鴨兒湖污染區(qū)搖蚊復合組的淀粉凝膠電泳研究

鴨兒湖污染區(qū)搖蚊復合組的淀粉凝膠電泳研究

20世紀60年代，中國廣泛使用了6000多種價光劑，如六六份。據(jù)報道,這些滯留性有機氯污染物能激活生物體內(nèi)的解毒酶系,使多功能氧化酶系(MFO),谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSH)及羧酸酯酶(Carboxylesterase)活力升高,而產(chǎn)生抗性。由高活性的酯酶引起的抗性已經(jīng)在30多種衛(wèi)生害蟲和農(nóng)、牧業(yè)害蟲中研究發(fā)現(xiàn),它是引起蚊蟲對有機磷殺蟲劑產(chǎn)生抗性的主要機制。在大多數(shù)生物中,酯酶的多態(tài)性都很高,庫蚊的酯酶是迄今為止已知的多態(tài)性最高的蛋白之一,同時現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)酯酶多態(tài)性的現(xiàn)象普遍存在于敏感蚊蟲種群中。本研究選擇對鴨兒湖有毒污染物表現(xiàn)出極高的耐受性的搖蚊復合組幼蟲,試圖研究其體內(nèi)是否存在與抗生有關(guān)的酯酶(解毒酶),并從群體遺傳學的角度分析搖蚊復合組酯酶等位點的多態(tài)性。1材料和方法1.1樣品的采集點搖蚊復合組(Chironomuscomplex)幼蟲,采自武漢鴨兒湖中嚴家湖的五個氧化塘的污泥里,選擇三齡—四齡幼蟲共143只(1號塘3只,2號塘77只,3號塘15只,4號塘45只,5號塘3只),-20℃保存待用,樣品采集點如圖1所示。1.2致卷庫蚊seqTem-R系:致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus),酯酶β11的標準品系。1994年采自美國加州野生品系繁衍而來,近來已被證明為酯酶β11過量產(chǎn)生的純合型品系Selax系:致卷庫蚊,酯酶α2/β2的標準品系,來源于美國加州野外有機磷抗性致倦庫蚊種群。以上所有的標準系均系法國科學院科學與進化研究所Raymond惠贈,液氮速凍后,在-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3-甲基-d,fluka,fluka公司水解淀粉(Starchhydrolyzed),法國科學院科學與進化研究所產(chǎn)品,蘋果酸(Malicacid),德國Merck公司產(chǎn)品,固藍RR鹽(FastblueRRsalt),Fluka公司,輔酶Ⅰ(NAD)、輔酶Ⅱ(NADP)、吩嗪甲硫酸(Phenazinemethosulfate,PMS)、氮藍四唑(Tetrazoliumnitroblue,NBT)、噻唑藍(Tetrazoliumsalt,MTT)、磷酸甘油(α-D,L-Glycerophosphate)、瓊脂糖(Ⅱ型)均為Sigma公司產(chǎn)品,Tris,加拿大Sangon有限責任公司產(chǎn)品。1.4苯磺酸鹽系對蚊媒的抑制作用參照Pasteur等方法,采用Tris-Maleate-EDTA(TME)緩沖液系統(tǒng),測定單個搖蚊的酯酶活性。單個搖蚊勻漿后,用WhatmanNo.3制成的沁子沾濕沁子。上樣時沁子的下端要接觸膠模盤,沁子之間約2—3mm,每塊膠要有已知酯酶的蚊蟲沁子作為對照。在TME7.4緩沖液系統(tǒng)下進行水平切片淀粉凝膠電泳,淀粉膠濃度為13.6%,在穩(wěn)壓110V,4℃恒溫下電泳。