放射毛霉液體培養(yǎng)條件研究

放射毛霉液體培養(yǎng)條件研究

優(yōu)雅輻射布雷因as3.2278是優(yōu)良的腐殖樹種，在培養(yǎng)獨(dú)特的口感方面發(fā)揮著非常重要的作用（王瑞志，1998），但國內(nèi)外的研究主要集中在細(xì)菌育種和固體培養(yǎng)的生理特性上（尹廣林，1992）。目前尚未見到有關(guān)其液體培養(yǎng)及其藥理活性的報(bào)道，將液體毛霉菌種應(yīng)用于腐乳生產(chǎn)的研究也為空白。為了改進(jìn)腐乳生產(chǎn)中菌種制作的傳統(tǒng)工藝，將現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)應(yīng)用于腐乳生產(chǎn)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)腐乳生產(chǎn)工藝的自動(dòng)化、規(guī)?；?，提高腐乳產(chǎn)品的質(zhì)量，作者進(jìn)行了毛霉AS3.2778的液體深層培養(yǎng)和工業(yè)規(guī)模發(fā)酵研究及其在腐乳生產(chǎn)上的應(yīng)用。液體發(fā)酵制種工藝具有生產(chǎn)過程機(jī)械化程度高、發(fā)酵周期短、勞動(dòng)生產(chǎn)率高、菌種純度高等許多優(yōu)點(diǎn)。其多糖的抗氧化活性研究，為進(jìn)一步認(rèn)識與利用微生物寶庫提供了技術(shù)儲(chǔ)備。以現(xiàn)代生物工程技術(shù)改造傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)對我國相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展必將起到極好的促進(jìn)作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗(yàn)中的菌株1.1.21.2方法1.2.1發(fā)酵培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在以前研究的基礎(chǔ)上（王麗英等，2001），發(fā)酵培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)按L9(34)設(shè)計(jì)三水平四因素實(shí)驗(yàn)（見表1）,9個(gè)組合，3次重復(fù)。采用250mL搖瓶置旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)。1.2.2根據(jù)每處理?xiàng)l件觀察ph值最佳發(fā)酵溫度試驗(yàn)設(shè)計(jì)了25、28和30℃三組對比；滅菌前培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)到3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0,每處理3個(gè)重復(fù)，搖瓶培養(yǎng)64h后，觀察pH值的變化；在500mL三角瓶中分別裝入50、100、150、200、250、300mL的培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，考察通氣量對菌株的影響。1.2.3罐菌液培養(yǎng)發(fā)酵罐空消121℃30min,配料進(jìn)罐，實(shí)消121℃30min后，冷卻至30℃?；鹧娼臃N法將搖瓶液體種接入種子罐，接種量7%，發(fā)酵溫度為(28±1)℃,消泡劑0.03%，通氣體積比前期（0h～10h）為1:0.8,10h后為1:1.5～1:2.0，罐壓0.05～0.07Mpa，全程不攪拌培養(yǎng)18～20h。放罐菌液經(jīng)膠體磨粉碎處理后，管道噴霧接種，在豆腐坯前、后、左、右、上五面均勻噴灑，22～26℃培養(yǎng)，以傳統(tǒng)茄形瓶菌種為對照。工藝員感官檢測。1.2.4生物量以80目銅絲網(wǎng)過濾稱重測定菌絲體鮮重。水洗菌絲體，置烘箱中80℃烘至恒重后稱量測定菌絲體干重。1.2.5ph測量1.2.6糖原測試1.2.7氨基酸試驗(yàn)1.2.8制備沉淀、沉淀、研磨菌絲體過濾，水洗勻漿，加10倍體積水，100℃提取3h，離心收集上清液，沉淀再以8倍量水重復(fù)提取2次，合并上清液后濃縮至原體積1/5,Sevag法除蛋白兩次，加入酒精并混勻使乙醇終濃度為70%，離心收集沉淀，用無水乙醇、丙酮依次洗滌所得沉淀，干燥后研磨即得。1.2.9免疫調(diào)節(jié)作用檢驗(yàn)按照衛(wèi)生部保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）開展免疫調(diào)節(jié)作用檢驗(yàn)。