轉(zhuǎn)基因魚外源基因的構(gòu)建

轉(zhuǎn)基因魚外源基因的構(gòu)建

1終止子和反式因子外源基因的構(gòu)建至少需要三個部分：啟動子、目的基因和最終停止子。啟動子是DNA分子上結(jié)合RNA聚合酶并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的區(qū)域,它和增強子(增強轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)構(gòu))一起構(gòu)成基因轉(zhuǎn)錄的順勢結(jié)構(gòu)。終止子是使轉(zhuǎn)錄終止的序列,它構(gòu)成基因轉(zhuǎn)錄的主要反式因子,保證翻譯到適當(dāng)位置停止,以免出現(xiàn)過長的蛋白質(zhì)。順勢作用因子和反式作用因子協(xié)同調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的精確性、靈活性,特別是在細胞生長、發(fā)育、分化過程中起重要的調(diào)控作用。目前還沒有對魚類基因順反因子進行詳細分析的例子,僅限于對鯉魚的β-肌動蛋白、鮭魚的金屬硫蛋白、美洲大綿魚尉及寒帶比目魚的抗凍蛋白等少數(shù)基因的研究。因此,至今轉(zhuǎn)基因魚所采用的啟動子和增強子中很多是來自高等動物或以高等動物為宿主的病毒的啟動子和增強子。生長激素基因和抗凍蛋白基因是當(dāng)前目的基因研究的熱點。終止子的研究至今未見報道。1.1啟動子和強化子1.1.1雞馬魚病毒rsv在基因?qū)媵~類中,采用最廣泛的還是來自高等動物病毒的啟動子和增強子,以魚類細胞為宿主的病毒啟動子和增強子的分析工作幾乎沒有進行,因此挪用高等動物細胞內(nèi)病毒的啟動子和增強子。如SV40(猴病毒40)是感染猿猴的一種病毒,這種病毒的啟動子和增強子在哺乳動物中的應(yīng)用非常廣泛,已在鯉魚的上皮細胞、鮭魚的肝細胞中發(fā)現(xiàn)活性。現(xiàn)正向各種魚類導(dǎo)入,但僅能確認有低水平的表達。RSV是感染雞的一種勞氏肉瘤病毒,在高等動物細胞內(nèi)其啟動子和增強子活性很高,特別是LTR(長末端重復(fù)序列)表達非常強的活性,是在魚類(如金魚、斑馬魚、鮭魚等)中使用最廣泛的啟動子和增強子。腺病毒是感染新生兒的一種皰疹病毒,在斑馬魚細胞內(nèi)這種病毒的啟動子和增強子有活性,在初期胚培養(yǎng)中推算出其活性是RSVLTR(勞氏肉瘤病毒長末端重復(fù)序列)近2倍。SV40的啟動子和增強子與一種病毒的LTR組合的啟動子和增強子在鮭魚的初期胚中也顯示出RSVLTR的2倍活性。1.1.2啟動子和增強子的活性就期望目的基因有較高水平的表達或表達組織特異性、時期特異性來說,一般用來源于宿主細胞的啟動子和增強子是最合適,即對于轉(zhuǎn)基因魚來源于魚類的啟動子和增強子是最合適的?？箖龅鞍资悄蠘O海冰點下棲息魚類具有的蛋白質(zhì),可防止冰點下體液凍結(jié)?？箖龅鞍资窃诟闻K中產(chǎn)生的,在其它魚類(即原先不含抗凍蛋白的魚類)上也被斷定有活性。來源于美洲大綿魚尉、寒帶比目魚的抗凍蛋白的啟動子和增強子的活性也是通過導(dǎo)入其它魚中被發(fā)現(xiàn)的。將寒帶比目魚的抗凍蛋白基因的啟動子和增強子導(dǎo)入大西洋鮭中,抗凍蛋白在大西洋鮭的肝臟中有很強的表達,但這種抗凍蛋白的啟動子和增強子在斑馬魚初期胚的研究中其活性不如RSV的LTR及后文要提到的肽鏈延伸因子,這和抗凍蛋白在肝臟組織特異性表達有關(guān)。