電泳完畢后,將厚膠切成數(shù)個薄片,移入染色盒進行染色。1.5檢測凝膠的制備蘋果酸脫氫酶(MDHE.C.1.1.1.37),染色前將Tris-A緩沖液(Tris/HCl0.2mol/L-pH8.0),蘋果酸(2mol/L,pH7.0)各2mL,MgCl2(0.5mol/L)0.3mL,NAD2mL混合放在三角瓶中備用。在放有凝膠切片的染色盒中,將備用的混合液再加入NBT1mL,PMS0.3mL,MTT0.5mL混合后,與10mL加熱的1.5%瓊脂糖混合后快速均勻的鋪蓋在凝膠切片上,放在暗處直到譜帶出現(xiàn)。蘋果酸酶(MEE.C.1.1.1.40),染色前將Tris-A(Tris/HCl0.2mol/L-pH8.0)10mL,MgCl2(0.5mol/L)1.5mL,蘋果酸(2mol/L)1mL,NADP0.1mL混合放在三角瓶中備用。在放有凝膠切片的染色盒中,將備用的混合液再加入PMS0.1mL,NBT0.2mL,MTT0.2mL混合后,再與10mL加熱的1.5%的瓊脂糖混合后快速均勻的鋪蓋在凝膠切片上,放在暗處直到譜帶出現(xiàn)。1.6固藍rr-固藍鹽的制備酯酶(ESTE.C.3.1.1.1),在放有凝膠切片的染色盒中加入40mL磷酸-F緩沖液(KH2PO4,0.067mol/L;NaH2PO4,0.034mol/L),2mLα-乙酸萘酯(2%丙酮溶液)和2mLβ-乙酸萘酯(2%丙酮溶液),溫育6min后加入固藍RR鹽100mg繼續(xù)溫育,直到譜帶出現(xiàn)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPDE.C.1.1.1.8),在放有凝膠切片的染色盒中加入Tris-A緩沖液40mL,NAD1mL,a-D,L,磷酸甘油100mg,染色前加NBT1mL,PMS0.5mL,放在暗處直到譜帶出現(xiàn)。凝膠切片出帶清晰后固定風干,記錄結(jié)果。NBT,PMS,MTT,NAD,NADP均為1%水溶液。1.7群體遺傳檢測酶位點的確定是等位酶分析中關(guān)鍵的一步。在淀粉電泳中,當?shù)攘康摩?乙酸萘酯和β-乙酸萘酯存在時,酯酶α優(yōu)先水解α-乙酸萘酯顯紫色,酯酶β優(yōu)先水解β-乙酸萘酯顯藍色。而對每個位點的不同等位基因,則按從陰極到陽極的次序依次用1,2……表示。為了使不同膠上的同一位點的等位基因具有可比性,在每塊膠上都用已知酯酶基因的標準系作標記,并以它為標準算出待測樣品等位基因的遷移率。再用GENEPOP軟件(3.1版)進行有關(guān)的群體遺傳學的檢驗和計算。對少于或等于4個等位基因的位點,哈迪-溫伯格平衡的檢驗是根據(jù)Haldane的正合檢驗法進行的,檢驗的概率值(P)是根據(jù)Louis和Dempster提出的枚舉法計算的;對4個以上的等位基因的情況,用Guo和Thompson的馬可夫鏈法(Markovchainmethod)計算P值的無偏估計值。Fis值的計算是根據(jù)Weir和Cockerham的方法進行的。雜合子過量和不足的檢驗通過正合檢驗法進行。每個位點上種群間的遺傳差異用Fisher的基于列聯(lián)表(R×CContinegencytable)的正合檢驗法進行。所有位點的綜合檢驗是Fisher的方法進行的,Fst則根據(jù)Weir和Cockerham的方法計算。