蘋果黑星病菌遺傳多樣性的ssr分析

蘋果黑星病菌遺傳多樣性的ssr分析

黑蘋果病（monteithianmedicalcenter）也被稱為黑斑病，發(fā)生在世界各國的蘋果生產區(qū)。雖然它在中國是一個內部測試對象，但它顯示出逐年惡化和蔓延的趨勢，并嚴重威脅著中國蘋果行業(yè)的發(fā)展。因此,研究蘋果黑星病的遺傳規(guī)律對我國蘋果病害防治措施的制定具有重要的意義。種植抗病性品種是目前預防蘋果黑星病的重要手段之一。篩選鑒別寄主,通過鑒別寄主鑒定菌株的生理小種,對毒性生理小種進行風險評估,培育有持久抗病性的寄主品種是抗病育種的前提和基礎。通過研究蘋果黑星病菌的遺傳多樣性,可以了解不同菌株的親緣關系,明確菌株的來源、變異方式及變異程度等,從而為抗病育種提供參考依據。Isabel等用RAPD分子標記方法,對來源于瑞士不同地區(qū)的4個蘋果黑星病菌菌株進行了遺傳多樣性分析,結果表明其遺傳差異很小,說明在當?shù)卮嬖谥扇藶榛顒佣鸬暮芨咚降幕蛄鲃?。隨后Isabel等又用RAPD分子標記方法,對來源于歐洲5個不同國家的11個蘋果黑星病菌菌株的遺傳多樣性進行了研究,表明歐洲存在著高頻率的短距離基因流動,抑制了自然發(fā)生的遺傳變異,但在阿爾卑斯山脈南北兩側的菌種種群間存在著顯著差異,提示由距離造成的自然發(fā)生的遺傳變異還是存在的。這些研究說明,蘋果黑星病菌變異較快,且易受人為活動的影響,但顯著不同地理生境來源的菌株可能存在一定的基因多樣性,而這種多樣性正是蘋果抗病育種中需要加以利用的。因此,研究蘋果黑星病病菌的基因多樣性,對指導蘋果抗病育種具有十分重要的實際意義。SSR(Simplesequencerepeats,簡單序列重復)標記是指由2～6個堿基組成的基本序列,經串聯(lián)重復后組成的短片段,為共顯性標記。由于SSR標記技術具有簡單、快速、穩(wěn)定性好和等位位點多態(tài)性高等特點,其在基因組研究中作為一種主要的分子標記技術,已經在遺傳圖譜的構建、比較基因組研究、遺傳多樣性分析和系統(tǒng)學研究中得到廣泛應用。本研究應用SSR分子標記,對來自英國和法國7個生理小種的20個蘋果黑星病菌菌株的遺傳多樣性進行了分析,以期了解其分子水平的遺傳差異與生理小種和地理來源之間的關系,為蘋果抗病育種提供參考依據。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1細培養(yǎng)物英、法兩國共7個生理小種的20個蘋果黑星病菌的單孢分離純培養(yǎng)物(表1),均由英國國際園藝研究所(HorticultureResearchInternational,U.K)徐向明博士和DezBarbara博士提供。1.1.2其他材料和序列5對引物525/526、527/528、529/530、531/532和533/534序列均由英國國際園藝研究所徐向明博士提供,詳見表2。所有引物均由上海生工生物工程技術有限公司合成。1.2測試方法1.2.1dna的提取將冰箱中保存的蘋果黑星病菌菌株轉接到PS液體培養(yǎng)基上,于18℃、120r/min的搖床上暗培養(yǎng)40d,菌絲過濾后用HETO型真空冷凍干燥濃縮系統(tǒng)(FD-1Heto-HoltenA/S)凍干24h,采用胡小平等改進的SDS法提取各菌株基因組DNA。用756PC型紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司)檢測DNA濃度,同時在10g/L瓊脂糖凝膠上檢測DNA質量,并根據檢測結果將DNA稀釋成2ng/μL的工作液。1.2.2utaqcda聚合酶基因表達所用PCR儀為MJResearch公司生產的9700型梯度熱循環(huán)儀。擴增反應體系參照董艷玲等的優(yōu)化體系:總體積25μL,包括10×Buffer2.5μL,20mmol/LMgCl22μL,100μmol/LdNTP0.25μL,0.5μmol/L引物1.25μL,1.5UTaqDNA聚合酶0.3μL,2mg/LDNA模板1μL,ddH2O17.7μL。擴增條件:93℃變性2min,57℃退火30s,循環(huán)1次;93℃變性30s,57℃退火30s,72℃延伸1min,循環(huán)40次;72℃延伸10min。反應結束后在每管擴增產物中加入8μLLoadingBuffer,用30g/L瓊脂糖凝膠在1×TAE緩沖液中100V恒壓電泳1h,溴化乙錠染色后,凝膠成像系統(tǒng)(Dolphin-DocWealTec)觀察并照相。