以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞試驗(yàn)及遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行，試驗(yàn)動(dòng)物為昆明種小鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)基濃度對毛霉蛋白酶活力的影響由表2可知，影響菌絲生長量最顯著的因子為黃豆粉，其次為飴糖、無機(jī)鹽、酵母膏。由表3可以看出，在此培養(yǎng)基成分及濃度范圍內(nèi)，影響毛霉蛋白酶活力最主要的因素是飴糖，其次是無機(jī)鹽。根據(jù)對其發(fā)酵周期、生長狀況、蛋白酶活性的綜合分析選定最適培養(yǎng)基為黃豆粉3%、飴糖0.5%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.2%、酵母膏0.1%。2.2不同培養(yǎng)條件對病原菌生長和酵母菌培養(yǎng)的影響見表1在溫度梯度對比試驗(yàn)中，28℃發(fā)酵溫度優(yōu)于其它溫度,為發(fā)酵最適溫度。雅致放射毛霉在pH5.0～13.0范圍的液體培養(yǎng)基內(nèi)均可生長，以6.0～7.0為適。在100mL/500mL的通氣量下組菌絲產(chǎn)量最高，說明菌絲體生長需要較高通氣量，這與多種絲狀真菌液體培養(yǎng)情況相同（王謙等，1999；龔建華和王義軍，2002）；與機(jī)械攪拌發(fā)酵罐相比，氣升式發(fā)酵罐具有結(jié)構(gòu)簡單、加工安裝方便、密封性能好、雜菌污染機(jī)會(huì)小、氧傳質(zhì)效率高、功率消耗低等特點(diǎn),且對微生物沒有剪切破壞作用（Bello等，1985；張文會(huì)和高孔榮，1993），該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)將另文報(bào)道。2.3膜過濾放罐出現(xiàn)鮮重在全程不用攪拌培養(yǎng)至18h～20h，生物量達(dá)30g/mL(鮮重)以上，符合應(yīng)用要求，經(jīng)鏡檢合格后放罐。放罐醪液菌絲體白色，棉絮狀或成球，有特殊香氣，菌絲體氨基酸構(gòu)成及成分如表4所示。2.4做好稀釋度的控制液體種子在豆腐坯上生長都很均勻，生長速度都較原工藝種液快，突出體現(xiàn)在無論稀釋度大小，在24小時(shí)的菌絲都明顯比生產(chǎn)種長。只是當(dāng)稀釋度較高時(shí)，菌絲在豆坯上的生長較為稀疏，不能形成與生產(chǎn)用種同樣相當(dāng)?shù)闹旅芎駥?shí)的皮膜，當(dāng)稀釋度控制在4倍時(shí)，基本上與原工藝種液是相當(dāng)?shù)?。?dāng)稀釋度小于4倍時(shí)，要較原工藝種液為佳。稀釋度的大小與菌體的濃度是密切相關(guān)的，多次試驗(yàn)表明，當(dāng)菌絲體濕重在25g/100mL左右時(shí)都可以得到同樣的結(jié)果。發(fā)酵液在豆腐坯上的應(yīng)用結(jié)果表明16h、20h、24h液體種在豆腐坯上都可以很好發(fā)酵，效果比原工藝種液效果好，可以使腐乳前發(fā)酵周期提前6h～8h，而且形成的菌膜更為致密厚實(shí)。2.5免疫調(diào)節(jié)效果測試2.5.1兩組臨床療效對比由表5可知，雅致放射毛霉多糖免疫調(diào)節(jié)作用效果隨濃度增加而加大，其中，20mL/kg和50mL/kg劑量與對照組相比達(dá)到顯著差異（P>0.05）和極顯著差異水平（P<0.01）。2.5.2晚發(fā)生動(dòng)物變態(tài)試驗(yàn)：結(jié)果如表6所示結(jié)果表明，雅致放射毛霉多糖可增加小鼠耳腫脹度，其中50mL/kg劑量達(dá)到極顯著水平（P<0.01），證明其可提高小鼠細(xì)胞免疫功能。3有關(guān)活性化合物的活性成分研究在本項(xiàng)目條件下，雅致放射毛霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)可良好實(shí)現(xiàn)。檢驗(yàn)合格的發(fā)酵液作為液體菌種完全可以取代傳統(tǒng)工藝，可以在生產(chǎn)上得到很好的應(yīng)用。多糖的免疫調(diào)節(jié)作用檢驗(yàn)表明，雅致放射毛霉多糖具有一定的增強(qiáng)免疫力作用，具有進(jìn)一步開發(fā)利用前景。雅致放射毛霉ActinomucorelegansAS3.2778菌株由北京王致和食品集團(tuán)提供，4℃冰箱保藏，6個(gè)月轉(zhuǎn)管