有效遷移個體數(shù)(Nm)則根據(jù)公式Nm=(1/Fst-1)/4,用每個位點上的F-統(tǒng)計量(Fst)計算的。2結(jié)果2.1鴨兒湖搖蚊復組優(yōu)良植株酯酶系統(tǒng)分析以Tem-R系作為酯酶β11的標準,Selax系作為酯酶α2/β2的標準,用淀粉凝膠電泳方法測得鴨兒湖搖蚊復組五個亞種群單個幼蟲的酯酶類型(圖2)。酯酶染色結(jié)果表明:五個氧化塘中的搖蚊復合組幼蟲都存在高活性的β酯酶,其中1號氧化塘與其他四個氧化塘搖蚊復合組幼蟲的β酯酶不同,5號氧化塘的酯酶條帶明顯弱,這與1—5號塘的污染指數(shù)成正相關(guān)。2.2兩組標準系的比較鴨兒湖污染區(qū)搖蚊五個亞種群GPD染色結(jié)果與已報道過的其他蚊蟲GPD染色結(jié)果完全不同:酯酶基因擴增的蚊蟲GPD一般僅有一個基因位點,其電泳遷移率,如圖3中所示的二個標準系的結(jié)果。在污染最重的1號塘GPD沒有表達,5號塘的GPD表達也較弱,2、3號塘GPD位點較為豐富(圖3,2#,3#),2號塘中有的個體出現(xiàn)三個GPD位點,三個中度污染的塘GPD的位點呈多態(tài)現(xiàn)象。2.3基因型的檢測采用GENEPOP軟件(3.1版)共分析了143只搖蚊復合組幼蟲在7個基因位點(Est-1、Est-2、Gpd-1、Gpd-2、Mdh-1、Mdh-2、Me)上的基因型。其中主要分析了2號、3號、4號塘的搖蚊復組幼蟲。2.3.1哈迪-溫伯格平衡種群是否符合哈迪-溫伯格平衡是種群遺傳結(jié)構(gòu)分析的第一步,外界選擇壓力、不同種群的混合或者非隨機交配等因素都可能導致種群偏離哈迪-溫伯格平衡。檢驗表明:所有偏離哈迪-溫伯格平衡的情形都是由亞種群內(nèi)的雜合子不足造成的,(表1)。以2號塘為例,用Levene校正的方法計算雜合子或純合子的期望值也得到了同樣的結(jié)論,(表2)。2.3.2t值的測定種群間的遺傳差異的檢驗常用F統(tǒng)計中的一個統(tǒng)計量Fst值來衡量。本實驗檢測結(jié)果,Fst值在0.0334—0.1026之間遺傳差異不顯著,由此可見,2#、3#、4#塘搖蚊復合組亞種群間基本沒有分化(表3)。2.3.3每一代的棲息地移民數(shù)nm檢測的三個塘中有效遷移個體數(shù)都比較少,表明這三個塘間的基因流動較少(表4)。3搖蚊復合組的污染狀況運用淀粉凝膠電泳對采自鴨兒湖污染區(qū)的搖蚊復合組種群進行研究后,發(fā)現(xiàn)存在高活性的酯酶,但其電泳遷移率與致倦庫蚊Tem-R及Selax標準系蚊蟲遷移率不同,取樣種群中存在兩種β酯酶基因。鴨兒湖尤其嚴家湖1號塘內(nèi)有機氯污染物長期污染作用的結(jié)果,使得搖蚊復合組體內(nèi)產(chǎn)生一種與庫蚊個體內(nèi)檢測不同的高活性β酯酶。有關(guān)鴨兒湖污染區(qū)搖蚊復合組酯酶的特征有待進一步分析,如能將此特殊環(huán)境下選擇出的高活性酯酶克隆,再用于對這些特殊污染物的降解中,則有重大的應(yīng)用價值。搖蚊復合組幼蟲在厭氧污泥中生存的特點,通常被用作污染程度現(xiàn)場監(jiān)測的指示。在嚴家湖這四個污染最嚴重的塘中采得搖蚊復合組個體中,所檢測的七個位點上的基因大多處于純合狀態(tài),由于雜合子不足造成偏離哈迪-溫伯格平衡,在鴨兒湖污染區(qū)中亞種群間的遺傳差異不顯著,基因交流也比較少。雜合子的比率是遺傳多樣性的標志,雜合子的比率高是遺傳多樣性高的標志,因為每一雜合子攜帶不同的等位基因,代