金屬硫蛋白是在肝臟中產(chǎn)生的能結(jié)合金屬的蛋白質(zhì),對重金屬有解毒作用。由于這種蛋白質(zhì)的含量隨重金屬的投入而上升,所以可以通過重金屬的投入來誘導(dǎo)外源基因的表達。在鮭魚中分離出2種金屬硫蛋白基因,對其啟動子和增強子的分析正在進行,另外投入鋅可以誘導(dǎo)外源基因在魚胚中的表達。以上的抗凍蛋白和金屬硫蛋白基因是在特定組織的特定條件下表達非常強的基因。另外有些基因能在所有的組織中表達,這些基因被稱為管家基因。如果把管家基因的啟動子和增強子與特定的基因結(jié)合導(dǎo)入魚中,就能在所有的組織中表達。為達此目的,在魚類上采用了來源于肽鏈延伸因子基因的啟動子和增強子。β-肌動蛋白是構(gòu)成細胞骨架的蛋白質(zhì),來自鯉魚的β-肌動蛋白基因的啟動子和增強子已被詳細分析。EF1α是一種合成蛋白質(zhì)必需的肽鏈延伸因子,在真核細胞有較高的活性。大西洋鮭的EF1α在斑馬魚中顯示較高的活性,其活性在下一代仍能被確定。1.1.3熱擊蛋白基因的活性前述的金屬硫蛋白基因的啟動子和增強子首先是在小鼠中發(fā)現(xiàn)的,后來用于金魚、泥鰍、鮭魚、鲇魚及大西洋鮭中,但明確發(fā)現(xiàn)外源基因的例子很少。在鮭魚、大西洋鮭中報道了其活性,但被染色體整合的狀態(tài)尚未發(fā)現(xiàn)。來源于小鼠的熱擊蛋白的啟動子和增強子在斑馬魚的初期胚上顯示出非常高的活性。有人使用小鼠金屬硫蛋白基因的啟動子和增強子在虹鱒的肝臟細胞中表達目的基因的強度只有使用其自身的金屬硫蛋白基因的啟動子和增強子的1/20。另外利用進行轉(zhuǎn)基因時,外源基因不應(yīng)含有病毒的有潛在危害的DNA序列,因此,許多學(xué)者一致強調(diào)構(gòu)建“全魚基因”的重要性和迫切性。1.2特征性基因1.2.1抗氧化劑的篩選對魚類目的基因的研究是從生長激素基因開始的,朱作言首先運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將人的生長激素基因的重組DNA導(dǎo)入魚的受精卵中。隨后在泥鰍、闊尾、鯽魚、縮骨鯽、青魚、虹鱒、溝鯰、羅非魚、鮭魚、魴1等生長激素的導(dǎo)入相繼成功。Zhang通過RSV的LTR向鯉魚導(dǎo)入虹鱒的生長激素互補DNA,生長速度比普通魚類快20%,而且這種特性可以遺傳給下一代。美洲大綿魚尉抗凍蛋白基因的啟動子和增強子連接鮭魚的生長激素互補DNA基因一起導(dǎo)入大西洋鮭,結(jié)果其生長速度比對照組快4～6倍,最高的可達30倍,而且這種大西洋鮭的下一代同樣顯出較高的生長率。由于抗凍蛋白基因的啟動子和增強子在肝臟中活性最高,所以有人開始考察在肝臟中產(chǎn)生的生長激素是否與肝臟中存在生長激素的受體有關(guān)。近來在黑鯛的研究中發(fā)現(xiàn),生長激素不僅可以促進生長,還可以提高魚苗的成活率。1.2.2魚類的抗凍蛋白當(dāng)海水溫度低到冰點以下,很多魚不能生存,而前面介紹的具有抗凍蛋白的魚類卻能生存。如果把這種基因?qū)肫胀ǖ聂~類,使它們在體內(nèi)產(chǎn)生抗凍蛋白,這樣即使在冰點以下也可以養(yǎng)殖普通的魚類。2外源基因的引入2.1微管難以通過外源基因的導(dǎo)入最常用的方法是給魚卵進行顯微注射,即把外源基因吸入玻璃細管內(nèi)在顯微鏡下注入魚卵。斑馬魚、鮭魚、大西洋鮭、鯉魚、美國鲇魚、泥鰍、金魚、鯽魚等均被采用。通常外源基因是在受精卵第一次卵裂前注入胚孔中。可魚類的卵膜非常堅硬,微管難以通過。為克服這一點,Chourrout用金屬針打開孔后,再用玻璃微管進行顯微注射。由于鯉科魚的卵膜易被蛋白質(zhì)分解酶分解,有的研究人員除去卵膜后再進行顯微注射。