1.3菌株間的遺傳相似系數(shù)和gs(1)SSR擴增帶形以0,1和9統(tǒng)計,即在相同遷移率位置上,有帶記為“1”,無帶記為“0”,缺失記為“9”,建立數(shù)據庫。(2)按Senior等提供的公式計算每個SSR位點的多態(tài)性信息含量(PolymorphicInformationContent,簡稱PIC),即PIC=1-S(fi2),其中fi為i位點的基因頻率。(3)按Nei等的方法計算菌株間的遺傳相似系數(shù)(GS)。計算公式為:GS=2Nij/(Ni+Nj),其中Nij為材料i和j共有的擴增片段數(shù)目,Ni為材料i中出現(xiàn)的擴增片段數(shù)目,Nj為材料j中出現(xiàn)的擴增片段數(shù)目。根據GS值,按不加權成對群算術平均法(UPGMA)進行遺傳相似性聚類,利用NTSYS-PC(Version2.10e)遺傳分析軟件進行數(shù)據處理。2結果與分析2.1光光度計檢測提取20株供試菌株的基因組DNA,經紫外分光光度計測定,DNA質量濃度的平均值為0.550μg/μL,A260/A280的平均值為1.83,DNA質量滿足后續(xù)試驗要求。2.2ssr標記多態(tài)性及其重要性分析利用表2中的5對SSR引物對供試的20個蘋果黑星病菌株進行擴增,共檢測到43個等位變異,平均每對引物為8.6個。位點數(shù)、擴增片段大小和多態(tài)性信息含量(PIC)的分析計算結果見表3。由表3可見,529/530和533/534標記的多態(tài)性位點數(shù)均高達11個,說明SSR標記在蘋果黑星病菌中具有較高的多態(tài)性。每個位點的擴增片段大小為105～373bp;每個SSR位點的多態(tài)性信息含量為0.76～0.90,平均為0.85,以引物525/526的PIC值最高(0.90),以引物527/528的PIC值最低(0.76)。2.3蘋果黑星病菌ssr的相似性分析利用NTSYS-PC(Version2.10e)遺傳分析軟件,根據SSR標記數(shù)據計算蘋果黑星病菌菌株間的SSR遺傳相似系數(shù)(GS),結果發(fā)現(xiàn),其變異范圍為0.72～1.00,平均值為0.85。其中6和14號菌株間的遺傳相似系數(shù)最低(0.72),而8和9號菌株間的遺傳相似系數(shù)最高(1.00),表明不同菌株間遺傳差異較小。2.4菌株分類及視角利用NTSYS-PC(Version2.10e)遺傳分析軟件得到樹狀聚類分析圖(圖1)。由圖1可見,在遺傳相似系數(shù)為0.77的水平上,20個蘋果黑星病菌株可分為兩大類。第一大類包括1和12～20號菌株,其中1號菌株來源于英國,12～20號菌株來源于法國。第二大類包括2～11號菌株,其中2～5號菌株來源于英國,6～11號菌株來源于法國。兩大類并未將來源于英國和法國的菌株嚴格區(qū)分開來。由表1黑星病菌的生理小種及其在圖1中的分布可見,7個生理小種對應的菌株1,2,3,4,5～8,9～14和15～20,并沒有嚴格分為7類,說明對于這20株蘋果黑星病菌而言,其分子鑒定結果與鑒別寄主鑒定結果間存在一定的差異。3ssr標記的多態(tài)性本研究結果顯示,供試20株蘋果黑星病菌株在遺傳相似系數(shù)為0.77時才能分開,首先說明其遺傳相似性較高,基因多樣性較低。從其遺傳多樣性和地理來源之間的關系來看,在遺傳相似系數(shù)最低(0.77)即遺傳相似性最小時,也未將來源于英國和法國的菌株嚴格區(qū)分開來。由菌株的提供者得知,20株菌株的采集地點位于英法兩國數(shù)個不同的丘陵、盆地及平原地區(qū),可以代表英法兩國的地理特征,說明在英法兩國的蘋果黑星病菌之間,確實存在著高水平的基因流動。英法兩國雖隔海相望,但交流密切,所以病菌間的基因流動很可能是帶病苗木通過海底高速列車或飛機等交通工具的運輸完成的,是人為原因造成的,而這種基因流動抑制了病菌自然發(fā)生的遺傳差異。又因為兩國同屬阿爾卑斯山脈以北地區(qū),不能驗證該山脈南北兩側的菌種種群間是否存在顯著的遺傳多樣性。這些與Isabel等的研究結果相似。由于已按照傳統(tǒng)生物學方法將供試的20株蘋果黑星病菌分為7個生理小種,本試驗的初衷之一就是驗證這20株菌株間的遺傳相似性是否與已知的7個生理小種相一致。因為傳統(tǒng)的病菌生理小種的劃分需要經過篩選鑒別寄主等繁瑣耗時的步驟,人們希望可以通過分子生物學的方法對病菌進行生理小種的劃分。本研究結果顯示,分子鑒定結果與鑒別寄主鑒定結果間存在一定的差異,基于分子生物學的遺傳多樣性測定方法不能作為病菌分類的惟一方法。且由于對蘋果黑星病鑒別寄主的研究較早且較為深入,通過鑒別寄主確定毒性生理小種,并以其培育抗病性蘋果品種的成