng/ml,ng/ml,ng/ml.，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制50ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取（不要少于）100ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100^1），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制。如10叫生物素標(biāo)記抗體加990^1生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100^1），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制。如10叫辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990^1辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。操作步驟：實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00叫，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100叫，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37°C反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100^1（取川1生物素標(biāo)記抗體加99^1生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37C,60分鐘。溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200^1/每孔，甩干。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液）100叫，37C，60分鐘。溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200^1/每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90^1，37C避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。依序每孔加終止溶液50^1，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)備注用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8°C保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板方法：手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。注意事項(xiàng)：當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量