另外,鮭科魚類的卵膜吸水后開始硬化,在大麻哈魚上可采用剛受精卵膜尚未硬化就進行顯微注射的方法。還有,一些魚類的受精孔容易確定,通過開孔進行顯微注射。近來,Yoshizaki發(fā)現(xiàn)鮭魚的卵在還原型谷胱甘肽溶液中受精能防止卵膜硬化,并找到了非常容易進行顯微注射的方法。Ozato把即將成熟的卵母細胞取出(未受精卵卵膜不硬化),向此卵母細胞進行注射。綜上所述三種顯微注射法為:一是從受精孔將DNA溶液注入卵中,簡稱MP法;二是在受精卵剛受精后卵殼尚未變硬時直接注射,簡稱EI法;三是用金屬針在卵殼上打一個孔,再進行顯微注射,簡稱LI法。2.2電脈沖增長法外源基因法所謂電穿孔法,是在細胞DNA的混合液中加入電脈沖,使細胞膜臨時被破壞,這樣細胞外存在的DNA分子既可流入細胞內(nèi)。這種方法本來只用于細胞培養(yǎng)方面的技術(shù),可是用于混有精子、卵子的DNA溶液中,也可以得到導(dǎo)入外源基因的魚。此法用于斑馬魚、美國大麻哈魚、鯉魚、泥鰍的受精卵及斑馬魚、大麻哈魚的精子,成功地把外源基因?qū)媵~內(nèi),該方法具有能輕易處理大量精子和卵子的優(yōu)點,但存在著外源基因?qū)肼实陀陲@微注射的問題?？捎械膱蟮繮CR法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測電脈沖法導(dǎo)入外源基因的大麻哈魚是否存在外源基因時,結(jié)果全部個體均被檢出外源基因,這個高導(dǎo)入率可能與PCR的經(jīng)驗靈敏度非常高有關(guān)。也就是說,由于電脈沖法很難像顯微注射法那樣向細胞內(nèi)導(dǎo)入同樣多的外源基因,所以認為每個細胞所含外源基因的拷貝數(shù)要比注射法所得到的拷貝數(shù)低一些。同樣理由可以推測,電穿孔法得到的個體是含外源基因極低的嵌合體。2.3細胞外源基因的應(yīng)用基因槍注射法是通過把吸附DNA的金屬微粒高速打入細胞內(nèi),使基因?qū)爰毎麅?nèi)的方法。有人在泥鰍、斑馬魚、鮭魚的三日胚上應(yīng)用此法,結(jié)果70%的個體生存,一部分個體導(dǎo)入了外源基因。此法不僅容易進行,而且有短期可處理多個個體的優(yōu)點,只是現(xiàn)在的報道太少,有待今后研究。2.4有嚴格的宿主基因此類病毒是RNA病毒的一種,進入宿主后從RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA,并結(jié)合到宿主細胞的染色體上,從這種納入病毒基因組的細胞產(chǎn)生的細胞染色體內(nèi)就存在了病毒基因。如果把目的基因組合到病毒染色體上,用改造的病毒侵染宿主細胞就有可能向細胞內(nèi)導(dǎo)入外源基因,但轉(zhuǎn)基因病毒有嚴格的宿主特異性,而且魚類轉(zhuǎn)基因病毒的分析非常落后,對于魚類很難適應(yīng)此法。有人用能廣泛感染宿主的VSV(水皰性口炎病毒)的G-蛋白組合的病毒感染斑馬魚的胚,表明外源基因不僅可以導(dǎo)入魚內(nèi),而且還有外源基因?qū)霑r很少改變的優(yōu)點。2.5把cat鏈霉素轉(zhuǎn)移酶注射到肌肉中有報道外源基因向體組織直接注射時,周圍細胞把外源基因納入,并且發(fā)現(xiàn)了那種外源基因。有人把CAT(鏈霉素轉(zhuǎn)移酶基因)注射到一些魚的體側(cè)肌肉上,從肌肉勻漿中檢出CAT活性。另一方面,把含有合成黑色素的互補DNA質(zhì)粒注射到一些魚的體側(cè)肌肉上,使周圍體表合成黑色素,體表黑化。這種方法能非常容易地把外源基因?qū)爰毎麅?nèi),所以對檢出外源基因啟動子非常有效。2.6電脈沖流量最近,有人報道把脫水的精子懸浮于低濃度的DNA溶液中,在細胞外液流入最旺時加入電脈沖,細胞外DNA向精子內(nèi)流動效率提高。另外,精子與DNA共培養(yǎng),使一部分精子獲得外源基因,并且DNA與精子的結(jié)合效率較高,但有必要探討導(dǎo)入率及重復(fù)性。3外源基因的發(fā)現(xiàn)關(guān)于快速生長轉(zhuǎn)基因魚的表達、產(chǎn)生方法和機制,朱作言已做了詳細的研究。筆者只介紹一下外源基因的表達模式及標(biāo)記基因。3.1斑馬魚染色體整合的基因表達向魚卵導(dǎo)入外源基因,被宿主染色體整合,同時其表達模式在初期發(fā)育中也有很大幅度的變化。向鮭魚內(nèi)導(dǎo)入RSVCAT(勞氏肉瘤病毒氯霉素轉(zhuǎn)移酶基因),囊胚期以前的時期未能全部確認,可在囊胚期開始至發(fā)眼期為止,發(fā)現(xiàn)有高水平的表達,孵化期表達量開始下降?？箖龅鞍谆虻膯幼雍驮鰪娮踊钚栽诎l(fā)眼期前后開始上升,而在孵化期下降。β-肌動蛋白的啟動子和增強子在受精后3～5d顯示出高活性,其后急劇減少。如上所述,由于所采用的啟動子和增強子或宿主的不同,其表達模式有所差異,但均在孵化期前后表達量減少。因此,可以推測在初期胚過程中暫時表達的基因是未被染色體整合的外源基因,當(dāng)外源基因被分解排除后,表達量就急劇減少。但在鮭魚的每一個細胞DNA量非常少的12d胚中,在發(fā)眼期也有外源基因的高度表達,與此時期RSVLTR活性化起作用有關(guān)。向鮭魚內(nèi)導(dǎo)入RSVCAT,受精后70d開始看到被染色體結(jié)合的基因得到表達,從其個體得到下一代個體的一部分也表達了RSVCAT。在鯉魚中導(dǎo)入RSV的LTR生長激素互補DNA及在大麻哈魚中導(dǎo)入抗凍蛋白基因,均在下一代表達。大西洋鮭的肽鏈延伸因子的啟動子和增強子被斑馬魚的染色體整合后,在下一代中也顯示出較高活性。被染色體整合的外源基因因結(jié)合位置的不同,其表達受到很大影響,這種現(xiàn)象被稱為位置效應(yīng)。被整合的外源基因的表達受到附近基因的促進或抑制,特別是導(dǎo)入的啟動子和增強子活性弱時,其影響更顯著。今后,應(yīng)重點開發(fā)被染色體整合的也能高水平正確表達的啟動子和增強子。3.2熒光蛋白基因的植入如上所述,采用各種魚進行外源基因的表達研究,從復(fù)制水平上分析,通常采用探針雜交技術(shù);在蛋白質(zhì)水平上,是用抗體和抗原特異結(jié)合的特性來進行分析。可是這些方法測定時間長,操作繁瑣,低水平表達的基因很難檢出。于是在檢測外源基因的表達時多采用標(biāo)記基因,能高靈敏度檢出轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)物的基因。由于所有的標(biāo)記基因都是編碼酶的蛋白質(zhì),所以把蛋白質(zhì)加入組織提取液或組織中就能檢出其酶的活性,隨著酶反應(yīng)時間的延長來提高檢驗的靈敏度,特別是在新啟動子和增強子開放領(lǐng)域內(nèi),本方法是必不可少的技術(shù)。對轉(zhuǎn)基因魚來說,CAT基因、β-半乳糖苷酶基因以及熒光素酶基因多被采用。無論采用那種酶都能高靈敏度地、簡便地檢出表達基因。乳糖苷酶在組織切片上也能使表達組織著色,而且在魚類的胚原封不動的情況下也能檢出其活性,因而這種方法最適合外源基因在每個組織中的表達分析。熒光素酶是促進組織提取液同熒光素發(fā)生反應(yīng)的酶。小林修一把GFP(綠色